<Письмо> Департамента госконтроля качества, эффективности, безопасности лексредств и медтехники Минздрава РФ от 29.10.2001 N 291-22/144
<Об изменении к Государственной фармакопеи XI издания>
(вместе с "Изменением N 2 к статье Государственной фармакопеи XI издания "Методы микробиологического контроля лекарственных средств" (ГФ ХI, вып. 2, С. 187)")

Департамент государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники направляет к сведению и руководству изменение N 2 к статье Государственной фармакопеи XI издания "Методы микробиологического контроля лекарственных средств" (ГФ ХI, вып. 2, с. 187) и просит предусмотреть с 1 января 2002 года разделы "Микробиологическая чистота" и "Стерильность" в стандартах качества лекарственных средств, направляемых на регистрацию (перерегистрацию), в соответствии с указанным изменением.

Срок введения Изменения с 01.01.2002 г.

Примечания к таблицам 1 и 2:

- В фармакопейных статьях предприятия (ФСП) могут быть указаны в виде исключения и другие нормативы

- При обнаружении других патогенных бактерий, кроме указанных выше, считают, что качество лекарственных средств, субстанций и вспомогательного материала не соответствует требованиям по показателю "Микробиологическая чистота"

Дополнение к разделу: "Выявление и идентификация семейства Enterobacteriaceae" общей ФС "Испытание на микробиологическую чистоту" ГФXI издания, выпуск 2, стр. 197 - 198.

10 г или 10 мл испытуемого образца помещают в 100 мл среды N 11, гомогенизируют и инкубируют при температуре 32.5 +/- 2.5 град. C в течение, как правило, двух часов, но не более пяти. В случае, если лекарственное средство - суппозитории или растворы в маслах, в среду N 11 добавляют стерильный Твин-80 в количестве не более 5% и стеклянные бусы для эмульгирования.

Гомогенат перемешивают и готовят разведения 1:10 и 1:100, используя для этого среду N 3. В три пробирки с 10 мл среды N 3 вносят 1 мл гомогената в первую, 1 мл разведения 1:10 во вторую и 1 мл разведения 1:100 в третью, то есть соответственно 0.1 г, 0.01 г, 0.001 г образца. Посевы инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 24 - 48 ч. При наличии роста делают пересев петлей на плотную среду N 4 (агар Эндо) и инкубируют чашки Петри при той же температуре в течение 18 - 24 ч. В случае появления характерных для Enterobacteriaceae колоний грамотрицательных палочек определяют количество энтеробактерий в 1 г или в 1 мл образца по Таблице 3.

Количество клеток E.coli в 1 г (мл) исследуемого лекарственного средства определяют, пользуясь также данной таблицей.

10 г (мл) образца лекарственного средства вносят в 100 мл питательной среды N 11 (лактозный бульон). В случае, если лекарственное средство - жидкость, количество среды уменьшают до 90 мл. Инкубируют при температуре (32.5+2.5) град. С в течение 2 - 5 ч. 10 мл среды N 11 переносят в 100 мл среды N 3, перемешивают и инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 18 - 24 ч. При отсутствии роста на среде N 3 (среда прозрачная, цвет не изменился) считают, что в лекарственном средстве не содержатся бактерии сем. Enterobacteriaceae. При наличии роста испытания продолжают.

2.2.1. ИСПЫТАНИЕ НА E.coli

Со среды N 3 делают пересев петлей на среду N 4 (агар Эндо) и инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. C в течение 18 - 24 ч. На среде N 4 E.coli образуют, как правило, характерные малиновые колонии с металлическим блеском или без него, диаметром 2 - 4 мм. Подозрительные на принадлежность к E.coli колонии микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на скошенную в пробирках среду N 1 и инкубируют при температуре (32,5 +/- 2.5) град. С в течение 18 - 24 ч. Из пробирок с чистой культурой делают пересевы на среды N 14 (агар Симмонса) и N 15 (бульон Хоттингера), а также используют для теста на цитохромоксидазу. Через 18 - 24 ч инкубации при (32,5 +/- 2.5) град. С отмечают бактериальный рост или его отсутствие на средах N 14 и N 15. Утилизацию цитрата устанавливают по изменению цвета среды N 14 из зеленого в синий. Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности среды N 15 при добавлении реактива Ковача или Эрлиха.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминировано Escherichia coli.

