"Инструкция о порядке расследования и учета пищевых отравлений"
(утв. Минздравом СССР 25.07.1961 N 373-61)
(вместе с "Методикой бактериологических исследований при пищевых отравлениях")

С целью установления причины и принятия необходимых мер по ликвидации пищевого отравления, а также разработки мероприятий по профилактике пищевых отравлений каждый случай пищевого отравления подлежит обязательному тщательному расследованию и учету.

1. Расследование пищевых отравлений должен производить санитарный врач по гигиене питания или главный врач санитарно-эпидемиологической станции или другие специалисты по поручению последнего, немедленно по получении извещения; в сельских районах с объединенными учреждениями здравоохранения расследование производит заместитель главного врача района по санитарно-эпидемиологическим вопросам.

Примечание. Расследование пищевых отравлений, происшедших в полосе отвода железнодорожного транспорта или на предприятиях, принадлежащих этому ведомству, производится санитарными врачами линейных и дорожных санитарно-эпидемиологических станций.

В случае, когда продукт, вызвавший отравление, изготовлен на предприятиях, не принадлежащих железнодорожному транспорту, - территориальная санитарно-эпидемиологическая станция должна принять участие в расследовании пищевого отравления и в организации необходимых оперативных мер по ликвидации заболеваний.

2. До прибытия санитарного врача врач, а там, где нет врача, средний медицинский работник, оказавший первую помощь пострадавшим и установивший или заподозривший пищевое отравление, обязан:

а) изъять из употребления остатки подозреваемой пищи;

б) собрать рвотные и каловые массы заболевших, промывные воды и мочу; взять кровь для посева на гемокультуру (при показаниях - обязательно только для врача).

Примечание. В лечебных учреждениях, в первую очередь на станциях скорой помощи, а также в больницах, поликлиниках и т.д. должен иметься необходимый запас стеклянной стерильной посуды. В случае отсутствия стерильной посуды чисто вымытая стеклянная посуда должна быть прокипячена в воде перед заполнением;

в) направить изъятую пищу, собранные выделения и промывные воды на исследование в санитарно-бактериологическую лабораторию или сохранить их на холоде до прибытия санитарного врача;

г) впредь до выяснения всех обстоятельств запретить реализацию подозреваемых пищевых продуктов;

д) немедленно известить о пищевом отравлении по телефону, телеграфу или с нарочным местную санитарно-эпидемиологическую станцию (санитарно-эпидемиологический отдел районной больницы).

3. Санитарный врач при расследовании пищевого отравления должен придерживаться следующего порядка работы:

а) установить связь с медицинским работником, оказавшим первую медицинскую помощь заболевшим;

б) опросить лично больных (при массовом отравлении выборочно);

в) установить связь с лабораторией; проверять правильность сбора рвотных и каловых масс, промывных вод, остатков несъеденной пищи заболевших;

г) обследовать пищевой объект, где произошло отравление, базу, с которой поступил подозреваемый продукт, и пищевое предприятие, на котором он вырабатывался, если они находятся в одном и том же населенном пункте.

Если пищевой продукт, явившийся причиной пищевого отравления, изготовлен и поступил из другого населенного пункта, района, города, то сообщить об этом следует соответствующей санитарно-эпидемиологической станции или санитарно-эпидемиологическому отделению объединенной районной больницы. Последние обязаны произвести срочное обследование базы, с которой был отправлен подозреваемый продукт, и предприятия, на котором он был выработан, и результаты обследования сообщить санитарно-эпидемиологической станции или объединенной больнице по месту возникших заболеваний.

Примечание. Реализация подозреваемого продукта должна быть немедленно запрещена на любом этапе расследования и месте нахождения продукта;

д) привлечь в необходимых случаях к участию в расследовании и ликвидации отравлений наиболее квалифицированных отраслевых санитарных работников (по коммунальной, промышленной, школьной гигиене), эпидемиологов, сотрудников санитарно-гигиенических институтов, гигиенических кафедр, клиницистов, токсикологов, работников ветеринарной службы и др. При наличии на предприятии ведомственного санитарного работника, последний обязательно должен участвовать в расследовании.

4. Установив связь с медицинским работником, оказавшим первую помощь, санитарный врач должен выяснить у него время и обстоятельства начала вспышки, количество заболевших, время инкубации, основные симптомы заболевания, ход госпитализации, обеспеченность койками, заполнение историй болезни и принятые меры (запрещение реализации подозреваемого продукта и др.).

5. При опросе больных санитарный врач должен (см. схему опроса - приложение 1):

а) выяснить, чем питались пострадавшие в течение последних 2 суток до начала заболевания;

б) установить, имеются ли заболевания среди членов семей пострадавших, чем и где они питались;

в) выявить путем сопоставления полученных данных продукты, которые употреблялись в пищу всеми заболевшими и могут быть заподозрены как причина отравления;

г) установить время, прошедшее с момента употребления подозреваемого продукта до появления первых признаков заболевания.

6. Санитарный врач должен:

а) тщательно проанализировать с участием лечащих врачей всю клиническую картину заболевания с учетом первичных симптомов, дальнейшего течения и исхода. При этом необходимо исключить заболевания иной этиологии, напоминающие по отдельным признакам пищевое отравление (катар или язва желудка, воспаление желчного пузыря, почечные и печеночные колики, обострение хронического энтероколита и др.), а также погрешности в организации питания;

б) проверить, правильно ли отобраны медицинским работником, оказавшим первую медицинскую помощь пострадавшим, необходимые материалы для лабораторных исследований и направить, если это еще не сделано, на исследование в лабораторию подозреваемые продукты, собранные у заболевших выделения: кал и рвотные массы, мочу, а также промывные воды и смывы с оборудования, инвентаря и др. (последние при подозрении на бактериальную этиологию отравления);

в) обеспечить взятие и отсылку в лабораторию крови заболевших для посева и серологических реакций.

7. Для отбора проб, подлежащих лабораторному исследованию, санитарный врач должен вызвать работника лаборатории со стерильной посудой. При невозможности вызвать работника лаборатории санитарный врач лично производит выемку проб для исследования. Собранные материалы должны быть направлены нарочным в наиболее квалифицированную санитарно-бактериологическую лабораторию (приложение 2).

Скоропортящиеся продукты, направляемые в иногороднюю лабораторию, должны доставляться охлажденными (во льду).

Примечание. При явной картине бактериального отравления не следует посылать в лабораторию пищевые продукты для исследования на соли тяжелых металлов и для других химических исследований или направлять на бактериологическое исследование продукты, не являющиеся по своей природе благоприятной средой для развития микробов, вызывающих бактериальные отравления (мука, крупа, варенье, сахар, соль и др.).

8. При подозрении на бактериальную этиологию пищевого отравления в лаборатории санитарно-эпидемиологической станции, больницы производятся бактериологические исследования (см. методику бактериологических исследований при пищевых отравлениях), в том числе посев крови (в остром периоде) и серологические реакции с кровью переболевших. Серологические реакции ставятся на 1 - 3-й день заболевания и на 7 - 10-й день или на 7 - 10-й день и повторно на 15 - 20-й день.

При большом количестве пострадавших серологическому исследованию подвергается кровь у наиболее тяжело переболевших, рекомендуется не менее чем у 10 - 15 человек, а при небольшом числе пострадавших - по возможности кровь всех переболевших.

В случае летальных исходов принимаются во внимание результаты патологоанатомического вскрытия и производится лабораторное исследование (бактериологическое, химическое) трупного материала: паренхиматозных органов, содержимого желудка и кишечника, крови из сердца.

9. Для выяснения путей инфицирования или загрязнения ядовитыми веществами пищевого продукта, послужившего причиной отравления, необходимо проверить санитарные условия технологического процесса производства заподозренных пищевых продуктов, условия перевозки, сроки хранения и реализации сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, наличие сертификатов, ветеринарно-санитарных удостоверений, возможности инфицирования продукта бактерионосителями, больными гнойничковыми, кишечными заболеваниями и т.д.

Примечание. Если пищевое отравление произошло от употребления в пищу консервов, то в акте расследования должны быть указаны: маркировка, обозначенная на крышке и донышке жестяной банки или на бумажной этикетке стеклянной тары, а также название завода и его местонахождение.

10. В процессе расследования санитарный врач принимает, в соответствии с действующим положением о государственном санитарном надзоре, необходимые оперативные меры:

а) запрещает использование или в необходимых случаях устанавливает порядок реализации пищевых продуктов, послуживших причиной отравления;

б) немедленно отстраняет от работы или переводит на работу, не связанную с переработкой, хранением и транспортировкой пищевых продуктов, лиц, которые могли быть источником инфицирования пищевых продуктов;

в) предлагает и контролирует проведение необходимых санитарных мероприятий: временное или постоянное запрещение эксплуатации, дезинфекция, ремонт пищевого предприятия, санитарные нарушения в котором послужили причиной выработки недоброкачественного продукта;

г) лиц, виновных в производстве, выпуске или реализации вызвавшего пищевое отравление продукта, привлекает к административной ответственности или передает материалы расследования прокуратуре для привлечения к уголовной ответственности.

11. По окончании санитарно-эпидемиологического расследования санитарный врач составляет акт, в котором должен детально изложить собранный согласно пунктам 4 - 9 настоящей инструкции материал и на основании сопоставления всех полученных при расследовании данных и результатов лабораторных исследований дать заключение о характере и причине заболевания (см. приложение 3).

Акт отсылается в вышестоящую инстанцию государственного санитарного надзора. Последняя должна с ним немедленно ознакомиться и в случае наличия в нем упущений, неточностей и т.п. сообщить свои замечания и требования не позднее следующего дня санитарно-эпидемиологической станции (санитарно-эпидемиологическому отделу больницы), откуда получен материал; последняя должна представить необходимые дополнительные материалы в срок не более 7 дней.

12. Республиканские, краевые, областные, городские (городов республиканского подчинения) санитарно-эпидемиологические станции по получении всех материалов о пищевом отравлении должны не более чем в 3-дневный срок направить их главному государственному санитарному инспектору союзной республики.

Главные государственные санитарные инспекторы союзных республик представляют в Государственную санитарную инспекцию СССР заключительное донесение с приведением данных расследования и окончательного заключения в 3-дневный срок со дня получения.

При возникновении пищевых отравлений с числом пострадавших 5 и менее, связанных с неправильным хранением, обработкой скоропортящихся продуктов и др. в домашних условиях, с легким течением заболевания, акты расследования не направляются в областную, краевую санитарно-эпидемиологическую станцию, главным государственным санитарным инспекторам АССР союзной республики и СССР.

Примечание. Этот порядок не распространяется на случаи, когда подозревается ботулизм, и единичные пищевые отравления в домашнем быту с летальным исходом.

Вместо этого в конъюнктурном обзоре к отчету по форме N 36 должен представляться анализ всех случаев пищевых отравлений в домашнем быту (отдельно от случаев в организованном питании) с составлением таблиц согласно приложению 6 (см. пункт 20).

В анализ бытовых пищевых отравлений не следует включать неподтвердившиеся случаи, когда предварительный диагноз пищевого отравления был поставлен лечащим врачом лишь по клинической симптоматологии.

13. Если при расследовании пищевое отравление не подтвердилось, об этом немедленно должны быть поставлены в известность вышестоящие инстанции государственного санитарного надзора.

14. Учет пищевых отравлений осуществляется на основании:

а) экстренных извещений о случаях пищевых отравлений;

б) актов и дополнительных материалов расследования (пункты 11 и 12);

в) отчетов о пищевых отравлениях.

15. Врач или при отсутствии его средний медицинский работник, оказавший первую медицинскую помощь заболевшим, установивший или заподозривший пищевое отравление, обязан послать немедленно извещение по прилагаемой форме (приложение 4) в районную (городскую) санитарно-эпидемиологическую станцию или объединенную районную больницу.

Извещение посылается по телеграфу (на близком расстоянии с нарочным) тотчас по установлении предварительного диагноза и получении сведений, дающих основание подозревать пищевое отравление, но не позднее 24 часов с момента обнаружения отравления.

Если имеется возможность, то следует предварительно сообщить по телефону.

16. Районная, городская (городов областного, краевого подчинения) санитарно-эпидемиологическая станция или объединенная районная больница по получении сообщения о пищевом отравлении обязана немедленно сообщить об этом по телеграфу или телефону (по той же форме) в вышестоящую инстанцию государственного санитарного надзора, городские (городов республиканского подчинения), областные, краевые, республиканские санитарно-эпидемиологические станции должны по получении извещения сообщить тем же путем главному государственному санитарному инспектору республики и принять, если нужно, соответствующие меры (посылка специалистов, дача указаний и т.д.).

Главный государственный санитарный инспектор союзной республики извещает Государственную санитарную инспекцию СССР телеграммой или телефонограммой не позднее 24 часов с момента получения сведений, дающих основание подозревать пищевое отравление.

Примечание. Извещения о пищевых отравлениях в домашнем быту с числом пострадавших 5 и менее и нетяжелым течением заболевания, республиканским, краевым, областным, городским (городов республиканского подчинения) санитарно-эпидемиологическим станциям, главным государственным санитарным инспекторам союзной республики и СССР не направляются.

17. Районная (городская) санитарно-эпидемиологическая станция, объединенная районная больница по получении извещения о пищевом отравлении проводят расследование согласно пунктам 3 - 9 и составляют акт согласно пункту 11 настоящей инструкции.

18. Каждый случай пищевого отравления, подтвержденный расследованием, подлежит строгому учету.

19. Регистрация производится в специальных журналах (приложение 5), прошнурованных, пронумерованных и скрепленных печатью, хранящихся в санитарно-эпидемиологических станциях, объединенных районных больницах.

Примечание. Районные, городские санитарно-эпидемиологические станции и санитарно-эпидемиологические отделении больниц и журнал регистрации пищевых отравлений вносит также все случаи пищевых отравлений в домашних условиях (см. пункт 12).

20. Районные (городские) санитарно-эпидемиологические станции, санитарно-эпидемиологические отделения объединенных районных больниц составляют годовой отчет о пищевых отравлениях и включают его в соответствующий раздел отчета по форме N 36. В текстовой части отчета дается анализ пищевых отравлений за отчетный год, характеризующий имевшие место случаи пищевых отравлений, с указанием состояния на конец отчетного периода предприятий, где имели место пищевые отравления, результатов переданных в прокуратуру дел на лиц, виновных в допущении пищевых отравлений, и других санкции, примененных органами государственного санитарного надзора. Анализ всех пищевых отравлений, происшедших в домашних условиях, дается отдельно от пищевых отравлений, связанных с продукцией государственных и кооперативных предприятий, общественного питания, торговли и пищевой промышленности с составлением таблиц согласно приложению 6.

21. Санитарно-эпидемиологические станции автономных республик, краев, областей и городов республиканского подчинения составляют сводные отчеты по той же схеме, а также включают их в отчеты по форме N 36.

22. Главный государственный санитарный инспектор союзной республики составляет сводный цифровой и текстовой отчеты и анализ пищевых отравлений по республике за отчетный год и включает их в представляемый Государственной санитарной инспекции СССР отчет о работе по форме N 36.

23. На основании представленных органами государственного санитарного надзора союзных республик донесении и материалов расследования массовых, групповых и семейных (частично - см. пункт 12) и отчетов о пищевых отравлениях (по форме 36 - см. пункт 20 и приложение 6) Государственная санитарная инспекция СССР составляет анализ пищевых отравлений по СССР за год.

Инструкция о порядке расследования и учета пищевых отравлений, утвержденная главным государственным санитарным инспектором СССР 22 марта 1946 г., с изданием настоящей инструкции утрачивает силу.

1. Фамилия, имя, отчество.

2. Возраст.

3. Место работы.

4. Чем и где питался пострадавший в течение последних двух суток.

5. Имеются ли заболевания среди членов семьи, чем и где они питались.

6. Дата, время начала заболевания.

7. Клинические симптомы заболевания: повышение температуры, озноб, судороги, цианоз, головная боль, боль в конечностях, боль в животе (их характер), тошнота, рвота, понос (их повторность), состояние сердечной деятельности и др. (см. приложение 1а).

8. Какой продукт, блюдо подозревается (см. приложение 1б).

9. Место, время приема в пищу подозреваемого продукта.

10. Длительность периода (инкубация) от приема в пищу подозреваемого продукта до начала заболевания.

Примечание. Результаты опроса отмечаются знаком плюс (+) или минус (-).

Примечание. Результаты опроса отмечаются знаком плюс (+) или минус (-).

1. Для лабораторного исследования посылаются следующие материалы:

а) остатки подозреваемой пищи, полуфабрикаты и исходное сырье;

б) рвотные массы, промывные воды, испражнения, моча, кровь пострадавших;

в) смывы с оборудования, инвентаря (разделочные доски, столы, моечные ванны и др.), а также рук работающих.

Примечание. На исследование посылаются те материалы, которые по предварительным данным санитарно-эпидемиологического расследования подозреваются в наибольшей причинной связи с происшедшим отравлением.

2. Пробы для бактериологического анализа отбираются с соблюдением общепринятых правил в отношении стерильности (см. "Методику бактериологических исследований при пищевых отравлениях").

3. Твердые объекты могут пересылаться завернутыми в несколько слоев вощаной или пергаментной бумаги, а за отсутствием их - в чистой оберточной бумаге.

4. Для исследования мяса и мясных изделий отбирают около 500 г продукта из различных мест. Солонину и соленые продукты, находящиеся в боченочной таре, берут сверху, из середины и со дна бочки. В отдельную посуду набирают 100 - 200 мл рассола.

Пробы рыбы отбирают в количестве нескольких экземпляров. От крупной рыбы берут звенья из 2 - 3 мест.

5. Пробы жидких и полужидких объектов забирают после тщательного перемешивания в количестве около 200 мл. Вторые блюда отбирают в количестве 1 - 2 порции.

6. При исследовании консервов отбирают все вскрытые банки как с остатками, так и пустые. В случае отсутствия вскрытых банок забирают невскрытые банки консервов той же смены и даты выработки, в первую очередь той же автоклавоварки; бомбажные банки также отбираются в первую очередь.

7. Фекальные и рвотные массы берут от каждого больного в количестве 50 - 100 г; промывные воды - 100 - 200 мл; кровь для посева и серологических исследований берется в количестве 8 - 10 мл.

8. На пробы накладывают этикетки, пробы нумеруют, опечатывают сургучной печатью или пломбируют и упаковывают так, чтобы гарантировать целость материала, исключить возможность обсеменения или распространения инфекции. На каждой банке должна быть сделана наклейка с надписью: рвотные массы первичные или повторные, промывные воды первичные или повторные и др., фамилия, имя, отчество больного, дата взятия пробы.

Пересылка проб должна производиться в кратчайший срок.

9. К пробам, посылаемым в лабораторию для исследования, должен быть приложен сопроводительный документ, в котором необходимо указать следующие сведения:

а) наименование предприятия или учреждения, где произведены выемки проб, его адрес, перечень проб с указанием их веса, характера тары и упаковки (стерильность посуды, наличие печатей, охлаждение и т.д.), дата и час выемки и отправления в лабораторию;

б) основные данные санитарно-эпидемиологического расследования: дата пищевого отравления, срок появления симптомов заболевания после приема подозреваемой пищи, описание клинических явлений у заболевших (температура, озноб, тошнота, рвота, понос, боли в животе, головная боль, общая слабость, боли в мышцах, суставах, цианоз, ослабление сердечной деятельности, явления со стороны центральной нервной системы, потеря сознания и др.), число пострадавших, госпитализированных, наличие случаев со смертельным исходом, предварительный диагноз;

в) при направлении нескольких пищевых продуктов для исследования необходимо указать, какой пищевой продукт подозревается как причина пищевого отравления;

г) цель исследования;

д) должность и подпись произведшего выемки и направившего пробы.

