"МУ 4.2.4070-24. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды. Методические указания"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 27.09.2024)

--------------------------------

<*> МУ 4.2.4070-24 введены взамен МУ 4.2.2723-10 "Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение в пищевых продуктах и объектах окружающей среды", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 13.08.2010.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУ) описывают алгоритм проведения лабораторных исследований для обнаружения сальмонелл в клиническом материале, пищевых продуктах и объектах окружающей среды при диагностике заболеваний, выявлении бактерионосительства, расследовании случаев групповой заболеваемости сальмонеллезами с целью установления источников и факторов передачи возбудителей инфекции и осуществлении федерального государственного санитарно-эпидемиологического контроля (надзора) за безопасностью пищевых продуктов и объектов окружающей среды.

1.2. Настоящие МУ распространяются на лаборатории, имеющие санитарно-эпидемиологическое заключение на работу с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) <1> и аккредитованные на данный вид деятельности в установленном порядке <2>.

--------------------------------

<1> Пункты 135, 1967 СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21).

<2> Федеральный закон от 28.12.2013 N 412-ФЗ "Об аккредитации в национальной системе аккредитации".

1.3. Настоящие МУ носят рекомендательный характер.

2.1. Сальмонеллезы - инфекционные болезни, возбудителями которых являются представители рода Salmonella. Они характеризуются значительным полиморфизмом клинического течения с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, возможной генерализацией и различной степенью выраженности симптомов общей интоксикации и обезвоживания.

2.2. Диагноз сальмонеллеза подтвержается лабораторно <3>, с выделением культуры возбудителя, его дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее - ДНК) или антигенов из образцов клинического материала. Серологические методы диагностики с выявлением антител к возбудителю (непрямые методы исследования) применяются при отрицательных результатах прямых методов лабораторных исследований (см. главу XI).

--------------------------------

<3> Пункт 1963 СанПиН 3.3686-21.

2.3. В случае групповой заболеваемости с большим количеством пострадавших (более 20 человек) этиологический диагноз у части заболевших может устанавливаться без лабораторного подтверждения в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <4>.

--------------------------------

<4> Пункт 1858 СанПиН 3.3686-21.

Род Salmonella входит в семейство Enterobacteriaceae и состоит из микроорганизмов, родственных по фенотипическим и генотипическим свойствам. Ферментативные свойства сальмонелл положены в основу их подразделения на подвиды. Согласно последним данным, род Salmonella представлен двумя видами - Salmonella enterica (далее - S. enterica) и Salmonella bongori (далее - S. bongori).

Сальмонеллы вида S. enterica делятся на несколько подвидов и обозначаются следующими символами:

- подвид I - для сероваров вида S. enterica subsp. enterica;

- подвид II - для сероваров S. enterica subsp. salamae;

- подвид IIIa - для сероваров S. enterica subsp. arizonae;

- подвид IIIb - для сероваров S. enterica subsp. diarizonae;

- подвид IV - для сероваров S. enterica subsp. houtenae;

- подвид VI - для сероваров S. enterica subsp. indica.

V - Вид S. bongori - для серовара S. bongori subsp. bongori. Все серовары вида S. bongori имеют символ V.

Деление на подвиды имеет эпидемиологическое значение, так как основным, естественным резервуаром сальмонелл подвидов I и II служат теплокровные животные, а для представителей остальных подвидов (IIIa, IIIb, IV, VI и вида S. bongori (V) - хладнокровные животные и окружающая среда. Определение и название подвидов не является обязательными в клинической микробиологической практике. Необходимым для идентификации является название серовара подвида enterica.

Серовары других подвидов вида S. enterica и вида S. bongori обозначаются номером подвида и их антигенной формулой: II - O 1, 6, 14 H, e, n, x, z15.

Это значит, что штамм с такой антигенной характеристикой относится к виду enterica subsp. salamae.

Сальмонеллы каждого подвида разделяются на серовары по O- и H-антигенной характеристике.

Современная схема Кауфмана-Уайта насчитывает 2579 серологических вариантов (таблица 2.1, приложение 5 к настоящим МУ).

Большая часть сероваров сальмонелл имеют собственные названия, при их отсутствии они обозначаются антигенной формулой. Название сероваров не выделяется курсивом, а первая буква пишется с заглавной. При первом упоминании серовара в тексте дается название рода, подвида, за которым следует слово "серовар" или аббревиатура "ser.", после которого само название серовара или его антигенная формула (например, S. enterica subsp. enterica серовар Typhimurium). При последующем упоминании в этом же тексте название может быть записано в сокращенном виде с указанием рода, за которым следует непосредственно название серовара (например, Salmonella Typhimurium или S. Typhimurium). Таким образом, для серовара Typhimurium возможно использование следующих вариантов написаний: S. enterica subsp. enterica серовар Typhimurium, Salmonella серовар Typhimurium, Salmonella ser. Typhimurium, Salmonella Typhimurium, S. Typhimurium.