2.2.2. ИСПЫТАНИЕ НА ВИДЫ Salmonella

1 мл обогащенной культуры на среде N 3 вносят в пробирку с 10 мл среды N 12 (селенитовая среда) и инкубируют при (32,5 +/- 2,5) град. С в течение 16 - 18 ч. Делают пересев петлей на среду N 5 (висмут-сульфит агар) и инкубируют при температуре (32,5 +/- 2.5) град. С в течение 24 - 48 часов. На среде N 5 Salmonella образует, как правило, типичные черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Подозрительные на принадлежность к Salmonella колонии микроскопируют и при обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на среду N 13 (трехсахарный агар с солями железа), нанося большое количество культуры петлей сначала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик. Параллельно ставят тест на цитохромоксидазу, используя чистую культуру со среды N 1. Через 18 - 24 часа инкубации при (32,5 +/- 2.5) град. С отмечают изменение цвета среды из красного в желтый только в столбике питательной среды. Почернение среды свидетельствует об образовании сероводорода - типичном признаке видов Salmonella.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано Salmonella.

2. Среда N 12 (селенитовая среда сухая) - для накопления и выделения сальмонелл.

Готовят согласно прописи на этикетке.

______________________________________________________________

Рн после стерилизации 7.3 +/- 0.2. Разливают в пробирки по 5 - 7 мл. Стерилизуют при 121 град. С 15 мин. При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2 - 2,5 см.

Приготовление: агар расплавляют при нагревании в свежеприготовленной дистиллированной воде. Все соли сначала растворяют в небольшом объеме воды, затем раствор добавляют к расплавленному агару и доводят водой до 1000 мл. Устанавливают рН, добавляют индикатор в виде 0,2% водного раствора в объеме 40 мл, хорошо перемешивают и разливают в пробирки по 5 - 7 мл. Стерилизуют при 121 град. С 15 мин. При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2 - 2,5 см.

5. Среда N 15 (бульон Хоттингера) - для определения индола.

Примечание: <*> - для испытания на микробиологическую чистоту можно использовать аналогичные сухие питательные среды отечественных и зарубежных производителей после их валидации.

Тест на индол

В пробирку со средой N 15, в которой выросла исследуемая культура, вносят 0,5 мл реактива Ковача или Эрлиха и слегка встряхивают. При наличии индола наблюдают появление красного кольца на поверхности среды в пробирке.

Навеску альдегида растворяют в спирте при легком нагревании (в водяной бане при 50 - 55 град. С), остужают и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте. Реактив должен быть желтого цвета.

Навеску альдегида растворяют в спирте и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте.

Лекарственные средства, обладающие антимикробным действием, могут подавлять рост отдельных видов бактерий и грибов. Если исследуемое лекарственное средство оказывает ингибирующее действие на микроорганизмы, которые выявляют в нестерильных лекарственных средствах, необходимо адекватно инактивировать его во избежание неправильной оценки результатов испытания на микробиологическую чистоту. Определение антимикробного действия нестерильных лекарственных средств проводят с использованием тест-микроорганизмов, полученных из Государственных коллекций.

Тест-штаммы В. cereus, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus получают из Государственной Коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Штамм C.albicans получают из Российского Микологического Центра (г. Санкт-Петербург), штамм A.niger - из ВКМ - Всероссийской Коллекции микроорганизмов РАН (г. Москва). Культуры тест-микроорганизмов могут быть получены также из ВКПМ - Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов. Используемые тест-штаммы должны быть типичными по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам.

Тест-культуру C.albicans хранят под слоем вазелинового масла на среде N 2 (агар Сабуро), в которой количество агара уменьшено до 1%. Тест-культуру A.niger хранят на среде N 2 (агар Сабуро) (Госфармакопея, вып. 2, с. 200), делая пересевы через каждые 3 месяца. Лиофилизированную культуру тест-штамма из ампулы или культуру со среды хранения переносят в пробирки с питательным бульоном: среда N 8 для бактерий, жидкая среда Сабуро - для C.albicans. Посевы на среде N 8 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течении 18 - 24 ч, посевы на жидкой среде Сабуро - при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С в течение 48 ч - для C.albicans. Посевы A.niger на среде N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С до появления черных или темно-коричневых экзогенных спор (конидий) в течении 5 - 7 сут.

Перед определением антимикробного действия нестерильных лекарственных средств культуры тест-штаммов бактерий отсевают на среду N 8 (питательный бульон) и инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 18 - 24 ч.