При приеме проб лаборатория должна выдать расписку и указать время получения их.

10. Исследование материалов, доставленных в лабораторию по поводу случая пищевого отравления, производится немедленно по их получении (см. "Методику бактериологических исследований при пищевых отравлениях").

1. Необходимо указать место работы, фамилию и должность санитарного врача, составляющего акт, дату составления акта, кто участвовал в расследовании пищевого отравления.

2. Подробно описать начало заболевания, его дату, число поступивших больных на протяжении первых 3 - 4 часов и затем в последующие часы и дни; указать, не было ли аналогичных заболеваний в предшествовавшие дни, клиническую картину с указанием температуры, явлений со стороны желудочно-кишечного тракта (тошнота, рвота - их повторность, боли в животе, понос), наличие головной боли, озноба, судорог, общей слабости, боли в мышцах, суставах, цианоза, явлений ослабления сердечной деятельности, явлений со стороны центральной нервной системы (потеря сознания и др.), тяжесть заболевания и предварительный диагноз, общее число употреблявших в пищу подозреваемый продукт и число пострадавших с приложением поименного списка заболевших, госпитализированных, умерших с указанием возраста, а также обстоятельства, связанные с возникновением пищевого отравления.

Указать, какие материалы получены от заболевших (промывные воды, рвотные, каловые массы, кровь и др.), от кого и куда направлены для лабораторного исследования.

Указать также, какой материал взят при вскрытии трупов (внутренние органы, содержимое желудка и др.) и куда направлен для исследования.

3. Указать место потребления пищи или приобретения пищевого продукта; описать подробно меню пострадавших за последние 48 часов до отравления, указав также меню не пострадавших, но питавшихся одновременно с пострадавшими в той же столовой (буфете и т.д.), указать, через сколько времени после приема подозреваемой пищи появились симптомы заболевания, указать, какой пищевой продукт подозревается как причина отравления и на основании каких данных.

Отразить оценку заболевшими органолептических свойств пищевого продукта, явившегося причиной заболевания: запах, вкус, температура и т.п., а также количество (приблизительный вес) съеденного продукта.

4. Указать, когда и откуда получен подозреваемый продукт или сырье для изготовления этого продукта, наличие сертификатов, ветеринарного удостоверения, дать санитарную характеристику продукта в момент расследования.

5. Дать краткое описание санитарного состояния пищевого предприятия, изготовившего продукт, подозреваемый как причина пищевого отравления. Подробно описать технологический процесс, санитарные условия изготовления этого продукта, а также условия его хранения, реализации. Описать условия транспортировки и хранения сырья.

Примечание. Подробный акт санитарного обследования пищевого объекта, на котором произошло пищевое отравление или на котором изготовлен подозреваемый пищевой продукт, прилагается к акту расследования пищевого отравления.

6. Указать, какие продукты задержаны, изъяты или уничтожены, когда, куда и какие продукты или другие объекты исследования направлялись для лабораторного анализа.

7. Указать результаты химического, бактериологического, серологического, биологического и патологоанатомического исследования всех материалов.

8. Дать обоснованные выводы, подтверждающие, что в указанном случае действительно имеется пищевое отравление. В выводах указать, какой пищевой продукт явился причиной отравления, какой микроб или химический яд, причину, обусловившую возникновение отравления (недоброкачественное сырье, нарушение правил транспортировки, хранения, переработки, реализации и т.д.). Если причина пищевого отравления не установлена, то указать, какой продукт подозревается.

9. Указать принятые органами и учреждениями государственного санитарного надзора оперативные меры по ликвидации заболеваний, по профилактике подобных заболеваний в дальнейшем, а также санкции.

1. Населенный пункт.

2. Дата пищевого отравления.

3. Место потребления пищи (указать номер столовой, пищеблок какого учреждения, название предприятия, его ведомственную принадлежность).

4. Число пострадавших, из них детей до 14 лет. Число госпитализированных.

5. Тяжесть заболевания.

6. Количество летальных случаев.

7. Подозреваемый продукт.

8. Предполагаемая причина, обусловившая возникновение отравления.

9. Принятые меры.

--------------------------------

<1> В том числе детей; число детей до 14 лет указывается в скобках.

Ввиду того, что извещения и материалы расследования о части пищевых отравлений в домашних условиях органам государственного санитарного надзора области, края, АССР, союзных республик и Государственной санитарной инспекции СССР не направляются (см. пункты 12 и 16 инструкции), представляемый санитарно-эпидемиологическими станциями, санитарно-эпидемиологическими отделами больниц и органами государственного санитарного надзора автономных и союзных республик годовой отчет о пищевых отравлениях (по форме N 36) должен содержать в текстовой части наряду с общим анализом и разбором массовых и групповых пищевых отравлений сводные данные с анализом всех случаев пищевых отравлений, имевших место в течение года в домашних условиях, с указанием числа заболевших, этиологии, пищевых продуктов, санитарных нарушений, вызвавших пищевые отравления, результатов лабораторных исследований и принятых мер к ликвидации и профилактике пищевых отравлений в домашних условиях. Указанный материал должен содержать данные по следующим схемам (табл. 1 и 2).

--------------------------------

<1> Методика бактериологических исследований при пищевых отравлениях, утвержденная главным государственным санитарным инспектором СССР 12 мая 1948 г., с изданием настоящей инструкции утрачивает силу.

Методика бактериологических исследований при пищевых отравлениях была переиздана Всесоюзной государственной санитарной инспекцией более 10 лет назад - в 1948 г.

За этот период наука о микроорганизмах далеко шагнула вперед, опубликовано много новых данных по теоретическим и практическим вопросам микробиологии и, в частности, связанных с микробами, которые являются причиной пищевых отравлений.

Настоящая методика составлена с учетом современных данных, она значительно расширена и переработана.

В отношении бактерий группы кишечной палочки исключено определение коли-титра, которое характеризует санитарное состояние анализируемого объекта. Включено определение серологической типизации бактерий группы кишечной палочки и установление их роли в пищевом отравлении.

Включен раздел, посвященный диагностике пищевых отравлений, связанных с Cl. perfringens.

Настоящая методика имеет целью унифицировать исследования, которые необходимо проводить при установлении этиологии пищевого отравления и при изучении свойств выделенного возбудителя.

Нередко при расследовании возникшего пищевого отравления представляется необходимым изучить санитарную обстановку, в которой произошло отравление (столовая, буфет и т.п.), предприятия, откуда было получено сырье и полуфабрикаты (мясокомбинаты, молочные заводы, фабрики-кухни и т.д.), а также в торговой сети. Для этого проводятся определения общего количества микробов, а также установление коли-титра, которые рекомендуется проводить по инструкции "Методика санитарно-бактериологического контроля на предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами", утвержденной в 1956 г. Государственной санитарной инспекцией СССР.

Данная методика составлена коллективами ряда учреждений: Института питания АМН СССР, Института эпидемиологии и микробиологии имени Гамалеи АМН СССР, Московского научно-исследовательского института гигиены имени Ф.Ф. Эрисмана, Московской городской санитарно-эпидемиологической станции, Научно-исследовательского института мясной промышленности (см. содержание).

Подготовка и редактирование настоящего издания осуществлены Институтом питания АМН СССР (Ю.И. Рубинштейн) и Государственной санитарной инспекцией СССР (М.Г. Шевченко).

Бактериологическому исследованию подвергается следующий материал:

а) остатки пищи, употребленной заболевшими, а также исходные продукты и полуфабрикаты, которые служили для его приготовления;

б) рвотные массы, промывные воды, испражнения и моча пострадавших;

в) смывы и соскобы с инвентаря, оборудования и тары, смывы с рук, а также слизь из зева и носа персонала, занятого изготовлением пищи;

г) при летальных исходах заболевания - содержимое желудка, отрезок тонкого и толстого кишечника, паренхиматозные органы (печень, селезенка), кровь из сердца, пробы от каждого органа берут в отдельные банки с притертыми пробками; на банке обязательно делают надпись с обозначением взятого органа.

Если клиническая картина у заболевших соответствует пищевой токсикоинфекции, обусловленной бактериями группы салмонелл, дизентерийной группы и, возможно, группы кишечной палочки, то для получения гемокультур в первые дни заболевания берут 8 - 10 мл крови из вены. Для серологического исследования 2 - 3 мл крови можно брать из пальца на 3-й день заболевания (анамнестическая реакция), а затем на 7 - 10-й день для выявления нарастания титра агглютинации. При отсутствии сыворотки в начале исследования кровь рекомендуется брать на 7 - 10-й день и повторно на 15 - 20-й день от начала заболевания, а для выявления падения титра агглютинации - на 28 - 30-й день.

Если клинические явления соответствуют стафилококковой интоксикации, то производят исследование материала из носа и зева персонала, занятого изготовлением готовой продукции с целью выявления возможного источника инфекции.

Для отбора проб в лаборатории должна быть стерильная посуда - стерильные банки емкостью 200 - 300 мл с притертыми пробками или закрытые вощаной бумагой и обвязанные; бутылки, горлышко которых закрыто ватной пробкой и бумажным колпачком. Для отбора проб необходимо иметь стерильные ложки, шпатели, пробирки с тампоном для взятия смывов и мазков из зева и носа. Пробы отбираются с соблюдением общепринятых правил стерильности; при отсутствии стерильной посуды пробы отбирают в любые стаканы, стеклянные банки после предварительного кипячения их в течение 15 минут. Обработка посуды дезинфицирующими растворами не допускается. Твердые объекты могут пересылаться завернутыми в несколько слоев вощаной или пергаментной бумаги; расфасованные продукты направляют в оригинальной упаковке.

При направлении на исследование консервов остатки из вскрытой банки не извлекают, а пробу доставляют непосредственно в консервной банке. При отсутствии остатков исследуют невскрытые банки той же автоклавоварки, при этом следует руководствоваться маркировкой консервных банок. Маркировочные знаки, поставленные на донышке и крышке банок, следует отмечать в лабораторном журнале, а также использовать при оформлении протокола. Целесообразно практиковать выезды лабораторных работников для отбора проб. Для перевозки банок, пробирок и другого материала в лаборатории необходимо иметь портативный ящик, плотно закрывающийся и пломбируемый.

Пробы для бактериологического исследования доставляют в количествах, приводимых ниже; при невозможности отбора проб в рекомендованных количествах выемка должна проводиться и в меньших количествах.

Мясо доставляют в количестве 500 г; пробу отбирают из различных мест туши с обязательным взятием лимфатических узлов, а также участков трубчатой кости. Птицу берут целиком или ее остатки.

От крупной рыбы берут пробы из 2 - 3 мест, в том числе из спинки ближе к голове и из участков вблизи анального отверстия; мелкая рыба доставляется целиком.

Пробы жидких и полужидких объектов (супы, соусы, кремы, молочные продукты и др.) берут в количестве около 200 г после тщательного перемешивания стерильным черпаком или ложкой. Вторые блюда берут по 1 - 2 порции.

Особое значение имеют остатки фактически употребленной пищи, которые направляют в лабораторию в посуде, где они были обнаружены. Допускается их доставка в стерильных банках, куда остатки пищи переносят с соблюдением правил асептики. Фекальные и рвотные массы берут в первые часы заболевания в количестве 50 - 100 г. Промывные воды направляют в количестве 100 - 200 мл, причем они должны быть получены до применения каких-либо лекарственных средств.

Кровь у больного берут в количестве 8 - 10 мл в стерильную сухую пробирку. При подозрении на ботулизм кровь следует брать до введения больному противоботулинической сыворотки.

С целью лучшего формирования сгустка кровь выдерживают в течение 30 - 60 минут при комнатной температуре или в термостате при 37°, после чего стерильной пастеровской пипеткой или прокаленной петлей отделяют сгусток от стенок пробирки и помещают в холодильник при температуре 3 - 5° для окончательного сформирования сгустка; сыворотку отсасывают и используют для постановки реакции агглютинации. Сгусток может быть использован для посева.

При производстве смывов с инвентаря, оборудования, различной утвари и рук поверхность их тщательно вытирают ватным тампоном на стеклянной или деревянной палочке, можно также пользоваться небольшими марлевыми салфеточками (5 x 5 см). Для увлажнения тампона используют стерильный физиологический раствор или водопроводную стерильную воду в количестве 2 мл; тампоны увлажняют непосредственно перед взятием смывов.

При взятии смывов с жирной поверхности пользуются сухими тампонами. Отбор материала из зева и носа производят стерильными тампонами, обычно применяемыми при взятии мазков для эпидемиологического обследования. Соскобы производят стерильным или прокаленным в пламени горелки ножом или скальпелем, соскоб собирают в стерильную банку или чашку Петри с небольшим количеством (2 - 3 мл) физиологического раствора.

Отбор секционного материала производят в количестве по 50 - 60 г. Взятие проб проводится в стерильных условиях: поверхность органа прожигают раскаленным шпателем и затем стерильными ножницами вырезают кусочек органа. Содержимое желудка и кишечника набирают пастеровской пипеткой путем прокола стенки; место прокола предварительно прижигают раскаленным шпателем.

Пересылка образцов должна производиться в кратчайший срок, так как время от забора проб до начала анализа может отразиться на результатах исследования.

В теплое время года пробы должны доставляться в лабораторию в охлажденном виде, для чего в ящик, в котором доставляются пробы, помещают лед.

В лаборатории отмечается и регистрируется характер упаковки, причем особое внимание обращают на целостность пломб или печатей, на дефекты упаковки и количество направленного материала. К исследованию следует приступать немедленно по получении материала.

В присланных пробах продуктов отмечается их внешний вид, запах и консистенция. Продукты должны подвергаться бактериологическому исследованию независимо от признаков порчи.

При посеве плотных пищевых продуктов (мясо, колбаса, сыр и т.д.) берут материал с поверхности и из глубины. В последнем случае производят отбор из разных мест доставленной пробы, исходя из возможного локализованного распространения микробов. В ряде случаев при отборе проб из глубины производят стерилизацию поверхности (колбаса, мясо и т.п.) металлическим раскаленным шпателем или ножом. Небольшие кусочки пищевых продуктов засевают без стерилизации, так как обжигание поверхности может уничтожить микрофлору. Стерильно взятую навеску продукта в количестве 5 - 10 г (при подозрении на ботулизм - 25 - 30 г) измельчают в стерильной ступке с небольшим количеством стерильного физиологического раствора или водопроводной воды в отношении от 1:2 до 1:5 в зависимости от консистенции исследуемого продукта.

Для получения кашицеобразной массы используют стерильное битое стекло или песок; это и будет служить исходным материалом для всех посевов.

Крем, масло, мороженое, студень, меланж и т.п. перед посевом подвергают расплавлению, для чего помещают на короткое время в термостат или водяную баню при температуре 43 - 45°.

Костный мозг перед посевом извлекают из трубчатых костей и эмульгируют в подогретом физиологическом растворе (температура 40 - 45°).

Жидкие объекты (молоко, напитки, супы), промывные воды и рвотные массы засеваются без предварительной обработки. Пищевые продукты, имеющие кислую реакцию, а также рвотные массы перед посевом нейтрализуют 10% стерильным раствором соды до слабо щелочной реакции, которую проверяют по универсальной индикаторной или по лакмусовой бумажке.

Закрытые консервные банки предварительно обмывают теплой водой с мылом, проверяют герметичность, отмечают внешний вид банки (бомбаж и т.д.). Перед посевом банки протирают спиртом и обжигают, вскрывают с соблюдением требований ГОСТ (N 8756-58). Исследование ведут согласно методике указанного ГОСТ и только после этого проводят какие-либо специальные исследования, исходя из данных санитарно-эпидемиологического расследования.

Жидкие фекальные массы оставляют на полчаса для отстаивания, густые - тщательно размешивают в физиологическом растворе (приблизительно в отношении 1:10) и после отстаивания приступают к посеву, для чего используют верхний слой.

Секционный материал - отрезок кишечника с содержимым, кусочки органов, содержимое желудка перед посевом растирают в ступке со стерильным битым стеклом или песком в равном объеме физиологического раствора. Каждый орган исследуют отдельно.

Подготовленная таким образом взвесь после отстаивания в течение 1 - 2 часов при комнатной температуре используется как для обнаружения микроба, так и его токсина.

Существенное значение имеют данные эпидемиологического расследования, которые позволяют выделить объекты исследования, подозреваемые в наибольшей причинной связи с происшедшим отравлением.

Данные эпидемиологического расследования и клиническая картина заболевания до некоторой степени могут определить направление бактериологических исследований.

Однако следует подчеркнуть необходимость проведения посевов для возможного выявления любого из перечисленных в настоящей методике возбудителей пищевого отравления.

Первый этап. Для исследования на указанную группу бактерий материал засевают на твердые дифференциальные среды: висмут-сульфитный агар (среду Вильсон и Блера), среды с желчными солями - бактоагар Ж и бактоагар Плоскирева, фуксин-сульфитный агар (среду Эндо), метилен-эозиновый агар (среду Левина). Посев рекомендуется производить одновременно в 2 - 3 чашки с различными дифференциальными средами (например, на среду Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит-агар и среду Левина), так как одни и те же штаммы салмонелл по-разному относятся к тем или иным дифференциальным средам. Применяемую для посева твердую среду следует всегда предварительно подсушивать. Посев плотного материала (мясо, мясопродукты и др.) производят путем втирания на поверхности питательной среды стерильно взятых из глубины проб кусочков или путем растирания 1 - 2 капель взвеси материала в стерильной водопроводной воде или физиологическом растворе поваренной соли (см. выше "Подготовка проб к исследованию").

При исследовании сметаны, мороженого и других продуктов подобной консистенции их эмульгируют в пятикратном объеме стерильного физиологического раствора и несколько капель эмульсии растирают по поверхности питательной среды. Жидкий материал наносят на поверхность среды в количестве 0,1 - 0,2 мл с последующим втиранием. Посев делают таким образом, чтобы получить изолированные колонии. С этой целью рекомендуется производить продолжительное тщательное втирание всего материала шпателем на поверхности среды.

Одновременно с прямым посевом на плотные дифференциальные среды материал засевают на одну, а лучше параллельно на две какие-либо среды обогащения, из которых наиболее употребительными являются среды Мюллера, Кауфмана и Килиана. Посевы в среды обогащения делают массивными, помещая 3 - 5 г плотного измельченного продукта (например, мяса) или 3 - 5 мл взвеси его в колбу, содержащую 50 - 100 мл среды обогащения. При подозрении на большое обсеменение из колбы с посевом основного материала после взбалтывания делают ряд разведений путем переноса по 1 мл из колбы в первую пробирку, а затем последовательно в другие пробирки, содержащие по 9 мл той же среды обогащения.

Второй этап. Через 12 - 16 часов и повторно через 18 - 24 часа производят просмотр посевов на дифференциальных средах невооруженным глазом, а также с помощью лупы или под малым увеличением микроскопа, чтобы не пропустить мелких колоний.

На среде Эндо колонии салмонелл бесцветные или бледно-розового цвета; на среде Левина - бледные, нежно-розового и розовато-фиолетового цвета; на бактоагаре Плоскирева и бактоагаре Ж - бесцветные или нежно-розового цвета. На среде Вильсон и Блера тифозные и паратифозные (А) бактерии растут в виде мелких серовато-зеленых колоний с черным центром; колонии бактерий паратифа Б и других салмонелл значительно крупнее, коричневого цвета с металлическим блеском, иногда окруженные светлым ореолом; цвет среды изменяется при этом в черный, особенно под колониями.

