Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации
Государственные санитарно-эпидемиологические правила и нормативы
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Pseudomonas fluorescens
(denitrificans)
В 99 -
продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе
населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1004-00
Минздрав России
Москва 2001
1. Разработаны канд. биол.
наук Р. В. Бару, канд. биол. наук А. В. Лапчинской
(Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и введены в действие Главным
государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем
министра здравоохранения российской Федерации 20 декабря 2000 г.
3. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Главный
государственный санитарный врач
Российской
Федерации - Первый заместитель
Министра
здравоохранения Российской Федерации
Г. Г.
Онищенко
20 декабря
2000 г.
Дата введения: с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ
КОНТРОЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод
микробиологического измерения концентрации
клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens
(denitrificans)
В 99 - продуцента витамина В12
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1004-00
1. Общие положения и область применения
Настоящие
методические указания устанавливают методику проведения микробиологического
количественного анализа концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 -
продуцента витамина В12 атмосферном воздухе населенных мест в
диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические
указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТов 17.2.4.02-81 «Охрана
природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих
веществ» Р.8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические
указания предназначены для применения и лабораториях предприятий, организации и
учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
Методические
указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии
и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы
гигиены окружающей среды».
2.
Характеристика штамма-продуцента витамина В12
Микроорганизм
Pseudomonas fluorescens
(denitrificans) В 99
является продуцентом витамина В12. Штамм растет на агаризованных
средах на основе мелассы при температуре 28 °С. В течение 3-х суток образует
округлые колонии 1 - 2 мм белого цвета. Морфологически представляет собой
грамотрицательные подвижные палочки размером 0,45 - 0,85 х 0,6 мкм. Штамм
устойчив к следующим антибиотикам: левомицетину, линкомицину, полимиксину М,
ристомицину, цефалотину и эритромицину.
Предельно
допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл/м3.
3.
Пределы измерений
Методика
обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента витамина В12
в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 3000
клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4.
Метод измерений
Метод основан
на аспирации из воздуха клеток продуцента витамина В12 на
поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным
морфологическим признакам.
5.
Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При
выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные
устройства и материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа
воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)
|
ТУ 64-12791-77
|
Термостаты
электрические суховоздушные или водяные
|
ГОСТ 9586-75
|
Автоклав
электрический
|
|
Бокс, оборудованный
бактерицидными лампами
|
|
Холодильник бытовой
|
|
Весы лабораторные,
аналитические типа ВЛА-200
|
|
Микроскоп
биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
|
|
Лупа с увеличением х
10
|
ГОСТ 25706-83
|
Чашки Петри
бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм
|
|
Пробирки
биологические, вместимостью 20 и 35 мл
|
ГОСТ 10515-75
|
Пипетки мерные на 1,
5 и 10 мл
|
ГОСТ 10515-75
|
Пипетки мерные на 1,
5 и 10 мл
|
ГОСТ 1770-74
|
Колбы конические,
вместимостью 250 и 500 мл
|
ГОСТ 1770-74
|
Секундомер
|
ГОСТ 9586-75
|
Барометр
|
ГОСТ 24696-79
|
Марля медицинская
|
ГОСТ 9412-77
|
Вата медицинская
гигроскопическая
|
ГОСТ 25556-81
|
5.2.
Реактивы, растворы
Антибиотики:
левомицитин, линкомииин, полнмиксин М, цефалотин, эритромицин.
Спирт этиловый ректификат
|
ГОСТ 5962-67
|
Селективная
среда для штамма-продуцента
Среда:
меласса - 100 - 150 г; (NH4)2HPO4 - 1,3 г; MgS04 7H20 - 1,0 г; (NH4)2SO4 - 0,5 г; MnSO4H2O - 0,1 г; ZnSO4 7H2O - 0,1 г; агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до
1000 мл; рН - 6,8 - 7,0; стерилизация 121 °С, 30 мин.
6.
Требования безопасности
При
выполнении измерений концентрации клеток продуцента витамина В12 в
атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования.
6.1.
Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.005-88.
6.2.
Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТу 12.1.019-79 и инструкции по
эксплуатации прибора.
6.3.
«Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе
в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической
промышленности» (1977).
6.4.
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей
вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе,
оборудованном бактерицидными лампами.
7.
Требования к квалификации операторов
К выполнению
измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним
специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки
работы в области микробиологических исследований.
8.
Условия измерений
Процессы
приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных
условиях при температуре воздуха (20±5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм
рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9.
Проведение измерения
9.1.
Условия отбора проб воздуха
Для
определения продуцента витамина В12 воздух аспирируют при помощи
аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды.
Время аспирации воздуха (5 - 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации
клеток продуцента.
Аппарат
Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом.
Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку
прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор
закрывают Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора
пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и
закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают
точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2.
Выполнение анализа
Метод
предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний,
выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать
на чашке до 200 колоний продуцента.
Селективную
среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в
стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицитин, линкомицин,
цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней
бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в
стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности чашки с застывшей средой
помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки
бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора
проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 28 °С. Через 48 - 72 ч
производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости
культуру подвергают микроскопированию.
10.
Вычисление результатов измерения
Расчет
концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха
производят по формуле:
, кл/м3,
где Х - концентрация
клеток продуцента в воздухе;
N -
количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000
- коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V
- объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В
случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять
метод седиментации клеток продуцента из воздуха
непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб
воздуха может составлять до 60 мин (при определении концентрации микроорганизма
в атмосферном воздухе). При использовании этого метода применяют следующий
расчет концентрации клеток продуцента:
эмпирически
установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество
бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки
Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 см2.
Составляем
пропорцию:
на 100 см2
за 1 мин оседает 2 л воздуха
на 78,54 см2
- Х л
Х =
1,57 л/мин.
Следовательно,
на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха.
Надо
определить количество клеток в 1 м2 воздуха.
Па 1 чашку
(диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л
воздуха, за Т мин - 1,57 . Т
л.
В этом
количестве содержится N
колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м3
воздуха содержится -
.
Пример:
за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м3
воздуха содержится
= 253 клетки.
11.
Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по
форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Pseudomonas fluorescens (denitiificans) В 99 в атмосферном воздухе.
1. Дата проведения анализа___________________________________
2. Место отбора пробы_______________________________________
3. Название лаборатории_____________________________________
4. Юридический адрес организации____________________________
Результаты
микробиологического анализа
Шифр или № пробы
|
Определяемый микроорганизм
|
Концентрация, кл/м3
|
|
|
|
Ответственный
исполнитель
Научный
руководитель
1.
Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. - М., 1991.
-693с.
2.
ГОСТ 8.563-96 ГСИ. Методики выполнения измерений.
3.
ГОСТ 17.2.4.02-81 Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам
определения загрязняющих веществ - М.: Изд-во стандартов, 1981. - 3 с.