Культуры грибов выращивают заранее: C.albicans - на жидкой среде Сабуро за 48 ч, а A.niger - на среде N 2 за 5 - 7 сут до начала определения.

(Государственная фармакопея XI издания, выпуск 2, с. 193, 201, 208 - 209)

Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном, рН 7.0

Готовят разведения лекарственного средства 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500, используя фосфатный буферный раствор (для приготовления эмульсий в раствор добавляют не более 5% Твина-80).

Бульонные культуры бактерий и C.albicans разводят фосфатным буферным раствором не менее, чем 1:1000. Культуру A.niger смывают со скошенного агара фосфатным буферным раствором с 0.05% Твина-80. Определяют количество конидий в 1 мл смыва, используя камеру Горяева или чашечный агаровый метод, и разводят до концентрации 10³ - 10⁴ КОЕ/мл.

Испытание проводят представленными в 3.3.1 и 3.3.2 методами определения антимикробного действия.

3.3.1. МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА ГОСФАРМАКОПЕИ XI

Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в чашки Петри диаметром 90 мм, в одни из которых добавляют по 0.2 мл взвеси культуры B.cereus, а в оставшиеся - по 0.2 мл культуры C.albicans и A.niger. В чашки с B.cereus вносят по 7 - 10 мл расплавленной среды N 1 при температуре (47.5 +/- 2.5) град. С, в чашки с культурами C.albicans и A.niger - то же количество среды N 2.

Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в пробирки с 10 мл жидкой среды - N 3 и N 8. В пробирки со средой N 3 добавляют по 1 мл взвеси культуры E.coli, в пробирки со средой N 8 - по 1 мл взвеси культур P.aeruginosa и S.aureus, каждую отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведений лекарственного средства вносят такое же количество буферного раствора.

Посевы на средах N 1, 3, 8 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 2 сут (среды N 3, 8) и 5 сут (среда N 1). Посевы на среде N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/-2.5) град. C в течение 5 сут. В случае, если при внесении лекарственного средства в жидкие питательные среды (N 3, N 8) образуется помутнение, препятствующее учету результатов, делают пересев со среды N 3 на среду N 4 (агар Эндо), а со среды N 8 - на среды N 9 и N 10. При росте типичных колоний E.coli (среда N 4), P.aeruginosa (среда N 9) и S.aureus (среда N 10) отмечают наличие роста тест-микроорганизма.

3.3.2. МЕТОД РЕПЛИКАЦИЙ (для водонерастворимых лекарственных средств). В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемого лекарственного средства. В контрольные чашки вносят по 1 мл растворителя, который используют для получения разведения. В чашки Петри (как в эксперименте, так и в контроле) добавляют по 15 - 20 мл расплавленной и охлажденной до (47.5 +/- 2,5) град. С среды N 1, в другие - такое же количество среды N 2 и быстро перемешивают. После застывания агара чашки подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды.

На поверхность агара бактериологической петлей или репликатором наносят бляшками инокулят каждого тест-штамма бактерий и грибов на среды N 1 и N 2 соответственно.

Чашки со средой N 1 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 48 ч. Чашки со средой N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С в течение - 3 - 5 сут.

Учет результатов. После окончания сроков инкубации посевов (появление типичного роста тест-микроорганизмов в контрольных чашках без лекарственного средства) отмечают наличие или отсутствие роста тест-штаммов бактерий и грибов на средах, в которые вносили различные разведения лекарственного средства.

Наличие такого же роста тест-микроорганизма, как в контроле, обозначают знаком "+", отсутствие роста - знаком "-", слабый или замедленный рост - знаком "+/-".

Отсутствие роста тест-микроорганизма на среде с препаратом свидетельствует о том, что исследуемый препарат в данном разведении обладает антимикробным действием в отношении определенного тест-микроорганизма.

3.3.3. НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ

Для устранения антимикробного действия лекарственного средства используют различные методы: - 1) увеличивают разведение лекарственного средства, 2) добавляют необходимое количество соответствующего специфического инактиватора, нейтрализующего антимикробное действие лекарственного средства, но не угнетающего рост микроорганизмов-контаминантов (например, бета-лактамазу - для пенициллинов и цефалоспоринов, пара-аминобензойную кислоту - для сульфаниламидов), 3) применяют неспецифический инактиватор следующего состава, используемого в качестве растворителя:

Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин. Если антимикробное действие полностью не устраняется, увеличивают концентрацию Твина-80 или лецитина.