В случае отсутствия роста салмонелл на дифференциальных средах при первом просмотре посевов на чашках (через 12 - 16 часов) проводят посев из сред обогащения на указанные выше дифференциальные среды. Аналогичный высев делают вторично через 18 - 24 часа, если рост салмонелл не обнаруживается при повторном просмотре прямых посевов на дифференциальных средах.

При обнаружении подозрительных колоний в чашках с прямым посевом или с посевом из сред обогащения исследования этих колоний (не менее пяти) производят в следующем порядке.

Из части изолированно расположенных колоний приготовляют мазки, которые окрашивают по Граму.

При обнаружении чистой культуры грамотрицательных, неспорообразующих палочек для типизации культуры проводят биохимическое и серологическое исследование колоний.

Для биохимического исследования оставшиеся части колоний снимают петлей и хорошо растирают в конденсационной воде пробирок с косым агаром <1>. Полученную взвесь засевают на короткий пестрый ряд, состоящий из пробирок со средами Гисса, содержащими в одной пробирке равные количества лактозы и сахарозы, а в двух других - глюкозу и маннит. Для ускорения роста посев на среды Гисса рекомендуется делать в маленьких пробирках с 1 мл среды. Среды перед посевом целесообразно подогревать в термостате в течение 2 - 3 часов.

--------------------------------

<1> Если в пробирке нет конденсационной воды, то в нее можно внести 1 - 2 капли стерильного бульона.

Кроме посева на среды Гисса, делают также посевы на косой агар, уколом в полужидкий агар (для определения подвижности <2>) и бульон Хоттингера; можно под пробки в пробирки с бульоном или полужидким агаром поместить бумажки, смоченные уксуснокислым свинцом для определения сероводорода и реактивом Эрлиха или щавелевой кислотой для определения индола. Вместо посева на среды Гисса и косой агар можно сделать посев в две пробирки со средами Ресселя, из которых одна содержит лактозу и глюкозу, а другая - сахарозу и маннит. Первая среда Ресселя может быть заменена той же средой с добавлением мочевины (бактерии группы салмонелл не разлагают мочевину в отличие от палочек протея и Моргана). На среды Ресселя посевы делают штрихом по скошенной поверхности, а затем уколом в столбик среды. Все посевы помещают в термостат (37°).

--------------------------------

<2> Подвижная культура дает сплошной рост, вызывая равномерное помутнение среды; неподвижные культуры образуют рост только по уколу.

Примечание. При разложении лактозы в среде Ресселя косая поверхность окрашивается в синий цвет. При разложении только глюкозы окрашивается один столбик среды, а газ скопляется в виде пузырьков с разрывом агара. При разложении мочевины в среде Ресселя с мочевиной среда окрашивается в оранжевый цвет.

Третий этап. Через 12 - 16 часов и повторно через 24 часа посевы просматривают, проверяя морфологию, окраску по Граму и подвижность в висячей, или раздавленной капле или по характеру роста в полужидком агаре, а также ферментативные свойства культур и индолообразование.

Чистые культуры грамотрицательных, подвижных палочек, ферментирующие глюкозу и маннит с образованием газа и не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину (если последняя вводилась в пестрый ряд) и не образующие индола, исследуют дальше. Для этого делают посев на полный дифференциальный ряд, в который входят: желатина, лакмусовое молоко, среды Гисса с лактозой, глюкозой, сахарозой, маннитом, арабинозой, дульцитом и рамнозой <1>, а также глицерин-бульон (по Штерну).

--------------------------------

<1> Среду с рамнозой готовят не по рецепту Биттера, а как среду Гисса, но без индикатора; краску (0,5 - 1% раствор метиленовой красной) в количестве нескольких капель добавляют к культуре через 16 - 18 часов роста.

Биохимические свойства некоторых типов салмонелл видны из табл. 1.

Серологический анализ культуры производят путем постановки пробной агглютинации на предметном стекле с неадсорбированными сыворотками, линейной (развернутой) агглютинации с теми же сыворотками и реакцию агглютинации с монорецепторными сыворотками.

Условные обозначения: к. - кислота, покраснение; г - газ; к. с - покраснение, переходящее в посинение; знак плюс (+) - положительная реакция, гибель мышей; знак минус (-) - отсутствие реакции; знаки (- +) - замедленная реакция; знаки (-/+) в большинстве случаев - отсутствие реакции, в единичных случаях положительная; знаки (- -/+) - отсутствие реакции или иногда замедленная реакция при температуре 37°.

Для реакции агглютинации используют смыв культуры со среды Ресселя или с косого агара. Для проведения пробной агглютинации на предметное стекло наносят каплю смеси равных количеств видовых неадсорбированных сывороток S. paratyphi B (или S. typhi murium), S. enteritidis и S. cholerae suis в разведении каждой 1:10 (общее разведение в смеси 1:30) и рядом, на том же стекле, на достаточном расстоянии, каплю физиологического раствора. Затем петлей захватывают материал из приготовленного смыва культуры, вносят его в каплю смеси сывороток и растирают до получения равномерной взвеси; после этого петлю обжигают и другую часть смыва вносят в каплю физиологического раствора. При положительной реакции через 1 - 2 минуты в капле смеси сывороток образуются хлопья или комочки, а сама жидкость просветляется, что особенно заметно при наклонении и покачивании стекла. В капле физиологического раствора (контроль) наблюдается равномерное помутнение. При получении положительной реакции агглютинации со смесью сывороток повторяют агглютинацию на стекле с каждой из указанных выше 3 сывороток в разведении 1:50.

Серологическую идентификацию монорецепторными агглютинирующими сыворотками производят следующим образом. С помощью O-сывороток, отвечающих отдельным O-антигенам (I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX и др.) салмонелл различных серологических групп, устанавливают принадлежность исследуемых бактерий к той или иной серологической группе (A, B, C, D, E). Для этого каплю неразведенной O-сыворотки наносят на предметное стекло и в ней растирают испытываемую культуру. Начинать следует с сывороток тех групп, с которыми была получена пробная агглютинация на стекле или отвечающих O-антигенам наиболее распространенных групп - B, C, D, E. Установив серологическую группу, к которой относятся данные бактерии, таким же образом с помощью H-сывороток определяют вид бактерий, Так, например, бактерии, дающие агглютинацию с O-сывороткой, отвечающей O-рецептору IV, H-сыворотками, отвечающими H-рецептору первой фазы "i" и второй фазы 1, 2, типируются как S. typhi murium.

Антигенная структура некоторых типов салмонелл видна из табл. 2.

Примечание. Скобка в таблице означает, что этот антиген может отсутствовать.

Линейную (развернутую) агглютинацию производят с теми же видовыми неадсорбированными сыворотками, что и пробную агглютинацию на стекле. Агглютинацию ставят следующим образом. В штатив устанавливают ряд агглютинационных пробирок, в которые наливают по 0,5 мл физиологического раствора. Одну (первую) пробирку оставляют пустой. Готовят сыворотку в разведении 1:100, для чего к 0,1 мл сыворотки прибавляют 0,99 мл физиологического раствора. Из этой сыворотки берут 1 мл и 0,5 мл вносят в первую (пустую) пробирку (разведение 1:100), а остальные 0,5 - во вторую, содержимое которой тотчас смешивают (разведение 1:200). Из второй пробирки 0,5 мл переносят в третью и смешивают (разведение 1:400), из третьей - в четвертую и т.д. до конечного титра данной сыворотки. Из предпоследней пробирки после перемешивания удаляют 0,5 мл. Последняя пробирка с 0,5 мл физиологического раствора без сыворотки служит контролем.

В каждую пробирку с разведенной сывороткой и в контрольную вносят 1 - 3 капли взвеси бактерий до появления ясно выраженной легкой опалесценции. Для приготовления взвеси в пробирку с суточной культурой на среде Ресселя или на косом агаре добавляют 2 - 4 мл физиологического раствора. Пробирку прокатывают между ладонями и оставляют стоять несколько минут для оседания грубых частей. Взвесь микробов переносят и другую пробирку и для агглютинации берут пастеровской пипеткой из верхней ее части. После добавления взвеси бактерий агглютинационные пробирки тщательно встряхивают для получения равномерной слабой мути. Пробирки помещают в термостат при 37° на 2 часа, после чего отмечают первые результаты реакции, ее характер. Затем пробирки оставляют при комнатной температуре и через 20 - 22 часа отмечают окончательный результат.

Агглютинацию учитывают невооруженным глазом, а в сомнительных случаях с помощью лупы или агглютиноскопа; проявляется она образованием на дне пробирки осадка в виде зонтика, легко распадающегося при встряхивании на хлопья или зерна. В контрольной пробирке наблюдают гомогенную взвесь. Результат агглютинации считается положительным, если испытуемая культура агглютинируется не ниже 1/3 титра данной сыворотки.

Если агглютинация дала положительный результат, с двумя и более сыворотками, то вид бактерий будет соответствовать той сыворотке, с которой агглютинация прошла до предельного титра сыворотки или до более высокого титра по сравнению с другими сыворотками.

Если выделенная культура по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам соответствует определенному виду бактерий из группы салмонелл, то дается заключение об обнаружении бактерий этой группы с указанием их вида.

Если выделенная культура соответствует по морфологическим и биохимическим свойствам бактериям из группы салмонелл, но не агглютинируется ни с одной из введенных сывороток, то до окончательного заключения следует провести дополнительные исследования биохимических и серологических свойств выделенной культуры. Учитывая свойство некоторых штаммов бактерий группы кишечной палочки сбраживать лактозу через длительный срок, необходимо исключить у выделенного штамма способность разлагать указанный углевод. С этой целью весьма целесообразен посев выделенной культуры на синтетические среды Строгова. На этих средах культуры бактерий группы кишечной палочки дают уже через 18 часов интенсивный рост с порозовением среды, в то время как бактерии из группы салмонелл не обнаруживают роста. Этот признак нередко практически позволяет дифференцировать неагглютинирующиеся штаммы бактерий группы салмонелл от бактерий группы кишечной палочки. Наряду с указанным исследованием необходимо попытаться восстановить агглютинационные свойства выделенной культуры путем ежедневных пересевов ее на влажный скошенный, слабо щелочной (pH 7,2) агар или чередованием пересевов на агар и на желчный бульон.

Нередко после 3 - 5 таких пересевов удается восстановить агглютинационные свойства культуры.

Для уточнения вида некоторых выделенных неагглютинабильных штаммов салмонелл можно в качестве дополнительных дифференциальных признаков применить определение способности их к валообразованию и поставить энтеральную пробу на мышах.

Для определения валообразования культуру рассевают на чашки с агаром с расчетом получения изолированных колоний. После 24-часового культивирования в термостате при 37° чашки выдерживают в течение 1 - 2 дней при комнатной температуре (защищенными от света). Одни виды салмонелл образуют в этих условиях слизистые валики, преломляющие свет, другие не образуют (см. табл. 1).

Для проведения биологической пробы суточную агаровую культуру смывают 3 - 5 мл физиологического раствора и 1 мл взвеси смачивают кусочки сухарика белого хлеба, которые дают натощак 2 - 3 мышам весом 14 - 18 г; такое же количество мышей оставляют в качестве контроля. Одни виды салмонелл вызывают гибель мышей при введении им культуры через рот указанным способом, другие нет (см. табл. 1). В случае гибели мышей из их органов (сердца, печени, селезенки) производят посев и дальнейшее изучение выделенных культур по изложенной выше методике.

Если восстановить агглютинационные свойства выделенных культур не удается и произвести типизацию их на месте невозможно, они должны быть направлены в соответствующие институты или лаборатории для идентификации <1>.

--------------------------------

<1> Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова (Москва, пер. им. Мечникова, д. 5а) и Московская городская санитарно-эпидемиологическая станция (Москва, Графский пер., д. 4/9, Санитарно-бактериологическая лаборатория).

Вопрос же о мероприятиях на месте должен решаться на основе анализа клинических и эпидемиологических показаний, а также данных бактериологического исследования.

Если выделенная культура не типична по биохимическим свойствам (отклонения в ферментации тех или иных углеводов и спиртов, в образовании сероводорода и пр.), но избирательно агглютинируется монорецепторными или обычными сыворотками не менее чем до 1/3 титра, то ее относят к бактериям группы салмонелл.

Если по биохимическим свойствам культура нетипична и агглютинируется несколькими монорецепторными сыворотками разных групп, то это явление параагглютинации и бактерии не относят к группе салмонелл.

Для выявления возбудителя пищевой токсикоинфекции применяют метод получения гемокультур. Посев крови следует производить в первые дни заболевания, так как в более поздние сроки возбудители часто исчезают из крови. Кровь берут стерильным шприцем из вены локтевого сгиба. Сеять можно цельную кровь или ее сгусток. Цельную кровь засевают в количестве от 5 до 15 мл на 50 - 150 мл питательной среды (с расчетом соотношения крови и питательной среды не менее 1:10). Для посева сгустка кровь в количестве 5 - 10 мл, взятую в стерильную пробирку, помешают на 1 1/2 - 2 часа в термостат при 37° для свертывания и выделения сыворотки. Отстоявшуюся прозрачную сыворотку используют для реакции агглютинации, а сгусток стерильно переносят в колбу с 50 - 60 мл питательной среды, разбивая его стерильной палочкой. Посев как цельной крови, так и сгустка производят в бульон с 10 - 20% желчи или на среду Рапопорт. При отсутствии желчи кровь можно засевать на 80 - 100 мл стерильной дистиллированной или водопроводной воды. Посевы помещают в термостат при 37°. Через сутки делают пересев на чашки с плотными дифференциальными средами (Эндо, Левина).

В среде Рапопорт, после ее засева, кровь гемолизируется желчью. При отсутствии роста бактерий среда остается прозрачной, без изменения цвета; при наличии роста салмонеллезных бактерий среда мутнеет и краснеет, причем в поплавках появляется пузырек газа. При отрицательном результате посева колбы оставляют в термостате на 2 - 3 дня для дальнейшего наблюдения. При положительном результате делают бактериоскопию и высев на плотные дифференциальные среды. Дальнейшие исследования на наличие бактерий из группы салмонелл производят в описанном выше порядке.

Реакция агглютинации с сывороткой крови потерпевших ставится:

1) для подтверждения этиологической роли бактерий, выделенных из различных объектов при пищевой токсикоинфекции;

2) в случаях получения отрицательного результата бактериологического анализа исследуемых объектов;

3) в случаях, если бактериологическое исследование не было своевременно сделано.

Реакция агглютинации должна быть прослежена в динамике, для чего она ставится на 1 - 3-й день заболевания (прививочная или анамнестическая реакция), а затем на 7 - 10-й день и повторно на 15 - 20-й день.

Кровь от заболевших берут в количестве 2 - 3 мл из вены или пальца, а у маленьких детей из пятки. Взятую кровь оставляют в пробирке в течение 60 минут при комнатной температуре или в течение 30 минут при 37° для свертывания в наклонном положении (что обеспечивает отделение сыворотки). Затем готовят ряд разведений сыворотки от 1:50 до 1:800. Антигеном служат выделенные при исследовании суточные агаровые культуры бактерий группы салмонелл, кишечной палочки, протея, Моргана или музейные культуры группы салмонелл, проверенные биохимически и серологически. При отсутствии живых музейных культур можно пользоваться соответствующими диагностикумами. Техника реакции агглютинации такая же, как и при определении серологических свойств выделенных штаммов. Контролем при реакции служат: физиологический раствор + антиген (контроль культуры) и сыворотка из наименьшего разведения без антигена (контроль сыворотки). Результат реакции считается положительным при агглютинации с сывороткой в разведении не менее 1:100.

Материал засевают на дифференциальные среды и среды обогащения, как указывалось выше.

Через 12 - 16 часов, и повторно через 18 - 24 часа производят просмотр посевов на дифференциальных средах. В случае отсутствия роста при первом просмотре (через 12 - 16 часов) производят посев из сред обогащения.

При обнаружении подозрительных колоний исследуют не менее 5 в следующем порядке.

Из части изолированно расположенных колоний приготовляют мазки, которые окрашивают по Граму, и производят исследование на подвижность. При обнаружении чистой культуры грамотрицательных, подвижных, неспорообразующих палочек остальные части колоний растирают в конденсационной воде косого агара и полученную взвесь используют для дальнейших исследований. С частью взвеси производят пробную агглютинацию на предметном стекле с неадсорбированными сыворотками в таких же разведениях и в таком же порядке, как указано выше.

Характерный для салмонелл рост колоний на твердой дифференциальной среде, наличие грамотрицательных, подвижных, неспорообразующих палочек и положительная реакция пробной агглютинации с неадсорбированными сыворотками в разведении 1:50 позволяют в случае необходимости дать предварительный ответ о наличии в материале бактерий салмонелл (без указания вида). Дальнейшее исследование и типизацию культур производят путем определения биохимических свойств и серологического анализа.

Для биохимического исследования взвесь из колонии в конденсационной воде засевают на описанный выше короткий ряд, введя в него дополнительно пробирку со средой Строгова, позволяющей определять индолообразование через 8 - 12 часов.

Если при первичном исследовании взвеси из колоний пробная агглютинация на стекле была отрицательной, то с целью ориентировочной биохимической типизации 1 посев материала производят сразу на полный дифференциальный ряд, описанный выше.

Через 12 - 16 часов и повторно через 24 часа посевы просматривают, проверяя морфологию, окраску по Граму и подвижность, а также ферментативные свойства культур, в том числе индолообразование (на среде Строгова). Одновременно проводят серологическую идентификацию культур монорецепторными агглютинирующими сыворотками по методике, указанной выше.

Учет результатов ускоренного исследования производят так, как при обычном (классическом) исследовании.

Первый этап. Исследуемый материал (1 - 2 капли жидкого или основного разведения плотного) засевают на дифференциально-диагностические среды, тщательно втирая в поверхность питательной среды шпателем для получения изолированных колоний.

Материал втирают последовательно на бактоагар Плоскирева или бактоагар Ж и на метилено-эозиновый агар Левина. Посев производят на различные дифференциальные среды, учитывая качественное различие сред и разное отношение к ним штаммов. Посевы помещают в термостат при 37° на 18 - 24 часа.

Рекомендуется исследуемый материал вносить также в 20% желчный бульон и оставлять на 3 - 4 часа при комнатной температуре с последующим высевом на упомянутые плотные дифференциальные среды.

Второй этап. Через 18 - 24 часа производят просмотр посевов на дифференциальных средах.

При отсутствии на них роста характерных колоний в течение суток рекомендуется оставить посевы еще на 18 - 24 часа в термостате при 37°. Если за этот срок не появится роста подозрительных колоний, дают отрицательный ответ.

При наличии роста на среде Плоскирева и бактоагаре Ж изучают выросшие колонии. Колонии дизентерийных микробов небольшие нежные, прозрачные. В проходящем свете колоний Sh. Flexner имеют слегка сероватый оттенок. Колонии Sh. Sonnei более плотные, несколько крупнее, чаще встречаются в R-форме (плоские распластанные с неровными краями). Через 48 часов колонии Sh. Sonnei могут приобретать розоватый оттенок.

Подозрительные колонии в количестве 3 - 5 отсевают на среду Ресселя с лактозой и глюкозой или на ту же среду с добавлением мочевины (для дифференцирования от B. proteus). Для определения подвижности, а также образования индола и сероводорода производят дополнительно посев на полужидкий агар (бульон Хоттингера с добавлением 0,2 - 0,3% агар-агара). При отсутствии среды Ресселя можно использовать среды Гисса (лактозу и глюкозу) и скошенный агар.

На среду Ресселя посев производят штрихом по скошенной поверхности и уколом в глубину столбика.

Посев на полужидкий агар производят вертикальным уколом петли. Под пробку помещают индикаторные бумажки на сероводород и индол. Уже через 5 - 6 часов инкубирования при 37° подвижные микробы равномерно мутят среду, неподвижные дают рост только вдоль укола, оставляя среду прозрачной.

Третий этап. Учет полученных данных начинают с биохимической характеристики выделенных культур (см. таблицу).

Штаммы, не изменившие среды с лактозой или дающие легкое разложение (изменение реакции в кислую зону), изучают морфологически в препаратах, окрашенных по Граму, учитывают подвижность. Отмечают образование сероводорода и индола.

Культуры неподвижные, грамотрицательные, не образующие газов в среде с глюкозой и не сбраживающие лактозу, подозрительны на микробы дизентерийной группы. Культуры, сбраживающие лактозу с образованием кислоты, иногда к концу первых или вторых суток могут относиться к Sh. Sonnei. Дизентерийные бактерии, как правило, не образуют сероводорода и индола, но в практической работе встречаются отдельные штаммы дизентерийных бактерий, дающие положительную реакцию на индол и сероводород. Все подозрительные культуры засевают на развернутый пестрый ряд (лактозу, глюкозу, маннит, мальтозу, сахарозу и лакмусовое молоко) и испытывают с дизентерийными адсорбированными сыворотками в реакции агглютинации на предметном стекле. При отсутствии адсорбированных сывороток культуры испытываются с дизентерийными видовыми сыворотками в ориентировочной агглютинации на стекле в разведении 1:25.

В случае положительной реакции агглютинации с видовой сывороткой Флекснера или Бойд-Новгородской производят определение серологического типа типовыми адсорбированными сыворотками Флекснера (a, b, c, d, e, f) и Бойд-Новгородской (с I по VII). Типирование культур производят на хорошо обезжиренном предметном стекле, тщательно смешивая каждую культуру с сывороткой. Положительная реакция наступает в течение 1 - 3 минут.

Свежевыделенные культуры в первых генерациях часто плохо агглютинируются (особенно со среды Плоскирева и бактоагара Ж).

Культуры, находившиеся в переходной или шероховатой форме, могут агглютинироваться гетерологическими сыворотками. Поэтому результаты ориентировочной агглютинации дают право только на предварительное заключение. Культуры, отобранные как подозрительные, пересевают на скошенный агар и в пробирку с мясо-пептонным бульоном.

С культурой на среде Ресселя или на скошенном агаре ставят развернутую реакцию агглютинации с неадсорбированными видовыми сыворотками. При постановке развернутой реакции агглютинации в каждую пробирку с разведенной сывороткой и в контрольную вносят 1 - 2 капли взвеси бактерий до появления легкой опалесценции (см. выше, как при изучении салмонелл).

Условные обозначения: К - образование кислоты в первые сутки; Г - образование газа; +/- - образование индола, наличие каталазы; - отсутствие индола.

Все посевы и пробирки с реакцией агглютинации помещают в термостат при 37° до следующего дня.

Для установления принадлежности культуры к виду Sh. Sonnei рекомендуется ее рассеять в чашку с агаром с целью выявления расщепления культуры на S- и R-формы.

В качестве дополнительного метода можно рекомендовать испытание фаголизабильности культуры (лучше монофагом). Для этого на хорошо подсушенную чашку с МПА pH 7,4 - 7,6 пастеровской пипеткой наносят большую каплю 18 - 20-часовой культуры испытуемого штамма с мясо-пептонного бульона. На подсохшие капли культуры наносят дизентерийный фаг, на контрольных чашках наносят только культуры без бактериофага. Чашкам дают хорошо подсохнуть, после чего помещают в термостат при 37° на 18 - 20 часов. При положительном результате наблюдается полная или частичная задержка роста, на контрольных чашках - обычный рост культуры.

Четвертый этап. Отмечают рост на средах Гисса и на чашках с агаром, а также наличие лизиса.

Учитывают развернутую реакцию агглютинации при помощи агглютиноскопа или лупы ввиду мелкозернистого характера агглютината.

Нередко возникают затруднения при определении не вполне типичных культур. В случае отклонения от общепризнанной характеристики вида, такие культуры подлежат дальнейшему изучению. В этом случае ответ дается по следующей форме: "Выделена культура, подозрительная по принадлежности к роду дизентерийных". Исследование продолжается.

Если биохимические свойства культуры остаются атипичными, следует провести ряд пассажей на 20% желчном бульоне, бульоне Хоттингера и свежескошенном агаре.

Наиболее часто можно наблюдать потерю агглютинабильности. Это свойство иногда восстанавливается после нескольких (3 - 5) ежедневных пассажей на свежий, влажный скошенный агар или при чередовании пересевов на агар с посевом на желчный бульон, а также на чашки со щелочным агаром (pH 8 - 8,2).

Одновременно рекомендуется рассеять неагглютинирующуюся культуру на чашку с агаром для получения изолированных колоний. Через 18 - 20 часов с несколькими (10 - 15) колониями ставят ориентировочно агглютинацию на стекле с соответствующей сывороткой и при получении положительной реакций производят отсев таких штаммов на скошенный агар для дальнейшей серологической идентификации. Дополнительным способом определения культуры является изучение ее соматического термостабильного антигена. Для этого ставят реакцию агглютинации с кипяченой взвесью микробов. Смыв культуры с косого агара 3 - 5 мл физиологического раствора прогревают в течение одного часа в кипящей водяной бане, после чего ставят по обычному методу развернутую реакцию агглютинации. Разведения сыворотки в этом случае начинают 1:20. Результаты учитывают на следующий день при помощи агглютиноскопа. Наличие агглютинации с какой-либо одной сывороткой подтверждает принадлежность культуры к тому или иному виду бактерий дизентерийной группы.

В случае, если после всех описанных методов дополнительного исследования не удастся определить природу выделенных культур, они должны быть направлены в следующие учреждения:

1) Институт санитарии и гигиены имени Эрисмана (Москва, Пятницкая ул., д. 1/2, Санитарно-бактериологическая лаборатория); 2) Городская санитарно-эпидемиологическая станция г. Москвы (Москва, Графский пер., д. 4/9, Санитарно-бактериологическая лаборатория).

Основанием для положительного ответа служат данные морфологии микроба, биохимической характеристики и результаты агглютинации с неадсорбированными сыворотками (не ниже 1/3 титра сыворотки).

При необходимости ускорения бактериологического исследования могут быть использованы следующие приемы: а) комбинированные среды для выращивания микробов; б) сокращение интервалов между пересевами и между отдельными этапами исследования. Так, например, подозрительные колонии с чашки пересевают одновременно на три пробирки: одну - в среду Ресселя с лактозой, глюкозой и мочевиной, вторую - в среду Ресселя с маннитом и сахарозой, третью - в пробирку с полужидким агаром для определения сероводорода, индола и подвижности. Подозрительную колонию можно, перенеся в небольшой объем бульона или физиологического раствора, рассеять затем на развернутый пестрый ряд. Рекомендуется применять жидкие питательные среды в небольших объемах (1 мл), предварительно подогретых до 37°. Для реакции агглютинации можно использовать 6 - 8-часовую культуру на скошенном агаре.

Первый этап. Исследование на бактерии группы кишечной палочки начинается с прямого посева материала (подозреваемый продукт, рвотные массы, промывные воды, смывы, фекалии) на твердую дифференциальную среду Эндо (можно среду Левина).

Посевы следует производить не менее чем на 2 - 3 чашки с одной и той же средой для получения большего количества изолированных колоний.

Техника посева на бактерии данной группы такая же, как и на бактерии группы салмонелл. Выращивание посевов производится при 37° в течение 18 - 24 часов.

Второй этап. Через указанный срок посевы просматривают невооруженным глазом.

При отсутствии роста на среде Эндо (или Левина) посевы оставляют еще на сутки.

При отсутствии через 48 часов роста микробов вообще или отсутствии колоний, подозрительных на бактерии группы кишечной палочки, дается отрицательный ответ на наличие этих бактерий в исследуемом материале.

При наличии колоний, подозрительных на бактерии группы кишечной палочки, обращают внимание на степень обсеменения данным видом микроба.

Внешний вид колоний непатогенных и патогенных серотипов бактерий группы кишечной палочки не отличается друг от друга, т.е. на среде Эндо они имеют вид красных с металлическим блеском колоний, красных без блеска, розовых с красным центром и белых; на среде Левина - темно-фиолетовые блестящие, розовато-фиолетовые и розовые.

Из 10 - 12 изолированных колоний, расположенных в разных местах чашки, забирают небольшое количество материала для испытаний в ориентировочной реакции агглютинации.

Последняя проводится на стекле в капле комплексной OB-сыворотки (смесь типовых сывороток, содержащих антитела к O- и B-антигенам), разведенной 1:5 или 1:10 стерильным физиологическим раствором. При этом надо иметь в виду следующее:

а) если имеется готовая комплексная сыворотка в сухом виде, то в ампулу с сухой сывороткой добавляют сначала 1 мл физиологического раствора и после полного растворения полученную смесь добавляют к 4 мл физиологического раствора; б) если же комплексной сыворотки нет, то ее можно приготовить самим путем смешивания типовых сывороток, каждую из которых предварительно растворяют в 1 мл физиологического раствора. Затем их смешивают и к смеси добавляют необходимое количество физиологического раствора в зависимости от имеющегося количества типовых сывороток и требуемого разведения (1:5 или 1:10).

Например. При приготовлении смеси из 4 типовых сывороток предварительно растворяют каждую из них в 1 мл и после смешивания добавляют соответственно 1 мл физиологического раствора для получения разведения (1:5) или 6 мл (1:10).

Степень разведения зависит от титра сыворотки: чем он выше, тем разведение делается больше. Ориентировочная реакция считается положительной, если в течение 1 - 2 минут появляются крупные, ясно выраженные хлопья при отсутствии их в контроле (физиологическом растворе). Вне зависимости от полученного результата, положительного или отрицательного, оставшаяся часть колонии отвивается на две пробирки косого агара.

Третий этап. После суточного роста при 37° культуру с одной пробирки косого агара окрашивают по Граму, микроскопируют и вновь проверяют на стекле в капле комплексной сыворотки. Если она дает четкую агглютинацию при отсутствии таковой в контроле с физиологическим раствором, то определяют ее тип в реакции на стекле с каждой типовой OB-сывороткой, входящей в состав комплексной (026, 055, 0111, 145 и других при наличии их).

Наряду с серологической идентификацией устанавливаются и биохимические свойства по обычной методике, для чего чистую культуру грамотрицательных, неспорообразующих палочек пересевают на пестрый ряд: косой агар, среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, нитратную среду Симонса, бульон Хоттингера и в столбик полужидкого агара для определения подвижности. Полужидкий агар одновременно можно использовать, так же как и бульон Хоттингера, для определения сероводорода и индола, помещая под пробки полоски фильтровальной бумаги, смоченные соответственно насыщенным раствором уксуснокислого свинца и 12% водным раствором щавелевой кислоты <1>.

--------------------------------

<1> В дальнейшем этот столбик с культурой может быть использован для более длительного сохранения данного штамма, если его залить стерильным вазелиновым маслом.

Биохимические свойства бактерий группы кишечной палочки представлены в таблице.

Вторая пробирка культуры на косом агаре используется для постановки развернутой агглютинации, которая ставится с сывороткой, давшей положительную реакцию агглютинации на стекле, с целью точной серологической идентификации O-антигена.

Развернутую агглютинацию с живой и гретой культурами ставят по общепринятой методике. Суточная культура смывается 3 - 4 мл стерильного физиологического раствора; смыв делят на две части, из которых одна часть прогревается в водяной бане при 100° в течение часа. Готовят два ряда разведений сывороток, начиная с разведения 1:50 до предельного O-титра данной сыворотки.

В пробирки первого ряда добавляют 1 - 2 капли живой культуры, в пробирки второго ряда - такое же количество культуры, прогретой на водяной бане при 100° в течение часа. В качестве контролей используются исследуемые культуры в физиологическом растворе (контроль культуры) и сыворотка в ее наименьшем разведении без антигена (контроль сыворотки).

Пробирки тщательно встряхивают и ставят в термостат на 37°. Через 2 часа пробирки с живой культурой вынимают и оставляют при комнатной температуре. На следующий день (через 18 - 20 часов) вынимают из термостата пробирки с гретой культурой и производят учет реакции как с живой, так и с гретой культурами.

Характер агглютинации с OB-сывороткой выражается следующим образом: при добавлении живой культуры - в первых разведениях осадок плотный, комковидный, в последующих - агглютинат зернистый (B-агглютинация). Агглютинация с живой культурой учитывается невооруженным глазом.

Обозначения: к - образование кислоты, г - образование газа.

При добавлении гретой культуры - агглютинат зернистый или мелкозернистый (O-агглютинация); O-агглютинация читается при помощи агглютиноскопа или лупы.

Если бактерии содержат B-антиген, тогда живая культура агглютинирует в низком титре (до 1:800), а гретая - в высоком титре (1:1600, 1:3200 и т.д.).

В тех случаях, когда живая и гретая культуры агглютинируются в одинаково высоких титрах, можно считать, что испытуемая культура лишена B-антигена и агглютинация живой культуры также обусловлена O-антигеном.

Реакция агглютинации считается положительной при ясно выраженной агглютинации гретой культуры до полного или до половины титра сыворотки. Если гретая культура не агглютинируется или агглютинируется слабо, результат считается отрицательным.

Если агглютинация дала положительный результат с двумя и более типовыми сыворотками, то тип кишечной палочки будет соответствовать той сыворотке, с которой агглютинация имела место до предельного титра или до более высокого титра по сравнению с другими сыворотками.

В тех случаях, когда исследуемая культура агглютинируется одновременно несколькими сыворотками до одинакового или почти одинакового титра, применяют метод адсорбции агглютининов по Кастелляни.

При исследовании материалов по поводу пищевых отравлений на бактерии группы кишечной палочки большое значение для подтверждения их роли как этиологического фактора имеет реакция агглютинации выделенных штаммов кишечной палочки с сывороткой крови пострадавших. При этом используются культуры, дающие как положительную, так и отрицательную реакцию агглютинации с имеющимися типовыми сыворотками патогенных бактерий группы кишечной палочки. Реакция агглютинации должна быть прослежена в динамике, поэтому ее ставят на 1 - 3-й день заболевания (анамнестическая), а затем на 7 - 10-й день и повторно на 15 - 18-й день от начала заболевания. Кроме того, для выявления падения титра агглютинации можно рекомендовать постановку реакции агглютинации еще раз на 28 - 30-й день.

Кровь у больного берут в количестве 2 - 3 мл из вены (можно из пальца), а у маленьких детей из пятки. После свертывания крови из полученной сыворотки готовят разведение от 1:50 до 1:3200 и более. Антигеном служат суточные агаровые культуры выделенных бактерий группы кишечной палочки, проверенные биохимически и серологически.

Техника постановки реакции агглютинации с живой и гретой культурами такая же, как и при определении серологических свойств выделенных штаммов (см. третий этап). Реакция считается положительной при наличии агглютининов в разведении сыворотки не менее чем 1:200 и при отсутствии их в тех же титрах у здоровых людей (5 - 10 человек).

На основании полученных данных - морфологических, биохимических и серологических - производится оценка результатов исследования и дается ответ. При этом решающую роль играет не только принадлежность микробов к патогенным серотипам, а весь комплекс свойств выделенных штаммов: морфологических, биохимических, а также реакция агглютинации с сывороткой крови больных. Причиной пищевых отравлений могут быть как известные патогенные серотипы кишечной палочки, так и не типируемые имеющимися сыворотками патогенных кишечных палочек.

Если выделенная культура по морфологическим, биохимическим, серологическим свойствам соответствует определенному типу бактерий группы кишечной палочки, то дается заключение об обнаружении бактерий этой группы с указанием их типа. При этом необходимым условием для такого заключения является установление идентичности культур, выделенных из пищевых продуктов и от больных.

Во всех сомнительных случаях выделенные культуры (в том числе и не типируемые имеющимися сыворотками) должны быть направлены для идентификации в один из следующих институтов: Институт питания АМН СССР (Москва, Погодинская ул., д. N 10), Институт вакцин и сывороток имени Мечникова (Москва, пер. Мечникова, д. 5а) и санитарно-бактериологическую лабораторию Института имени Пастера (Ленинград, ул. Мира, д. 12а).

Первый этап. 1. Прямой посев материала (1 - 2 капли жидкого или основного разведения плотного) производят в конденсационную воду свежескошенного агара (метод Шукевича).

2. Посев исследуемого материала в среды обогащения (МПБ, Мюллера, Кауфмана, Киллиана) в количестве 0,5 мл. Посевы помещают в термостат при 37° на 24 - 48 часов.

Второй этап. Производят просмотр посевов на скошенном шаре сначала через 24 часа, затем через 48 часов. Рост протея обнаруживается в виде тонкого всползающего налета на поверхность среды.

Если палочка протея не выделена при прямом посеве, то делают высев со сред обогащения в конденсационную воду свежескошенного МПА и выращивают в течение 18 - 24 часов при 37°.

Третий этап. При наличии культуры протея изучают морфологию с окраской по Граму, подвижность и биохимические свойства.

Обозначения: к - образование кислоты, г - образование газа.

Кроме определения культурально-биохимических свойств выделенных штаммов, иногда требуется проверка их патогенности путем введения взвеси культуры протея в физиологическом растворе через рот мышам. Введение патогенных культур вызывает гибель их через 3 - 14 часов при нормальном состоянии контрольных мышей, не получивших культуры протея.

Для оценки степени обсеменения пищевого продукта бактериями группы протея определяют их количественное содержание.

Для этой цели определяют титр протея путем посева в конденсационную воду свежескошенного агара (посев по Шукевичу) по 0,1 мл различных разведений (до 10^-5; 10^-6), приготовленных из исследуемого материала.

Посевы выращивают в термостате при 37° в течение 24 - 48 часов.

Через сутки на поверхности агара виден всползающий вверх вуалеобразный рост протея.

Титр определяется по наименьшему количеству засеянного продукта, в котором обнаружен рост протея.

Наряду с H-формой протея, дающей ползучий (вуалеобразный) рост, протей может развиваться и в виде изолированных колоний O-формы.

Колонии O-формы обычно растут на средах, содержащих соли желчных кислот (например, бактоагар Ж) и затрудняют обнаружение протея. Для получения из такой O-формы колоний H-формы одну каплю предварительно засеянной суточной бульонной культуры протея наносят на поверхность 1,5% МПА и центр чашки Петри. Через 16 - 18 часов инкубирования в термостате при 37° наблюдается феномен "роения" - поверхность агара покрывается тонким налетом с голубоватым оттенком.

Бактерии Моргана могут быть выявлены на тех же средах, которые указаны для обнаружения всех остальных бактерий кишечной группы (среда Эндо, Левина, Плоскирева).

При наличии в исследуемом объекте значительного количества бактерий Моргана колонии их могут быть обнаружены при прямом посеве исследуемого материала на плотные питательные среды. При незначительном количестве микробы могут быть выделены из среды накопления (среда Мюллера, Кауфмана, Киллиана).

На плотных дифференциальных средах бактерии Моргана растут в виде прозрачных блестящих нежных колоний, мало отличающихся от колоний бактерий группы салмонелл.

Идентификация бактерий Моргана производится на основании морфологических, биохимических и серологических свойств.

По морфологическим свойствам бактерии Моргана представляют собой маленькие, тонкие, нежные, грамотрицательные подвижные палочки.

Биохимические свойства приведены в таблице.

Обозначения: к - образование кислоты, г - образование газа.

Для окончательной идентификации выделенных культур рекомендуется применять реакцию агглютинации с сывороткой Моргана.

В серологическом отношении бактерии Моргана делятся на две группы, условно обозначенные - A (с тремя типами) и B.

Применяя поливалентную сыворотку, можно установить группу бактерий Моргана; при помощи типовых сывороток определяется тип этих бактерий.

Ввиду частоты находок бактерий Моргана в пищевых продуктах и выделениях этиологическую роль их при пищевой токсикоинфекции следует считать только в случаях положительной реакции агглютинации выделенных штаммов с сывороткой пострадавших, прослеженной в динамике.

К 100 мл расплавленного мясо-пептонного агара (pH 7,4 - 7,6) и охлажденного примерно до 70° добавляется: а) 0,5 г лактозы, растворенной в 5 мл дистиллированной воды и прогретой на водяной бане при 100° в течение 5 минут; б) смесь фуксина с сульфитом натрия, приготовленная следующим образом: 0,5 г сульфита натрия растворяют в 5 мл стерильной воды и кипятят; к 0,5 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина добавляют небольшое количество раствора сульфита натрия до того момента, пока жидкость не станет слегка розовой. Тщательно смешав все ингредиенты с агаром, последний разливают в чашки и подсушивают. После застывания среда почти бесцветна или имеет розоватый оттенок. Среду Эндо готовят по мере необходимости в день использования или на 1 - 2 дня впрок. Неиспользованные среды должны храниться в темном прохладном месте.

Среду из сухого агара Эндо приготовляют следующим образом: 5 г порошка всыпают в 100 мл холодной дистиллированной воды, взбалтывают и дают набухнуть агару в течение 5 минут. Расплавляют смесь при нагревании, не допуская пригорания, и кипятят в течение 5 минут. Среду фильтруют, охлаждают до 50° и разливают в чашки. Если среда не используется тотчас после приготовления, то ее следует стерилизовать при 110 - 112° в течение 15 - 20 минут.

К 100 мл мясо-пептонного агара (pH 7,2) прибавляют 0,2 г двузамещенного фосфорнокислого калия (K₂HPO₄), 5 мл 20% простерилизованного в течение часа при температуре 100° раствора лактозы, 2 мл 2% водного раствора эозина и 2 мл 0,5% водного раствора метиленовой синьки. Растворы красок готовят на дистиллированной воде и стерилизуют дробно или при 112° в течение 20 минут.

Сухая среда Левина готовится так же, как среда Эндо.

Сухого порошка бактоагара Ж - 8 г, а бактоагара Плоскирева 6 г всыпают в колбу со 100 мл холодной дистиллированной воды, тщательно разбалтывают до полного смачивания порошка водой, нагревают при помешивании на открытом огне с асбестовой сеткой до полного расплавления агара, затем кипятят в течение 2 - 3 минут (если требуется, фильтруют); горячую среду сразу же разливают в чашки Петри слоем 4 - 5 мм. Чашки с разлитой средой оставляют открытыми примерно на один час для остывания и подсушивания, после чего закрывают и используют для посева (воздушная микрофлора в первые сутки обычно роста не дает). Посевного материала надо вносить в эти среды в 5 - 10 раз больше, чем в среды Эндо или Левина.

В 100 мл дистиллированной воды всыпают 6 г порошка, смесь взбалтывают в течение 2 минут, нагревают до полного расплавления и кипятят в течение 2 минут при легком взбалтывании. Среду охлаждают до 50° и разливают по чашкам. Готовая среда зеленовато-желтоватого цвета.

На 950 мл дистиллированной воды берут 40 г сухого питательного агара с индикатором ВР <1> и лактозой и 5 г сухого питательного агара. Смесь растворяют при нагревании до кипения; затем в 50 мл дистиллированной воды растворяют 1 г глюкозы и добавляют к смеси. Разливают в стерильные пробирки по 5 - 6 мл и стерилизуют текучим паром 3 раза по 30 минут. Среду скашивают так, чтобы нижняя часть оставалась столбиком, а верхняя - в виде косого агара.

--------------------------------

<1> Индикатор ВР представляет собой смесь розоловой кислоты и краски водной голубой.

Среду Ресселя с маннитом и сахарозой готовят по такому же принципу: на 950 мл дистиллированной воды берут 40 г сухого питательного агара с индикатором ВР и сахарозой и прибавляют 1 г маннита, растворенного в 50 мл дистиллированной воды.

В 100 мл горячей стерильной дистиллированной воды растворяют 4 г сухой среды Ресселя с лактозой и индикатором ВР, 0,1 г глюкозы и 1 г мочевины; полученный раствор разливают в пробирки и стерилизуют текучим паром в течение 15 минут. Среду скашивают, как указано выше.

В мясо-пептонный бульон (50 - 100 мл), разлитый в колбочки или флаконы, прибавляют 10% бычьей желчи и 1% маннита (последний можно заменить 2% глюкозы), после чего добавляют кислый фуксин до образования розовой пены.

В колбочки (или флаконы) опускают газоулавливающие трубочки (поплавки).

Колбочки со средой стерилизуют в автоклаве в течение 20 минут при 115°; при этом воздух из трубочек вытесняется и они заполняются прозрачной питательной средой желтоватого цвета.

К 90 мл стерильного бульона добавляют:

а) 4,5 г мела, предварительно взвешенного и простерилизованного сухим жаром.

б) 10 мл раствора гипосульфита (50 г чистого кристаллического гипосульфита в 100 мл дистиллированной воды стерилизуют текучим паром).

в) 2 мл раствора Люголя (металлического йода 25 г, йодистого калия 20 г, дистиллированной воды 100 мл).

При добавлении указанных ингредиентов смесь взбалтывают, разливают по 10 - 15 мл, после чего производят посев.

К 100 мл среды Мюллера прибавляют 1 мл водного (1:1000) раствора бриллиант-грюна и 5 мл стерильной бычьей желчи. Смесь хорошо взбалтывают.

К 100 мл обычного стерильного бульона перед употреблением добавляют 1 мл водного раствора бриллиант-грюна (1:1000). Водный раствор 1:1000 готовят из 1% спиртового раствора.

К 800 мл бульона добавляют 200 мл нативной желчи (pH 4,6). Стерилизация при 120° 30 минут.

К свежему снятому молоку прибавляют равное количество воды и затем лакмусовую настойку до получения сиреневого цвета. Разливают, дробно стерилизуют.

Для приготовления лакмусовой настойки продажный лакмус растирают в порошок и в течение 3 суток экстрагируют в термостате при 37° 10-кратным объемом 96° спирта. Спирт сливают, осадок высушивают, к нему приливают 10-кратное количество дистиллированной воды, настаивают в течение 3 суток при комнатной температуре и фильтруют. Полученную настойку следует хранить в темном месте.

а) Пептона 1 г, б) хлористого натрия 0,5 г, в) углевода или многоатомного спирта 0,5 г, г) индикатора Андреде 1 мл, д) дистиллированной воды 100 мл.

В среду Гисса с лактозой и сахарозой вводят эти углеводы по 0,5 г. Среду разливают в пробирки с поплавками, стерилизуют дробно. Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета, без розового оттенка.

Приготовление индикатора Андреде: кислого фуксина 0,5 г, 4% раствора едкого натра 16 мл, дистиллированной воды 100 мл. Стерилизуют при 110 - 112° в течение 5 минут и хранят в темноте.

К 100 мл бульона прибавляют 5 капель насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 1 мл глицерина и 2 мл свежеприготовленного 10% раствора сернистокислого натрия. Разливают в пробирки по 5 - 6 мл, стерилизуют при 110 - 112° в течение 10 - 15 минут. Среда золотисто-желтого цвета.

Жидкая среда. Хлористого натрия 0,5 г, хлористого аммония 0,6 г, двузамещенного фосфорнокислого калия 0,25 г, лактозы 0,5 г, индикатора Андреде 1 мл, дистиллированной воды 100 мл. После растворения разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при 110 - 112° в течение 20 минут.

Плотная среда. Хлористого натрия 0,5 г, хлористого аммония 0,6 г, двузамещенного фосфорнокислого калия 0,3 г, лактозы 0,5 г, дистиллированной воды 25 мл. К раствору солей прибавляют 2 г агара, растворенного в 75 мл дистиллированной воды, и 1 мл индикатора Андреде. Разливают в пробирки, стерилизуют при 110 - 112° в течение 20 минут и скашивают.

Хлористого натрия 0,5 г, двузамещенного фосфорнокислого калия 0,25 г, триптофана 0,25 г, дистиллированной воды 100 мл; после полного растворения (можно подогревать до кипения) среду разливают по 2 - 3 мл в пробирки и стерилизуют 40 минут при 100°.

Фосфорнокислого натрия аммония 1,5 г, одноосновного фосфорнокислого калия 1 г, сернокислого магния 0,2 г, лимоннокислого натрия 2,5 г, дистиллированной воды 1000 мл, агара 20 г.

Установить pH 6,8 - 7; стерилизация при 120° в течение 15 минут. К незастывшей среде добавить 1 мл 0,5% спиртового раствора бромтимолблау. Среду разливают стерильно в пробирки (стерильные) и скашивают.

Реакция Вейль-Легаля. К 8 - 10-часовой культуре на среде Строгова (или к суточной культуре бульона Хоттингера) прибавляют 5 - 10 капель 5% раствора нитроируссидного натрия и несколько капель 30% раствора едкого натра. При наличии индола появляется бурое окрашивание, переходящее в синее от прибавления нескольких капель (10 - 15) 80% уксусной кислоты.

Реакция Эрлиха. К суточной культуре на обычном бульоне или бульоне Хоттингера прибавляют 2 мл эфира и тщательно встряхивают в течение 3 - 5 минут, после чего осторожно по стенке приливают 4 - 5 капель реактива Эрлиха. При наличии индола в пограничном слое образуется красное кольцо не позднее чем через 5 минут. Необходимо ставить контроль с незасеянной средой.

Реактив Эрлиха: парадиметиламидобензолальдегида 2 г, 96% этилового спирта 50 мл, соляной кислоты (удельный вес 1,19) 50 мл.

Определение индола индикаторными бумажками. Определение индола можно также производить с помощью индикаторных бумажек, помещаемых под пробки засеянных испытуемыми культурами пробирок с обычным бульоном или бульоном Хоттингера. Для изготовления индикаторных бумажек фильтровальную бумагу смачивают тепловатым реактивом Эрлиха или горячим водным насыщенным (12%) раствором щавелевой кислоты; бумагу высушивают в термостате и нарезают полосками шириной 0,5 см. При наличии индола нижняя часть бумажки, смоченная реактивом Эрлиха, приобретает сиренево-розовый цвет до интенсивного малинового, а бумажка, смоченная щавелевой кислотой, розовый цвет: окрашивание наступает через 1 - 3 дня при инкубации культуры в термостате при 37°.

Первый этап. Исследуемый материал непосредственно или после соответствующей обработки (растирание, приготовление 10% взвеси) засевают последовательно на две плотные питательные среды: молочно-солевой и кровяной агар. Посев производят путем тщательного втирания шпателем двух капель посевного материала на поверхность чашки с молочно-солевым агаром; этим же шпателем переносят материал на поверхность чашки с кровяным агаром. Одновременно производят посевы на среды обогащения: солевой бульон с 6,5% хлористого натрия, солевой бульон с 10% хлористого натрия и сахарный бульон с 1% глюкозы. Засевают не более 1/10 объема питательной среды. Все посевы помещают в термостат при 37° на 18 - 24 часа.

При исследовании продуктов, содержащих большие количества соли (сельди, кильки и др.), посевы на солевые среды не производят.

При исследовании продуктов с большим содержанием сахара (крем, мороженое и др.) посевы на сахарный бульон не производят.

Второй этап. а) Через 16 - 24 часа посевы на чашках просматривают, отмечают колонии, характерные для стафилококков: на кровяном агаре - крупные с ровными краями и зоной гемолиза; на молочно-солевом агаре - колонии большей частью золотистого или кремового, реже - лимонно-желтого и эмалево-белого цвета.

Из отдельных типичных колоний готовят препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении мелких грамположительных кокков колонии отсевают на сектора чашек с кровяным агаром для получения чистой культуры и проверки гемолизирующих свойств. Чашки помещают на 18 - 24 часа при 37°.

Примечание. Посевы на молочно-солевом агаре после инкубации при 37° следует выдерживать еще 48 часов при комнатной температуре, так как повышенное содержание поваренной соли в данной среде оказывает часто задерживающее влияние не только на сопутствующую микрофлору, но и на рост стафилококков.

б) Независимо от наличия на плотных средах, подозрительных на стафилококки, колоний производят посевы со сред обогащения также на сектора чашек с кровяным агаром.

Посевы выращивают при 37° в течение 18 - 24 часов.

При отсутствии роста через 24 часа производят вторично высевы на кровяной агар с солевых бульонов.

Третий этап. Изучают культуры, выделенные с плотных сред на сектора кровяного агара (см. второй этап): а) готовят препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют; при микроскопии устанавливают морфологию культуры и проверяют ее чистоту; б) отмечают наличие или отсутствие гемолиза; в) ставят реакцию коагуляции плазмы.

Реакция коагуляции плазмы: свежеполученную кровь (от кролика или человека) смешивают со стерильным 5% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 1:5 и тщательно перемешивают. После центрифугирования или отстаивания на холоде плазму отсасывают и разводят физиологическим раствором. На одну часть плазмы добавляют 4 части физиологического раствора. Разведенную плазму разливают в стерильные пробирки с пробками по 0,5 мл и вносят по одной петле суточной агаровой культуры. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной в качестве контрольной. Пробирки ставят в термостат при 37°. Результаты учитывают через 1, 2, 3 - 24 часа.

При отсутствии коагулазоположительных стафилококков на плотных средах изучают колонии, выделенные со сред обогащения, как это описано выше (третий этап).

Патогенные стафилококки коагулируют плазму крови и обычно обладают гемолизирующими свойствами. Однако признак гемолиза для патогенных стафилококков не является постоянным и может зависеть от используемой крови. Известно, что эритроциты человеческой крови, применяемой в большинстве практических лабораторий, более устойчивы к воздействию стафилококкового гемолизина, чем кроличьи. Гемолиз надежнее выявляется при выращивании стафилококков на кровяном агаре в атмосфере CO₂. Методика выращивания стафилококков в атмосфере CO₂ описана ниже.

Для оценки результатов исследования на стафилококки при пищевых отравлениях может иметь значение степень обсеменения ими исследуемых объектов. Степень обсеменения устанавливается при прямом посеве материала на плотные среды. Принято отмечать: "массивный рост колоний", "рассеянный рост", "рост единичных колоний". При отсутствии роста на плотных средах обнаружение стафилококков со сред обогащения оценивается как рост единичных колоний.

При оформлении протокола исследования необходимо указывать основные свойства выделенных стафилококков. В качестве примера можно рекомендовать следующую формулировку ответа: "Выделен коагулазоположительный стафилококк, образующий гемолиз и обладающий золотистым пигментом. Массивный рост колоний при прямом посеве".

Биологическое исследование проводят для выявления наличия стафилококкового энтеротоксина в продуктах и для изучения способности культур стафилококков образовывать энтеротоксин на питательных средах. В качестве экспериментальных животных могут быть использованы котята (1 1/2 - 2-месячные) и взрослые кошки.

Биопроба на котятах. Исследуемый продукт или пятисуточную молочную культуру выделенного стафилококка (15 - 20 мл) скармливают котятам натощак. Если данный продукт котята не едят, следует приготовить взвесь продукта в дистиллированной воде (1:1), анализируемый материал хорошо растереть и споить при помощи пипетки или ложки по 15 - 20 мл каждому котенку. В опыте должно быть 2 - 3 котенка.

Положительной реакцией будет считаться рвота, наступившая через 30 - 60 минут, иногда понос и общая прострация. Рвота, появляющаяся через 5 - 10 минут, неспецифична. Котят наблюдают в течение 4 - 5 часов. Если за этот период времени котята не реагируют, биологическая проба считается отрицательной.

Биопроба на кошках. Метод внутривенного введения материала взрослым кошкам удобен и достаточно чувствителен. Однако недостатком метода является ограниченность его применения для обнаружения энтеротоксина непосредственно в продуктах.

Для получения энтеротоксина пользуются 0,75% агаром на телячьем бульоне или бульоне Хоттингера с 0,25% глюкозы (pH = 7,0). Чашки, засеянные культурами стафилококков, помещают в эксикатор с 20% CO₂ и ставят на двое суток в термостат при 37°.

Чтобы получить в эксикаторе 20% CO₂, насыпают на дно последнего двууглекислой соды из расчета 1 г соды на каждый литр объема эксикатора. Загружают его чашками и, немного приоткрыв крышку, наливают пипеткой Мора 10% соляную или серную кислоту непосредственно на соду (на 1 г соды 8 - 9 мл кислоты). После добавления кислоты крышку эксикатора быстро закрывают и притирают.

Через 2 суток чашки вынимают и на поверхность агара наливают 10 мл физиологического раствора, агар раздавливают шпателем до равномерной кашицеобразной консистенции и оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Экстракт помещают в пробирки и центрифугируют на центрифуге с 2000 - 3000 об./мин. до получения прозрачного слоя, который отсасывают. Полученный центрифугат стафилококковой культуры прогревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут и вводят кошкам без анестезии в вену уха или бедренную вену в количестве 0,5 мл на 1 кг веса.

Наличие рвоты и поноса или только рвоты, наступившей в сроки от 30 минут до 3 часов, указывает на присутствие энтеротоксина. Каждую кошку можно использовать 3 - 4 раза. При получении отрицательных результатов у кошки, которая ранее была использована для аналогичных определений, необходима проверка на кошке, не бывшей ни разу в опыте.

В настоящее время при помощи метода внутривенного введения кошкам можно решать вопрос о наличии энтеротоксина только в некоторых пищевых продуктах (консервы-шпроты, треска в масле, крем, манная молочная каша). Исследуемый продукт разводят водой 1:1, взвесь центрифугируют в течение 1 - 1 1/2 часов при 2000 - 3000 об./мин., центрифугат отсасывают, прогревают 30 минут в кипящей водяной бане и вводят в вену кошке в количестве 0,5 - 1 мл на 1 кг веса.

В качестве контроля используют кошку, которой до постановки опыта на энтеротоксин внутривенно вводят тождественный продукт, обработанный таким же образом.

Заключение об этиологической роли стафилококков при пищевых отравлениях дается на основании комплекса следующих данных:

а) материалов эпидемиологических расследований,

б) клинической картины заболевания,

в) лабораторных данных (свойств выделенных культур и результатов биопробы).

Примечание. В качестве вспомогательного метода при установлении этиологической роли стафилококков весьма перспективен метод фаготипирования стафилококков, широкое использование которого может быть рекомендовано при условии серийного выпуска типовых стафилококковых фагов и применения специально разработанной инструкции, утвержденной Министерством здравоохранения СССР.

К 100 мл расплавленного и остуженного до 45° мясо-пептонного агара (или агара Хоттингера), содержащего 6,5% хлористого натрия (pH = 7,4), добавляют ex tempore 10 мл стерильного обезжиренного молока. Среду разливают по чашкам, чашки можно хранить в холодильнике 2 - 3 дня.

Мясо-пептонный агар с 1% глюкозы расплавляют в кипящей водяной бане и охлаждают до 45 - 50°. Прибавляют 5% кроличьей или человеческой крови, тщательно перемешивают и немедленно разливают в стерильные чашки. Чашки подсушивают в термостате при 37° в течение 20 - 30 минут.

Санитарно-бактериологическое значение имеют: Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius и энтерококк.

Выделение стрептококков следует производить по следующей методике.

Первый этап. Посев материала производят в количестве 1 - 2 капель (разведенного или из основного разведения):

а) На кровяной агар методом глубинного посева. Материал в количестве 0,1 - 0,5 мл вносят в стерильную чашку Петри и заливают кровяным агаром с последующим тщательным размешиванием вращательными движениями чашки Петри. Параллельно можно произвести посев на среду Гарро с последующим тщательным втиранием шпателем в поверхность питательной среды (прямые посевы).

б) В сахарный бульон (среда обогащения). Оба посева выращивают при 37° в течение 18 - 24 часов.

Второй этап. а) Просмотр посевов в кровяном агаре и на среде Гарро. Высев мелких точечных колоний с гемолизом, с зоной позеленения в сахарный бульон. Из глубины кровяного агара рекомендуется снимать колонии тонко оттянутой пастеровской пипеткой.

б) Высев с сахарного бульона на кровяной агар. Посевы выращивают при 37° в течение 18 - 24 часов.

Третий этап. а) Изучение бульонной культуры в препаратах в раздавленной капле (в живом состоянии) и в фиксированном препарате с окраской по Граму. Если культура чистая, то производят дальнейшее изучение.

При подозрении на загрязнение бульонной культуры посторонней микрофлорой производят рассев на кровяной агар с последующим высевом на сахарный бульон отдельных колоний для получения чистой культуры.

б) Если не удалось выделить культуру стрептококка с прямого посева, то для этой цели используют высев на кровяном агаре из среды накопления. Выделяют отдельные колонии на сахарный бульон с последующим их изучением и идентификацией.

В результатах анализа обычно указывают, какой вид стрептококка выделен, при каком посеве (прямой или со среды обогащения).

Если при прямом посеве, то указывают степень обсеменения колониями стрептококка (массивный рост, рассеянные или единичные колонии при прямом посеве).

Идентификацию выделенных стрептококков рекомендуется производить по следующим дифференциальным признакам:

Примечание. Изучают культуры стрептококков на сахарном бульоне в течение 18 - 24 часов роста при 37°.

1. Морфология изучается в живом состоянии в раздавленной капле и в фиксированном препарате, окрашенном по Граму. Все стрептококки красятся по Граму положительно. В жидких средах Str. pyogenes и Str. salivarius образуют длинные цепочки, энтерококки - короткие.

2. Культуральные свойства: а) характерный рост на кровяном агаре, стрептококки (Str. pyogenes) образуют четкую зону гемолиза, по ширине в 3 раза превышающую диаметр колонии. Str. salivarius образуют зону позеленения различной интенсивности, энтерококки - серовато-оливковую зону, позеленение или небольшую зону гемолиза; б) на сахарном бульоне гемолитические стрептококки и Str. salivarius растут придонно или пристеночно, оставляя бульон прозрачным, энтерококки дают диффузное помутнение.

3. Ферментативные свойства (гемолитические и зеленящие стрептококки не сбраживают маннит, энтерококки разлагают его с образованием кислоты.

4. Рост на желчно-кровяном агаре (среда Беленького и Поповой). Гемолитический стрептококк и Str. salivarius не растут, энтерококк хорошо растет в виде отдельных колоний.

5. Рост на молочно-солевом агаре (среда Петрович). Гемолитический стрептококк и Str. salivarius не растут, энтерококк дает хорошо видимый рост.

6. Устойчивость к действию фтористого натрия (Кускова) на кровяном агаре с добавлением 0,04% фтористого натрия: растут энтерококки и не растут гемолитический стрептококк и Str. salivarius.

7. Рост на сахарном бульоне при 45°. Гемолитический стрептококк не дает роста, энтерококк и Str. salivarius растут в этих условиях.

8. Редукция метиленового синего (Шерман (Sherman)). В стерильное снятое молоко, разлитое по 5 мл в пробирки ex tempore, добавляют 0,1 мл 1% водного раствора метиленового синего, тщательно смешивают и вносят 0,1 мл суточной бульонной культуры стрептококков. Посев помещают на 18 - 24 часа при 37°. Энтерококки редуцируют метиленовый синий, гемолитический стрептококк и Str. salivarius оставляют краситель без изменений.

9. Реакция на фибринолизис (Тилле и Гарнер (Tillet и Garner)).

В стерильные пробирки с ватными пробками разливают по 1 мл плазмы (кролика или человека), разведенной физиологическим раствором в отношении 1:5 (1 мл плазмы крови + 4 мл физиологического раствора). Затем добавляют 0,5 мл суточной бульонной культуры стрептококков и 0,5 мл 0,25% раствора хлористого кальция. Все тщательно смешивают и ставят в термостат при 37°. В качестве контроля используют:

а) пробирку с 1 мл плазмы, разведенной физиологическим раствором 1:5, и 0,5 мл 0,25% раствора хлористого кальция.

б) к 1 мл плазмы, разведенной физиологическим раствором 1:5, добавляют 0,5 мл бульона (вместо культуры) и 0,5 мл 0,25% раствора хлористого кальция.

Все пробирки помещают при 37° и отмечают время полной коагуляции плазмы, которая обычно наступает в течение 15 минут. С этого момента следят за ходом растворения сгустка плазмы и отмечают время полного лизиса. Растворение сгустка должно наступить примерно через сутки. В контрольных пробирках сгусток должен остаться неизменным. При более длительной инкубации (приходится принимать во внимание тенденцию фибрина к спонтанному лизису, а также избегать бактериального загрязнения (обязательны пробирки с пробками), так как известно, что многие бактерии и среди них proteus vulgaris и Bac. subtilis обладают способностью растворять сгусток плазмы.

Гемолитический стрептококк лизирует сгусток фибрина, Str. salivarius оставляет его без изменений, энтерококк либо не изменяет сгусток, либо сгусток совсем не образуется.

Примечание. При суточном посеве бульонной культуры на плотные дифференциальные среды рекомендуется в начале штриха с петли снять излишек бульона, так как рост стрептококков по линии штриха на дифференциальных средах иногда бывает за счет нанесенного излишка бульона.

При наличии групповых сывороток производят реакцию преципитации с полученным из стрептококков антигеном.

Получение солянокислого антигена. 1. Посев культуры в пробирку с 5% кровяным бульоном; 37° на 18 - 24 часа.

2. Высев из 5% кровяного бульона пастеровской пипеткой в пробирку с сахарным бульоном; 37° на 6 часов.

3. Культуру на сахарном бульоне пересевают в 100 мл сахарного бульона; 37° на 18 часов.

4. 18-часовая культура центрифугируется с двухразовым отмыванием физиологическим раствором.

5. К полученному осадку добавляют 2 мл N/20 HCl на физиологическом растворе.

6. Взвесь стрептококков в соляной кислоте помещают в кипящую водяную баню на 15 минут при непрерывном встряхивании пробирок.

7. После прогревания взвесь центрифугируют, прозрачную жидкость осторожно отсасывают, сливают в пробирку, добавляют одну каплю бромтимола синего и осторожно нейтрализуют нормальным раствором едкого натра до зеленоватого оттенка (если выпадет осадок, необходимо отцентрифугировать).

Реакция преципитации. В специальные пробирочки диаметром 4 мм и длиной 30 - 35 мм тщательно промытые спиртом, эфиром и хорошо высушенные, наливают 1 - 2 капли сыворотки, на которую осторожно тонко оттянутой пастеровской пипеткой по стенке наслаивают солянокислый антиген. Пробирки помещают в штатив при комнатной температуре. Положительная кольцепреципитация характеризуется появлением очень тонкого мутновато-белого колечка, хорошо видимого на черном фоне.

К 100 мл обычного мясо-пептонного агара (pH = 7,4) добавляют 5 мл дефибринированной крови (кролика, морской свинки, барана или человека).

К 100 мл кровяного агара в расплавленном виде (pH 7,4) ex tempore добавляют 0,2 мл 0,1% водного раствора генцианвиолета, pH 7,4.

К 100 мл 40% желчного агара (pH 7,4) ex tempore добавляют 5 мл крови.

К 100 мл мясо-пептонного агара добавляют 0,04 г фтористого натрия (pH 7,4), ex tempore добавляют 5 мл крови.

К 100 мл мясо-пептонного агара, содержащего 6,5% поваренной соли, остуженного до 45°, ex tempore добавляют 10 мл снятого стерильного молока (pH 7,4).

К 5 мл снятого стерильного молока ex tempore добавляют 0,1 мл 1% водного раствора метиленового синего.

Молоко кипятят, снимают сливки, разливают в пробирки по 5 и 10 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут.

Пробы, поступающие в лаборатории, исследуются сразу в двух направлениях: во-первых, на наличие ботулинических токсинов, во-вторых, на наличие возбудителей ботулизма.

Эти же пробы должны быть исследованы на группу Cl. perfringens.

Исследуемый продукт в количестве 25 - 30 г тщательно растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором или с дистиллированной водой, а том случае, если продукт соленый (материал легче растирается в присутствии стерильного кварцевого песка). В зависимости от характера (плотности) продукта берется равное или двойное количество физиологического раствора или дистиллированной воды по отношению к весу пробы.

Из растертой пробы 2/3 объема используется для обнаружения ботулинических токсинов и 1/3 - для выделения возбудителей ботулизма.

Та часть пробы, которая исследуется на наличие токсинов, выдерживается в течение 1 - 2 часов при комнатной температуре для экстрагирования токсинов, фильтруется через ватно-марлевый фильтр или центрифугируется при 2500 - 3000 об./мин. в течение 30 минут.

Фильтрование через тальковый фильтр недопустимо, так как тальк адсорбирует на себе ботулинические токсины.

Для обнаружения ботулинических токсинов с полученными фильтратами или центрифугатами ставится реакция нейтрализации токсина антитоксической сывороткой.

Для определения токсина следует взять 4 мышей весом 16 - 18 г. В связи с тем что в исследуемом материале может быть один из 4 встречающихся в СССР типов ботулинических токсинов, то предварительно реакцию необходимо ставить со смесью противоботулинических диагностических сывороток типов A, B, C, E.

Двум мышам вводят исследуемый фильтрат (или центрифугат) в количестве 0,5 - 0,8 мл внутрибрюшинно или внутривенно в хвостовую вену (внутривенно вводят только центрифугат). Другой паре вводят смесь, состоящую из 0,5 - 0,8 мл испытуемого материала и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток типов A, B, C, E (по 0,05 мл сыворотки каждого типа). С этой целью выпускаются сухие типоспецифические диагностические сыворотки, титр которых не менее 1000 АЕ в 1 мл для каждого типа.

Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживается при комнатной температуре в течение 30 минут. Количество исследуемого материала, вводимого животным с сывороткой и без сыворотки, должно быть одинаковым. Наблюдение за животными ведется в течение 4 дней; однако если мыши болеют или погибают раньше этого срока, то тут же ставится реакция нейтрализации с моновалентными сыворотками.

При наличии ботулинического токсина погибают 2 мыши, которым вводился не смешанный с сыворотками фильтрат, остальные остаются живы.

Обычно картина болезни и гибели мышей очень характерна: появляется учащенное дыхание, состояние полного расслабления мышц, западение мышц брюшной стенки ("осиная талия"), параличи и судороги перед смертью.

В случае гибели всех 4 мышей, т.е. тех, которым был введен фильтрат без сыворотки и с сывороткой, следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз.

Вместо мышей в опыте могут быть использованы морские свинки. Одной из них вводят подкожно или внутрибрюшинно 0,5 мл смеси сывороток типов A, B, C, E и 3 мл испытуемого фильтрата (или центрифугата); контрольной свинке вводят только 3 мл испытуемого материала.

В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина сразу же ставится развернутая реакция нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками. В 5 пробирок разливают по 2,4 мл исследуемого фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,6 мл сыворотки: в первую пробирку сыворотку типа A, во вторую - типа B; в третью - типа C, в четвертую - типа E, в пятую приливают 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после выдерживания при комнатной температуре в течение 30 минут вводят внутривенно или внутрибрюшинно по 1 мл 2 мышам из каждой пробирки (см. типовой протокол).

Для каждой сыворотки берется отдельный шприц. Учет результатов проводится через 4 - 6 часов, 24 часа и далее на протяжении 4 дней. В случае наличия ботулинического токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, при гибели всех остальных мышей. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.

Например, если гибнут все мыши, кроме тех, которым введено содержимое второй пробирки, то в исследуемом материале будет установлен токсин типа B.

При получении положительной реакции нейтрализации в опытах с диагностическими ботулиническими сыворотками дается заключение о наличии в исследуемом пищевом продукте ботулинического токсина и указывается его тип.

Для обнаружения возбудителей ботулизма проводится посев на жидкие питательные среды. Для первичных посевов лучше использовать казеиново-грибную среду, бульон Хоттингера и пепсин-пептонный бульон с 0,5% глюкозы; необходимо, чтобы pH был в пределах 7,2 - 7,4. Обязательным является также наличие в мясных средах мясного или печеночного фарша, а в казеиново-грибной среде отварного пшена и ваты.

Для выделения возбудителей ботулизма типов A и B наиболее подходящей средой является пепсин-пептонный бульон, а для выделения типов C и E бульон Хоттингера. На казеиново-грибной среде все типы возбудителей ботулизма дают хороший рост и продуцируют токсин значительной силы.

Посевы должны проводиться в среды (во флаконах емкостью по 100 - 200 мл), залитые слоем вазелинового масла толщиной в 1 см. При наличии в лаборатории только мясных сред посев следует производить в два флакона с пепсин-пептоном и в два флакона с бульоном Хоттингера. Перед посевом среды нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 минут; после этого быстро охлаждают и производят посевы. Один флакон с каждой средой после посева прогревается на водяной бане при 80° в течение 20 минут с целью освобождения от посторонней аспорогенной флоры. Если же имеется казеиново-грибная среда, то посев следует проводить в два флакона, один из них прогреть, другой - нет. Для обнаружения возбудителей в пищевых продуктах во флаконы с питательной средой засевают 5 - 10 мл исследуемого материала, растертого с физиологическим раствором.

Все флаконы помещают в термостат при температуре 35 - 37°. Если в процессе исследования будет обнаружен возбудитель ботулизма типа E, то дальнейшее культивирование следует проводить при температуре 28°, как наиболее оптимальной для этого типа.

Если в исследуемом материале возбудители ботулизма находятся преимущественно в вегетативной форме, то рост в посевах будет в основном в непрогретых флаконах. В том же случае, если в материале имеются споровые формы, рост будет в прогретых флаконах и в отдельных случаях может сразу привести к выделению чистой культуры из такого посева.

Все исходные образцы проб следует сохранять на леднике до окончания исследования. Через 48 часов посевы исследуются на наличие возбудителей ботулизма.

Рост Cl. botulinum характеризуется сильным газообразованием и иногда протеолизом кусочков печени или фарша. Стерильно взятые из таких флаконов пробы (10 - 15 мл) подвергаются исследованию. Прежде всего готовят мазки, красят их по Граму или краской для анаэробов (см. приложение - не приводится) и микроскопируют.

С культуральной жидкостью ставится реакция нейтрализации с поливалентной противоботулинической сывороткой типов A, B, C, E. При получении положительных результатов реакцию нейтрализации ставят с каждой сывороткой раздельно. Если через двое суток во флаконах не обнаружен рост Cl. botulinum, то необходимо продолжать инкубацию в термостате, а исследование повторить на 4 - 6-е и 10-е сутки. При обнаружении в исследуемом посеве палочек, типичных по морфологии для Cl. botulinum, а также ботулинического токсина, дается заключение о зараженности исследуемого материала возбудителем ботулизма. Выделение чистой культуры в таком случае не является обязательным.

Если же в посевах обнаруживаются микробы, по морфологическим признакам сходные с Cl. botulinum, а токсин отсутствует, следует провести активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином по описанной ниже методике для обнаружения ботулинического токсина типа E, а также провести выделение и изучение чистой культуры.

Анализы следует проводить во всех случаях заболевания с симптомами, характерными для ботулизма, и во всех случаях гибели людей при подозрении на ботулиническое отравление.

Отбор проб и транспортировка материалов. От больного исследованию подлежат промывные воды желудка, рвотные массы, кровь и кал. Кровь от больного необходимо брать до введения ему лечебной противоботулинической сыворотки.

Кровь у больного берут в количестве 6 - 8 мл из вены в стерильную пробирку. С целью лучшего формирования сгустка кровь нужно обвести по стенкам пробирки капилляром пастеровской пипетки, после чего выдержать в термостате в течение 20 минут. Кровь можно брать также с 4% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 3:1.

Промывные воды желудка берут в объеме 50 - 100 мл, а кал в количестве 50 - 60 г в стеклянные банки, закрывающиеся резиновыми или корковыми пробками; консервирующие вещества добавлять нельзя. На банки с пробами наклеиваются этикетки: какой материал посылается, от кого взят и дата взятия материала. Банки при транспортировке должны быть тщательно упакованы. В сопроводительном документе необходимо указать фамилию, имя, отчество и возраст пострадавшего, дату заболевания, предполагаемый диагноз, кратко изложить клинические симптомы, дату взятия пробы и подпись лица, направляющего пробы. Материал, подлежащий исследованию, должен храниться на холоде, так как ботулинический токсин может разрушаться при комнатной температуре.

Из трупов на исследование необходимо брать кусочек печени весом 50 - 60 г, отрезки тонкого кишечника и желудка с содержимым. В случае подозрения на отравление ботулиническим токсином через дыхательные пути, от трупа на исследование необходимо брать 50 - 60 г легкого, печень, кровь (8 - 10 мл). Взятие проб из органов должно производиться в стерильных условиях; поверхность органа прижигают раскаленным шпателем и затем стерильными ножницами из глубины вырезают кусочек органа. Пробы из каждого органа берут в отдельные банки, закрытые пробками или крышками. На банке указывают фамилию, имя, отчество умершего, название органа, дату взятия материала и подпись лица, отправляющего материал на исследование.

В сопроводительном документе необходимо указать фамилию, имя и отчество, возраст умершего, дату заболевания и дату смерти, кратко изложить симптомы болезни, дату вскрытия, подпись эксперта.

Исследование материалов. Пробы, поступившие в лабораторию, исследуются одновременно по двум направлениям: производится обнаружение ботулинических токсинов и выделение ботулинических микробов. Одновременно эти же пробы должны исследоваться на группу Cl. perfringens.

Обнаружение ботулинических токсинов. Промывные воды желудка при наличии в них комочков пищи растирают в стерильной ступке. Из этой растертой пробы 2/3 объема предназначают для обнаружения ботулинических токсинов, 1/3 - для выделения ботулинических микробов.

Первая часть растертой пробы выдерживается при комнатной температуре в течение часа для экстрагирования. Затем экстракт подвергается фильтрованию через ватно-марлевый фильтр или центрифугированию при 3000 об./мин. в течение 15 - 20 минут. Полученный фильтрат или центрифугат используется для постановки реакции нейтрализации.

Цитратную кровь или сыворотку крови больного без предварительного разведения исследуют на наличие ботулинических токсинов с помощью реакции нейтрализации, причем цитратную кровь можно вводить мышам только внутрибрюшинно.

Для обнаружения токсинов в испражнениях больного берут 10 - 15 г кала, растирают в стерильной ступке с двойным объемом физиологического раствора и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 - 1 1/2 часов для экстрагирования токсинов. Затем жидкость фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют и используют для постановки реакции нейтрализации.

Экстракты из органов трупа приготовляются указанным выше способом.

Реакция нейтрализации ставится по той же методике, что и при исследовании пищевых продуктов.

Обнаружение ботулинических микробов в выделениях больных и органах трупов проводится по методике, изложенной в разделе по исследованию пищевых продуктов.

Посев на высокий столбик агара. Для посева применяется прозрачный 1% агар с глюкозой, приготовленный на мартеновском бульоне, бульоне Хоттингера или пепсин-пептоне, разлитый в пробирки диаметром 0,8 см и длиной 15 - 18 см. Перед посевом агар расплавляют и охлаждают до 45 - 50°. Посев на высокий столбик производят следующим образом: не отламывая конца пастеровской пипетки, погружают ее в исследуемый материал и переносят последовательно из пробирки в пробирку, после чего агар тщательно перемешивают путем перекатывания пробирок между ладонями. Охлажденные пробирки с посевом помещают в термостат при температуре 35 - 37°. На каждый посев следует брать 5 - 8 пробирок столбика агара. В случае, если в первичной культуре рост не очень обильный, при пересеве на высокий столбик пастеровскую пипетку следует обломать и набрать немного культуры в капилляр, а затем проводить посев, как указано выше.

Если в первичном посеве имеется массивный рост посторонней микрофлоры и мало типичных ботулинических палочек со спорами, необходимо взять 5 - 10 мл культуры в пробирку и подвергнуть ее прогреванию на водяной бане при 80° в течение 20 минут. После этого культуру надо снова посеять на высокий столбик агара.

Через 1 - 2 суток в последних пробирках появляются отдельные колонии в виде комочков ваты, пушинок с уплотненным центром или же правильных дисков, чечевичек. Подозрительные колонии перевиваются в пробирку с жидкой или полужидкой питательной средой с 0,5% глюкозы под слоем вазелинового масла. Одновременно оставшаяся часть колонии микроскопируется.

--------------------------------

<1> + большинство штаммов сбраживают углеводы;

<2> +/- сбраживают углеводы только отдельные штаммы;

<3> - очень медленно сбраживают углеводы - в течение 5 - 10 дней.

Обозначения: к - образование кислоты; г - образование газа.

Пересев колоний из пробирок можно производить двумя способами.

Столбик агара прокалывают сверху отломанным капилляром пастеровской пипетки и извлекают нужную колонию или же дно пробирки с высоким столбиком агара слегка подогревают на пламени горелки и под действием паров закипевшей жидкости агар выталкивается в стерильную чашку Петри.

Подозрительную колонию извлекают с помощью отломанного капилляра пастеровской пипетки.

Культуру, выросшую из колонии на жидкой среде, микроскопируют и проверяют на наличие токсина с помощью реакции нейтрализации на мышах.

Посев на чашки. Каплю исследуемой жидкости наносят на поверхность сахарно-кровяного или печеночного агара, разлитого тонким слоем в чашки Петри. Затем шпателем слегка втирают в агар и последовательно переносят еще на 2 - 3 чашки. Чашки помещают в микроанаэростат (различных марок) крышкой кверху и выращивают при температуре 35 - 37°.

С целью поддержания полного вакуума на дно анаэростата ставится открытая чашка Петри со щелочным раствором пирогаллола <1>. Через сутки колонии ботулинического микроба выглядят в виде прозрачных росинок дымчатого цвета диаметром 0,1 - 0,2 см, окруженных зоной гемолиза.

--------------------------------

<1> К 100 мл 70% щелочи добавляют 10 г пирогаллола.

При отсутствии в лаборатории анаэростатов для выращивания анаэробов можно использовать простой чашечный метод, где воздух просто исключается из питательного агара. Метод заключается в следующем: засеянный и слегка охлажденный агар наливают в крышку стерильной чашки Петри, после чего на агар, еще не успевший застыть, помещают вторую половину чашки Петри так, чтобы дно ее плотно соприкасалось с поверхностью залитого агара. Края чашки можно залить парафином. При этом методе поверхность стекла плотно соприкасается с агаром по всей его площади, и в слое агара, находящемся между пластинками стекла, создаются условия, благоприятные для роста самых строгих анаэробов.

Выросшие колонии нужно рассматривать в лупу или в стереоскопический микроскоп МБС-1. Часть колоний используется для приготовления мазков, которые микроскопируются.

С поверхности чашки колонии снимаются петлей или пастеровской пипеткой и засеваются на пробирки с бульоном Хоттингера (0,5% глюкозы). Выросшие посевы проверяются на чистоту путем микроскопирования и на наличие токсина путем титрования и постановки реакции нейтрализации на мышах.

В дальнейшем изучаются биохимические свойства путем посева на соответствующие среды (см. таблицу).

Культуры Cl. botulinum типа E вырабатывают прототоксин, который сам по себе является нетоксичным для животных при внутривенном и подкожном введении.

Поэтому для обнаружения прототоксина применяют метод активации с помощью протеолитических ферментов - трипсина или панкреатина.

Способ приготовления протеолитических ферментов: чистый сухой трипсин растворяется перед употреблением в физиологическом растворе в концентрации 1:100; этот раствор принимается за исходный. Для активации берется данный раствор из расчета 0,5% к объему активируемой культуральной жидкости.

Трипсин может быть заменен сухим медицинским высокоактивным (активность не должна быть менее 50 единиц) панкреатином, раствор которого готовится следующим образом: 4 г панкреатина растворяют в 100 мл физиологического раствора и оставляют в холодильнике при 4° в течение ночи.

Перед употреблением полученную жидкость фильтруют через плотный бумажный фильтр, а затем через фильтр Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости.

Полученный раствор в объеме 0,5 мл не должен убивать белую мышь весом в 17 - 18 г при внутривенном введении. При внутрикожном введении морским свинкам 0,2 мл раствора обычно появляется некроз участка кожи (0,5 x 0,5 см).

Активность препарата рекомендуется предварительно проверить по отношению к известному музейному штамму Cl. botulinum типа E.

Раствор панкреатина может сохраняться при 4° в течение 2 недель. Исследуемая 4 - 5-суточная культура Cl. botulinum, полученная на жидкой мясной или казеиновой среде, подвергается центрифугированию или фильтрованию с целью отделения микробных тел от культуральной жидкости. Готовый раствор трипсина добавляется в концентрации 0,5% к объему культуральной жидкости.

Если вместо трипсина применяют панкреатин, то культуральная жидкость смешивается в равных пропорциях с готовым раствором панкреатина; pH смеси доводят при помощи 10% раствора NaOH до 8,2 - 8,4.

Полученную смесь помещают в термостат при 37° на 1 час.

По истечении указанного срока активированную жидкость титруют на белых мышах путем внутривенного введения с постановкой реакции нейтрализации с сывороткой типа E.

Одновременно таким же образом проверяют титр токсина неактивированной культуральной жидкости того же посева.

Результат учитывают предварительно через 5 часов, окончательно - через 24 часа. Затем определяется индекс активации, т.е. отношение числа Dlm (минимальных смертельных доз) в активированной культуральной жидкости к числу Dlm в неактивированной культуральной жидкости.

Примечание. + ферментация с образованием кислоты и газа; - не ферментируют; +/- ферментируют не все штаммы.

В том случае, если индекс активации положителен и составляет больше 2, в культуральной жидкости несомненно содержится прототоксин.

При отрицательном индексе активации следует считать, что данный штамм не вырабатывает прототоксина и не относится к типу E.

а) Положительный ответ по проведенному исследованию пищевых продуктов, материалов от больных или трупов дается сразу же при обнаружении ботулинических токсинов в исследуемых материалах, а также в посевах на питательные среды, или при выделении чистой токсигенной культуры возбудителя ботулизма.

б) Отрицательный ответ может быть дан только после проведения полного бактериологического исследования.

Cl. perfringens типов A, B, C, D, E и F - факультативные анаэробы, повсюду встречающиеся в природе (почва, вода, кал людей и животных, пищевые продукты и т.д.). Это крупные, иногда инкапсулированные грамположительные палочки разной длины, без жгутиков, неподвижные, образующие при определенных условиях центральные или субтерминальные споры, которые у отдельных штаммов (типа A и F) способны выдерживать кипячение от 1 до 6 часов.

Различают 6 типов Cl. perfringens, каждый из которых вызывает определенные заболевания у людей или животных. Как правило, эти микробы быстро размножаются на специальных питательных средах, ферментируя различные субстанции (табл. 1) и выделяя многие растворимые антигены, часть из которых обладает токсическим действием (табл. 2).

--------------------------------

<1> Прототоксины (эпсилон) и (йот) вырабатываются в виде неактивных субстанций, которые под влиянием протеолитических ферментов, иногда выделяемых самим микроорганизмом, превращаются в активные токсины.

а) Пищевые продукты, вызвавшие отравление, а также продукты, подозрительные по качеству: мясные, рыбные, птичьи, фруктовые и овощные консервы, мясные и рыбные блюда, соусы, колбасы, сало, молоко, компоты и пр.

б) Смывы с посуды и консервных банок.

в) Материалы от больного: кал (для исследования на наличие токсина и возбудителя), кровь, рвотные массы, промывные воды желудка (только для исследования на наличие возбудителя).

г) Материал от реконвалесцента: кровь (10 - 20 мл) для исследования на наличие в сыворотке специфических антитоксинов.

д) Трупный материал: все содержимое тонкого кишечника (от двенадцатиперстной кишки до илеоцекальной заслонки), перитонеальная жидкость, кишечные и брыжеечные лимфатические узлы, часть печени, кровь (стерильно взятая из сердца).

Пищевые продукты подвергаются только бактериологическому анализу и берутся по методу, который описан в разделе исследований на возбудителей ботулизма. Исследованию на наличие токсина подвергаются жидкий стул больного, перитонеальная жидкость и содержимое тонкого кишечника трупа. Эти материалы в количестве 500 - 700 г помещают в стерильную герметически закрывающуюся посуду и быстро доставляют в лабораторию для немедленного исследования. В отдельных случаях, когда это невозможно, допускается хранение материала в холодильнике не более 2 суток. Ввиду относительно высокой лабильности токсинов Cl. perfringens и их способности быстро адсорбироваться из кишечника тканями трупа брать материал от людей, погибших в результате пищевых отравлений, следует возможно быстрее после смерти (не позднее 2 суток). Если имеются соответствующие условия, то трупы людей, умерших от пищевых отравлений, до момента вскрытия и взятия материала необходимо хранить при низких температурах (2 - 4°). Кровь реконвалесцента для исследования на наличие специфических антитоксинов в сыворотке берут путем пункции из локтевой вены в стерильную пробирку с ватной пробкой в объеме 10 - 15 мл.

Все другие материалы (остатки пищи, рвотные массы, кровь трупа, лимфатические узлы кишечника, часть печени и т.п.) берут в количестве 50 - 100 г в отдельные чистые стерильные стеклянные или пластмассовые банки, герметически закрывают, упаковывают и немедленно пересылают в бактериологическую лабораторию для исследования на наличие микробов-возбудителей.

На каждой банке, присланной с материалом для исследования в бактериологическую лабораторию, должна быть соответствующая маркировка с указанием фамилии, имени и отчества больного (трупа), наименования материала, даты его взятия, цели исследования. В сопроводительном документе, приложенном к пробам, следует сообщить, с какой целью материал направляется в лабораторию, а также привести краткое описание пищевого отравления с указанием инкубационного периода, даты заболевания, основных его симптомов и исхода.

Исследованию на наличие токсинов Cl. perfringens подвергаются испражнения больного, содержимое тонкого кишечника и перитонеальная жидкость трупа. Поиски токсина в пищевых продуктах и других материалах не дают положительных результатов.

Испражнения больного (500 мл) разбавляют равным количеством физиологического раствора и, профильтровав через грубый бумажный фильтр, подвергают центрифугированию при 5000 об./мин. в течение 30 минут до получения прозрачной или слегка опалесцирующей жидкости.

Содержимое тонкого кишечника трупа собирают в стерильную банку и после добавления равного объема физиологического раствора подвергают такой же обработке, как и испражнения.

Следует стремиться получить достаточное количество центрифугата из исследуемых материалов (до 50 - 100 мл), учитывая возможность постановки реакции нейтрализации на последующих этапах исследования.

При отсутствии достаточно мощной центрифуги жидкость, предварительно освобожденную от грубых частиц, можно фильтровать через фильтр Зейтца или в крайнем случае через простой бумажный фильтр. Эту операцию лучше проводить при низкой температуре (+4°), чтобы замедлить процесс окисления токсина. При фильтрации обычно снижается сила токсина в большей степени, чем при центрифугировании.

Полученные прозрачные фильтраты (центрифугаты) в процессе исследования следует хранить на холоду в пробирках или флаконах, закрытых резиновыми пробками.

По 0,5 и 0,1 мл фильтрата вводят внутривенно (в хвостовую вену) или внутрибрюшинно двум парам белых мышей несом 22 - 24 г.

Большие дозы токсинов (10 - 20 Dlm) Cl. perfringens любого типа убивают всех подопытных мышей не позднее первых двух часов после инъекции, тогда как малые дозы (1 - 2 Dlm) тех же токсинов могут вызвать гибель мышей не раньше 8 - 16 часов после введения.

Если нет мышей, исследуемый фильтрат можно вводить внутривенно кролику в количестве 2,5 - 5 мл или внутрикожно белой морской свинке в количестве 0,1 - 0,2 мл. Кролики очень чувствительны к внутривенному введению токсинов Cl. perfringens и быстро погибают с явлениями остановки дыхания и сильных судорог. Некротические изменения кожи морской свинки при действии токсинов Cl. perfringens появляются в течение 40 минут в виде побледнения (ишемия) и затем кровоизлияния базовой окраски, распространяющегося от центра к периферии. Через несколько часов в центре багрового пятна кожа снова бледнеет (некроз).

Фильтраты, оказавшиеся слабо токсичными или нетоксичными, следует обработать трипсином или панкреатином (см. ниже) для того, чтобы исключить наличие прототоксинов, которые могут оставаться не полностью активированными протеолитическими ферментами кишечника.

Если в содержимом кишечника обнаруживают токсин, который разрушается при кипячении, то ставят реакцию нейтрализации.

Первый этап исследования проводится по следующей схеме.

Учет реакции нейтрализации. Первый вариант. Реакция нейтрализации учитывается предварительно через 5 часов и окончательно через 48 часов. Возможны следующие результаты: мыши, получившие смесь токсин + противоботулиническая сыворотка, погибли, тогда как мыши, получившие сыворотку против Cl. perfringens, остались жить. Вывод: токсин в кишечнике принадлежит одному из типов Cl. perfringens, следует поставить развернутую реакцию нейтрализации типовыми диагностическими сыворотками Cl. perfringens.

Второй вариант. Мыши, получившие смесь токсин + поливалентная сыворотка Cl. perfringens, погибли, а мыши, которым вводилась противоботулиническая сыворотка, живы.

Вывод: токсин в кишечнике принадлежит одному из типов Cl. botulinum; необходимо поставить развернутую реакцию нейтрализации с типовыми диагностическими сыворотками Cl. botulinum (см. соответствующий раздел).

Третий вариант. Все подопытные мыши пали.

Вывод: токсин в кишечнике не принадлежит ни Cl. perfringens, ни Cl. botulinum.

Второй этап исследования - развернутая реакция нейтрализации токсина антитоксическими диагностическими сыворотками Cl. perfringens ставится в том случае, если исследуемый токсин нейтрализуется одноименной поливалентной сывороткой.

В пять пробирок разливают фильтрат и соответствующие сыворотки, шестая пробирка служит контролем.

Смеси выдерживают при комнатной температуре в течение одного часа и вводят внутривенно по 0,5 мл или внутрибрюшинно по 1 мл 2 белым мышам (всего 12 мышам).

Учет результатов развернутой реакции нейтрализации (предварительный - через 5 часов, заключительный - через 24 часа).

Следует считать, что обнаружен:

а) Токсин типа A если мыши не погибли от смеси фильтрата с сывороткой типа A, а мыши в контроле пали (результаты, полученные от других смесей, не играют роли).

б) Токсин типа B если мыши защищаются полноценной в антигенном отношении сывороткой типа B (сыворотка этого типа должна содержать антитела против и а все остальные мыши, взятые в опыт, пали.

в) Токсин типа C и F если мыши, получившие токсин + сыворотки типа B и C живы, а остальные животные пали.

г) Токсин типа D если мыши, получившие токсин + сыворотку типа D (и, возможно, B), живы, а остальные - пали.

д) Токсин типа E если мыши защищаются только одной сывороткой - типа E, а остальные животные пали.

Примечание. Реакция централизации может быть поставлена также на морских свинках путем внутрикожного введения по 0,2 мл смесей токсин + антитоксин.

В этом случае учет реакции проводится по отсутствию некроза кожи вследствие нейтрализации токсина соответствующим антитоксином.

Фильтраты культур Cl. perfringens типа A при внутривенном введении больших доз (10 - 20 Dlm) убивают большинство животных с явлениями сильного геморрагического отека легких в сроки от нескольких минут до одного часа, в этом случае смерть наступает вследствие остановки дыхания в результате периваскулярного отека и трансфузии крови в альвеолы.

Важным признаком фильтратов типа A является их способность вызывать при внутривенном введении сильную гематурию у тех мышей, которые погибают не раньше 40 минут после инъекции. Гематурия развивается у животных, получивших не более 1/4 Dlm токсина типа A.

При введении от 1 до 3 Dlm токсина мыши через 2 - 3 часа впадают в угнетенное состояние, сопровождающееся изнурительной гематурией. Эта картина мало изменяется до смерти животного, которая наступает в течение 10 - 16 часов вслед за коротким периодом судорог различного характера.

Токсины типов B, C и F имеют много общих свойств. Центрифугаты свежих культур штаммов B, C и F содержат летальные токсины (от 100 до 5000 Dlm/мл), которые убивают мышей через несколько минут после введения с явлениями сильных судорог.

Погибающие животные совершают большие прыжки вперед, судорожно вытягивают задние лапки, дугообразно выгибая позвоночник.

Наблюдающийся иногда при этом геморрагический отек легких вызывается, как правило, токсинами типа C.

Центрифугаты культур типа D без специальных методов исследования (активация трипсином) невозможно отличить от токсинов типа A. При внутривенном введении они могут вызвать сильную гематурию у мышей.

В больших дозах (>20 Dlm) активированные токсины типа D вызывают гибель мышей с явлениями потери равновесия, быстрого кружения на месте, сильных судорог, олистотонуса и иногда геморрагического отека легких.

С помощью реакции нейтрализации определяется только главный летальный токсин Cl. perfringens, содержащийся в момент исследования в кишечнике.

Для того чтобы точно установить тип микроба, который вызвал заболевание, проводится бактериологическое исследование кишечного содержимого и других материалов, присланных в лабораторию.

Первый этап. Бактериологическому исследованию подвергаются: пищевые продукты, вызвавшие отравление, кровь, испражнения и рвотные массы больного, содержимое тонкого кишечника и мезентериальные лимфатические узлы, печень, кровь, стерильно взятая из сердца трупа.

Суспензии пищевых продуктов для посева на питательные среды готовятся так же, как это указано в разделе исследования на возбудителей ботулизма.

Кровь без предварительного прогрева следует сразу посеять на жидкую питательную среду Вайнберга с глюкозой, на желточный агар и сахарный кровяной агар.

Содержимое тонкого кишечника набирают в пастеровскую пипетку через прокол стенки кишечника в участке, куда предварительно прикладывают раскаленный металлический шпатель. Кусочки тканей обжигают с поверхности и стерильно вырезают внутренние части, которые затем растирают в ступке со стерильным песком или стеклом в равном объеме физиологического раствора. Каждый материал делят на две части, одну из которых прогревают при 80° в течение 15 минут, а вторую оставляют непрогретой.

Затем по 5 - 10 мл прогретого и непрогретого материала засевают на 100 мл одной из жидких сред (казеиновый бульон, среда Вайнберга или Попе).

Для первичной идентификации Cl. perfringens можно использовать чашки с кровяным агаром или желточным агаром, а также высокий столбик желточного агара и среду Вильсона и Блэра с уменьшенной в 5 раз концентрацией железа. Суспензию из содержимого кишечника, лимфатических узлов и печени рассевают последовательно путем легкого втирания шпателем на 3 чашки с кровяным или желточным агаром.

Посев на высокий столбик желточного агара и среду Вильсона - Блэра для получения изолированных колоний проводят следующим образом: не отламывая конца пастеровской пипетки, погружают его в суспензию исследуемого материала и переносят из пробирки в пробирку предварительно расплавленного и затем охлажденного до 50° питательного агара, тщательно перемешивая среду (на каждый посев берут 5 - 8 пробирок агарового столбика).

Засеянные среды (кроме чашек с агаром) инкубируют в термостате при 37° до того момента, когда начинается интенсивное размножение микроорганизмов с выделением газов. Обычно рост Cl. perfringens становится заметным в течение 3 - 12 часов.

Засеянные чашки с агаром помещают в анаэростаты различных систем с разреженной атмосферой (не менее 400 мм ртутного столба). При отсутствии в лаборатории анаэростатов для выращивания анаэробов можно использовать простой чашечный метод, который заключается в следующем: исследуемый материал наносят штрихами платиновой петлей на поверхность мясо-пептонного агара, налитого тонким слоем в чашку Петри, после чего засеянный агар заливают дополнительно стерильным охлажденным до 45° 2% МПА слоем не менее чем 2 мм.

Рост колоний анаэробов происходит между пластинками агара при инкубации в обычном термостате.

С целью определения титра анаэробов в подозреваемом пищевом продукте готовят последовательные 10-кратные разведения эмульсии этого продукта в физиологическом растворе до 10^-12 (12 пробирок). По 1 мл каждого разведения засевают на 10 мл высокого столбика желточного агара или на среду Вильсона и Блэра. Выросшие колонии Cl. perfringens просматривают через сутки.

Последняя пробирка, в которой содержится от 10 до 50 колоний анаэробов, считается конечным разведением. Титр анаэробов вычисляют путем умножения числа колоний, выросших в этой пробирке, на соответствующее разведение.

Так, например, если в 10-й пробирке высокого столбика агара имеется 20 колоний, а в 11-й пробирке только 5, то 10-я пробирка считается конечным разведением, а титр анаэробов равен: 20 колоний x 10¹⁰.

Флаконы, в которых отмечен рост с сильным газообразованием, отбирают для исследования. Из выросших культур готовят мазки, окрашивают по Граму или краской для анаэробов и просматривают под микроскопом. Те культуры, в которых найдены в большом количестве грамположительные палочки, похожие по морфологии на Cl. perfringens, проверяют на токсичность.

Фильтраты (центрифугаты) этих культур в дозе 0,25 мл и 0,1 мл вводят внутривенно 2 белым мышам. В случае быстрой гибели животных ставят реакцию нейтрализации токсина с типовыми диагностическими антитоксическими сыворотками Cl. perfringens (метод см. выше). Если быстрой гибели животных (в течение первых 2 часов) не наблюдается, фильтрат активируют трипсином (панкреатином) и вводят по 0,25 мл 2 мышам. Если мыши после введения активированного токсина погибают быстрее, чем от неактивированного токсина, следует подозревать наличие в культуральном фильтрате или С таким активированным фильтратом ставится реакция нейтрализации антитоксическими сыворотками Cl. perfringens типов D и E.

Второй этап. Просматривают все посевы.

Колонии на чашках с кровяным агаром и в глубине высокого столбика, напоминающие Cl. perfringens, отвивают в пробирки с жидкой средой, содержащей 0,25% глюкозы. Эти посевы немедленно помещаются в термостат.

Все изолированные чистые культуры Cl. perfringens надо стремиться проверить на токсичность и установить их тип с помощью реакции нейтрализации со специфическими сыворотками. При отсутствии надлежащих условий, обеспечивающих возможность изучения свойств выделенных штаммов, сильно токсигенные штаммы Cl. perfringens, не нейтрализующиеся антитоксической сывороткой типа A, следует направлять для точной идентификации в Институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи АМН СССР (Москва).

При отсутствии специфического роста Cl. perfringens на засеянных средах при инкубации их в течение 12 дней результат следует считать отрицательным.

Изучение сывороток больных и реконвалесцентов на наличие антитоксинов Cl. perfringens может проводиться только в лабораториях, снабженных стандартными типовыми токсинами и сыворотками Cl. perfringens.

Полученные от больного сыворотки освобождаются от взвешенных частиц путем центрифугирования при 2500 об./мин. в течение 20 минут и затем титруются со стандартными типовыми токсинами на 1, 1/2, 1/4, 1/10 AE, как это описано для титрования сыворотки антиперфрингенс типа A; в качестве контроля используется нормальная человеческая сыворотка.

Культуры Cl. perfringens типа D и E способны вырабатывать прототоксины, для обнаружения которых применяют метод их активации с помощью протеолитических ферментов - трипсина и панкреатина.

Способ приготовления протеолитического фермента. Чистый сухой трипсин растворяется ex tempore в физиологическом растворе (pH 8,0 - 8,2) в концентрации 1:100. Этот раствор считается исходным для дальнейшей работы и применяется в 0,5% концентрации к объему исследуемой культуральной жидкости.

Трипсин может быть заменен сухим медицинским высокоактивным панкреатином, раствор которого готовится следующим образом (активность панкреатина должна быть не меньше 50 единиц). Четыре грамма этого препарата растворяют в 100 мл физиологического раствора (pH 8,0 - 8,2) и оставляют в рефрижераторе при +4° на ночь. Перед употреблением раствор фильтруют через плотный бумажный фильтр и затем через фильтр Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Раствор в количестве 0,5 мл не должен убивать белую мышь весом в 17 - 18 г при внутривенном введении; 0,2 мл раствора при внутрикожном введении вызывают обычно некроз участка (0,5 x 0,5 см) кожи морской свинки. Активность препарата следует обязательно проверить предварительно по отношению к известному музейному штамму Cl. perfringens типа D.

Растворы трипсина и панкреатина могут сохраняться при +4° в течение 1 - 2 недель.

Активация прототоксина Cl. perfringens типа D или E. Исследуемая 5 - 6-часовая культура Cl. perfringens, полученная на жидкой мясной или казеиновой среде, подвергается центрифугированию или фильтрованию с целью отделения микробных тел от культуральной жидкости.

Исходный раствор трипсина добавляют в 0,5% концентрации к объему исследуемой культуральной жидкости.

Если вместо трипсина применяют панкреатин, то культуральную жидкость смешивают с равным объемом раствора панкреатина и pH смеси доводят при помощи 10% NaOH до 8,2 - 8,4.

Полученные жидкости помещают в термостат при 37° на один час. По истечении указанного срока активированную жидкость титруют путем внутривенного введения по 0,5 мл каждого разведения 2 мышам.

Одновременно таким же путем проверяют титр токсина неактивированной культуральной жидкости той же культуры.

В качестве контроля берут стерильную среду той же серии, на которой выращивался штамм, физиологический раствор и препарат протеолитического фермента. Результат учитывается предварительно через 5 часов, окончательно - через 24 часа.

Затем определяется индекс активации, т.е. отношение числа Dlm активированной культуральной жидкости к числу Dlm неактивированной культуральной жидкости.

В том случае, если индекс активации положительный и составляет больше 2, в культуральной жидкости несомненно содержится прототоксин.

При отрицательном индексе активации следует считать, что данный штамм не вырабатывает прототоксина.

Обнаружение токсина Cl. perfringens в содержимом кишечника человека при наличии клинически выраженного заболевания с симптомами кишечного расстройства является главным доказательством причины заболевания.

В тех случаях, когда токсин не обнаруживается, большую диагностическую ценность может иметь нахождение в исследуемых материалах микроба любого токсигенного типа Cl. perfringens, кроме типа A.

Так как Cl. perfringens типа A встречается повсюду, то выделение этого микроба из кишечника и органов трупа имеет диагностическую ценность только в том случае, если в остатках пищевых продуктов обнаруживают токсигенные бактерии этого типа.

Несомненным доказательством токсикоинфекции, вызванной Cl. perfringens типа A, служит выделение из крови больных микроба-возбудителя.

Наличие специфических антитоксинов в сыворотке больных и реконвалесцентов следует рассматривать как дополнительное доказательство, подтверждающее, что причиной данного отравления являлся Cl. perfringens.

При оценке доброкачественности пищевых продуктов, употребляемых населением (мясных, птичьих, рыбных, фруктовых и овощных консервов, колбас, готовых мясных и рыбных блюд, соусов и пр.), следует считать, что обнаружение в продукте токсигенных Cl. perfringens является противопоказанием для использования этих продуктов в пищу.

Основной раствор. В 1,5 л кипящей воды на 20 минут опускают 1 кг мяса, нарезанного мелкими кусочками. Затем мясо вынимают, измельчают на мясорубке и снова кладут в тот же отвар. Добавляют 30 - 40 г измельченной поджелудочной железы (вместо поджелудочной железы можно брать 3 - 5 г панкреатина). Приливают 20 мл хлороформа. Бутыль плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают (пробку надо придерживать). Бутыль ставят в термостат при 37° на 3 - 4 дня. Мясо в виде мелкозернистой массы осаждается на дно бутыли. Жидкость над мясом должна быть прозрачной. Эту жидкость надо слить, профильтровать и простерилизовать при 120° в течение 20 минут. Готовый раствор даст реакцию на триптофан (розовое окрашивание при прибавлении двух капель бромной воды в пробирку с пробой).

Бульон Хоттингера. Берут 200 мл основного раствора, 400 мл мясной воды и 400 мл водопроводной воды, 5 г хлористого натрия, 0,2 г Na₂HPO₄ или K₂HPO₄, кипятят в течение 10 минут, устанавливают pH = 7,6. Разливают по пробиркам или по флаконам, на дно которых кладут кусочки вареного мяса или фарша, на бульон наслаивают стерильное вазелиновое масло слоем в 0,5 см. Разлитые среды стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 20 минут.

Ввиду сложности приготовления эту среду целесообразно получать в готовом виде из Института эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, Москва, Щукинская ул., д. 33.

Приготовление пепсин-пептона. В 1 л водопроводной воды подогревают 200 г мясного фарша до 45 - 50° и добавляют от 5 до 10 г пепсина, предварительно растворенного в 100 мл воды, концентрированную соляную кислоту в таком количестве, чтобы конечная концентрация ее в смеси равнялась 1%. Смесь в бутылях закрывают ватной пробкой и ставят в термостат при 45 - 50°. Через 24 часа полученный пептон подогревают в течение 5 минут при 80°, затем 10 минут - при 100° и далее хранят на холоде. Для работы берут пептон 5 - 7-дневной выдержки.

Приготовление печеночного отвара. Берут 1 часть печени с 4 частями воды, кипятят в течение 25 минут и фильтруют через ватный фильтр.

Приготовление бульона. 2,5 л пептона подогревают до 80°, нейтрализуют щелочью, после чего кипятят в течение 5 минут и фильтруют через полотняный фильтр. К фильтрату прибавляют 400 мл печеночного отвара, 2,1 л мясной воды и 0,5% хлористого натрия (в отношении ко всему объему). Всю смесь кипятят в течение 20 минут. Устанавливают pH 7,3. Готовый бульон разливают в предварительно заготовленные стерильные пробирки и флаконы с кусочками сырого мяса или печени и гигроскопической ватой, на бульон наслаивают стерильное вазелиновое масло слоем в 0,5 см и стерилизуют в течение 30 минут при 120°.

1 кг сердца быка, пропущенного через мясорубку, заливают 1 л воды, медленно нагревают до кипячения, охлаждают, снимают жир. Смешивают 400 г свиных желудков, 400 г печени, 40 г соляной кислоты (удельный вес 1,19), 4 л воды, подогретой до 50°; оставляют при этой температуре на 18 - 24 часа, нагревают в течение 10 минут при 100°, декантируют, фильтруют, добавляют 0,2% двуосновного фосфорнокислого натрия, устанавливают pH 7,4.

Смешивают 1 л мясной воды из сердца быка и 2 л раствора пептона, устанавливают pH 7,8 - 8,2, стерилизуют при 120° в течение 30 минут.

Бульон разливают в пробирки и флаконы. К бульону в пробирках и флаконах добавляют кусочки вареной печени, наслаивают стерильный вазелин слоем в 0,5 см и затем стерилизуют при 120° в течение 30 минут. Перед посевом к бульону добавляют стерильный 50% раствор глюкозы из расчета 1 мл раствора глюкозы на 99 мл среды.

900 г фарша из свежего мяса заливают 1 л воды, подогревают до 80° при помешивании, доливают 2 л холодной воды, доводят при помощи безводного углекислого натрия pH до 8,0, помещают в термостат при 50°. Через каждые полчаса в течение 6 часов на 1 л перевара добавляют по 2 мл раствора трипсина, который готовится следующим образом. К 800 г очищенной от соединительной ткани и измельченной поджелудочной железы добавляется 2,4 л дистиллированной воды и 1 л метилового спирта; через 3 дня к общему объему этой смеси добавляют концентрированную соляную кислоту в таком количестве, чтобы конечная концентрация ее в растворе равнялась 0,1%. Через неделю раствор фермента готов к употреблению (хранить следует в темном прохладном месте).

Переваривание ведут при 50°, постоянно помешивая, жидкость должна иметь pH 8,0. Через 6 часов добавляют 1% ледяной уксусной кислоты и смесь кипятят в течение 30 минут, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Помещают на ночь в холодильник при +5 - 6°; на следующий день подогревают до 30° и устанавливают с помощью 40% раствора едкого натра pH 7,0. К 1 л среды добавляют 2 г сухих измельченных дрожжей и выдерживают среду при температуре 30° в течение часа, затем реакцию доводят до pH 8,0. После этого среду нагревают до 60°, добавляют к ней 0,3% мальтозы, фильтруют сначала через бумажный фильтр, а затем фильтр Зейтца. Готовую среду разливают в пробирки или флаконы, добавляют стерильный вазелин слоем в 0,5 см, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут. Наиболее сильные токсины получают при наличии в бульоне от 140 до 160 мг аминного азота.

Для Cl. botulinum как основу можно использовать бульон Хоттингера или пепсин-пептон, для Cl. perfringens - бульон Вайнберга или Попе.

В среду добавляют 0,1% агара и 0,4% желатины. Среду в пробирках заливают слоем вазелинового масла высотой в 0,5 см, на дно помещают по 3 - 5 г вареного мяса. Среду стерилизуют при 120° в течение 20 минут.

100 мл 2% агара на бульоне Хоттингера (для Cl. botulinum) или на бульоне Вайнберга (для Cl. perfringens) расплавляют, охлаждают до 45°, а затем добавляют 10 - 15 мл свежевзятой стерильной дефибринированной крови кролика, барана или рогатого скота и 10 мл 20% стерильного раствора глюкозы. Смесь взбалтывают без образования пены и пузырей, разливают по чашкам Петри. Чашки подсушивают в термостате или в боксе при зажженной бактерицидной лампе до удаления конденсата.

Среда служит для выделения чистых культур анаэробов.

К бульону Хоттингера, Вайнберга или Попе добавляют 1,5 - 2% агара, 1% глюкозы, устанавливают pH 7,4 - 7,6, разливают в узкие (размером 20 x 0,8 - 1 см) тонкостенные пробирки, стерилизуют в течение 20 минут при 115°.

К 1 л бульона Вайнберга добавляют 1 г хлористого натрия, 0,01 г сульфата магния, 2 г глюкозы и 25 г агара; среду доводят до pH 7,6. К этой среде после стерилизации и охлаждения до 50° добавляют 0,1 часть эмульсии из яичного желтка, которую готовят следующим образом: из свежего яйца асептически извлекают желток и эмульгируют в равном объеме стерильного физиологического раствора.

Колонии Cl. perfringens на этой среде имеют размер 3 - 5 мм в диаметре, приподняты, гладки и окружены зоной преципитации.

К 100 мл расплавленного и затем охлажденного до 80° щелочного агара на бульоне Вайнберга или Попе с 1% глюкозы добавляют 10 мл 20% раствора сернистокислого натрия и 0,25 мл 8% раствора хлористого железа. Раствор хлористого железа готовят на стерильной дистиллированной воде, раствор сернистокислого натрия стерилизуют в течение одного часа текучим паром; среду разливают в пробирки по 7 мл. Анаэробы образуют колонии черного цвета, что часто сопровождается почернением среды. Свойством восстанавливать сернистокислый натрий в этой среде обладают Cl. perfringens, Cl. septicum, Cl. sporogenes, они дают колонии интенсивно черного цвета. Cl. tetani, Cl. hystolyticum образуют зеленовато-черные колонии; Cl. perfringens черные колонии образуют очень быстро (уже через 4 часа после посева).

Для получения железо-сульфитного агара заранее готовится 10% раствор сульфита натрия (Na₂SO₃), который стерилизуется текучим паром в течение одного часа, 8% раствор хлорного железа (FeCl₃) на дистиллированной воде и 8% взвесь уксуснокислого свинца. К 100 мл 2% расплавленного питательного агара, приготовленного на бульоне Вайнберга или Попе, добавляют 10 мл горячего раствора Na₂SO₃ и затем после охлаждения до 70° тщательно смешивают с 0,25 мл раствора FeCl₃ и 0,5 мл взвеси уксуснокислого свинца. Готовую среду разливают на чашки Петри тонким слоем (толщиной в 1 мм).

На одну чашку требуется не более 3 - 4 мл агара. Посевной материал мягкими штрихами наносят на затвердевшую пластинку агара платиновой петлей или концом пастеровской пипетки. Одной петлей материал рассевают на три чашки. Посевы быстро покрывают тонким слоем кровяного агара (3 - 4 мл на чашку) и помешают в анаэростат при 37° и полном вакууме. Подавляющее большинство бактерий развивается в толще кровяного агара. Уже через 6 - 8 часов после посева свежей культуры Cl. perfringens рост токсигенных колоний наблюдается по гемолизу верхней пластинки и почернению нижней пластинки агара. Если колонии Cl. perfringens не выделяют гемолизинов, то их легко заметить по почернению нижней пластинки агара. При отсутствии вакуумной аппаратуры чашки дополнительно заливают простым 2% агаром (слоем не менее чем 2 мм толщины для создания анаэробных условий) и после застывания агара инкубируют при 37° в обычном термостате, причем чашки с посевами помещают крышками вниз. Через 16 часов колонки токсигенных штаммов Cl. perfringens заметны в сильном проходящем свете в виде дымчатых или почерневших образований, окруженных зоной гемолиза.

К 100 мл пептически переваренного бульона добавляют 0,5% агара к общему объему, стерилизуют при 120° в течение 20 минут, затем добавляют 1 г испытуемого углевода и 1 мл индикатора Андрэде, доводят pH до 7,2 - 7,4. Среду разливают по пробиркам и стерилизуют при 112° в течение 15 минут. Можно использовать эту же среду без агара - тогда перед стерилизацией в пробирки следует наслоить вазелиновое масло толщиной в 0,5 см.

Первый раствор: метиленовой синьки 2,5 г, дистиллированной воды - 200 мл.

Второй раствор: фуксина основного 1 г, кристаллической карболовой кислоты 5 г, спирта чистого 96° 10 мл, воды дистиллированной 100 мл.

Оба раствора ставят на сутки в термостат при 37°, затем сливают один с другим.

Продолжительность окраски мазка 3 - 5 минут.