Сальмонеллы - лактозонегативные грамотрицательные палочки. Подвижные, имеют перитрихиальные (по всей поверхности клетки) жгутики, за исключением S. Gallinarum. D-глюкозу ферментируют с образованием кислоты и газа. (S. Typhi газа не образуют). Ферментируют рамнозу, ксилозу, арабинозу, мальтозу, дульцит, сорбит, трегалозу, маннит. Сальмонеллы - оксидазонегативные, каталазопозитивные, индол и Фогес-Проскауэр негативные, метиловый красный и цитрат позитивные, продуцируют сероводород и не расщепляют мочевину.

Они являются факультативными анаэробами, хорошо растут на простых питательных средах, за исключением нескольких сероваров (например, S. Paratyphi A, S. Choleraesuis, S. Typhisuis, S. Sendai, S. Gallinarum). Оптимальной температурой роста является температура плюс (37 1) °C, реакция среды слабощелочная (pH 7,2 - 7,4). При измененных условиях (например, температура плюс 20 - 42 °C, кислотность (pH 4,1 - 9,0) сальмонеллы размножаются медленнее. При температуре ниже плюс 5 °C их рост полностью прекращается.

Сальмонеллы обладают высокой устойчивостью к воздействию различных факторов внешней среды. В жидкой среде при прогревании до температоры плюс 70 °C они погибают через 5 - 10 минут, а при кипячении моментально.

Сальмонеллы хорошо сохраняются в различных пищевых продуктах (например, молоке, мясе, на поверхности и внутри яиц). Соление и копчение оказывают на сальмонеллы относительно слабое действие.

Основными факторами передачи возбудителей инфекции при сальмонеллезах являются пищевые продукты животного происхождения, в том числе молоко и молочные продукты и растительного происхождения, например:

- инфицированные яйца или продукты, в состав которых входят яйца, в том числе кремово-кондитерские изделия;

- инфицированное сальмонеллами мясо и мясопродукты (например, мясо домашних птиц (куры, утки, гуси, индейки); мясо крупного рогатого скота, свинина);

- рыба и рыбные морепродукты, в том числе рыба горячего копчения и сельдь пряного посола (доля их в общем числе вспышек сальмонеллезной этиологии невелика);

- пищевые продукты растительного происхождения (овощи, фрукты, ягоды), а также дрожжи, кондитерские красители.

Наибольшую опасность как возможные факторы передачи возбудителя инфекции представляют такие пищевые продукты и блюда, которые после приготовления не подвергаются термической обработке и могут храниться длительное время, в том числе и при комнатной температуре.

В качестве факторов передачи возбудителя инфекции при сальмонеллезах могут оказываться пищевые продукты, инфицированные небольшими дозами сальмонелл. Для развития заболевания достаточно 10⁵ - 10¹⁰ бактерий, вместе с тем инфицирующая доза может быть меньше из-за высокой вирулентности бактерии или при заражении лиц с иммунодифицитами. Известны отдельные случаи заболевания сальмонеллезами и даже вспышки, когда заражающая доза не превышала несколько десятков бактерий.

Интенсивное размножение сальмонелл в пищевых продуктах не приводит к изменению внешнего вида, вкуса и запаха.

За последние 30 лет во всем мире и в Российской Федерации распространилась S. Enteritidis [1, 2]. Штаммы данного серовара вызывают пищевые вспышки сальмонеллеза при низкой дозе указанных бактерий в продукте, а заболевания отличаются более тяжелым клиническим течением. В последние 10 - 20 лет во многих Европейских странах регистрировали заболевания, в том числе пищевые вспышки, вызванные штаммами "монофазной Salmonella группы B" с антигенной формулой 1, 4, [5], 12 : i : -, занимая по частоте выделения 3 - 4 место после S. Enteritidis и S. Typhimurium [3]. Анализ полногеномных последовательностей показал, что штаммы принадлежат к серологическому варианту S. Typhimurium, которые не экспрессируют жгутиковый антиген второй фазы "1, 2" и получили обозначение "монофазная S. Typhimurium". В Российской Федерации на ряде территорий зафиксирована циркуляция данных штаммов [2].

3.1. Эффективность проводимого бактериологического исследования, направленного на выделение сальмонелл из разных материалов, зависит от применения соответствующих сред обогащения и адекватного выбора дифференциально-диагностических сред (приложение 1 к настоящим МУ).

3.2. При исследовании различных материалов на инфицированность сальмонеллами отличаются только начальные этапы анализа (правила отбора материала, его обработка, выбор адекватных питательных сред). Начиная с отбора колоний на дифференциально-диагностических средах, последующие этапы бактериологического исследования идентичны.

3.3. Для проведения бактериологической диагностики сальмонеллеза используются культуральные среды, разрешенные к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке <5>. Контроль питательных сред осуществляется в соответствии с методическими документами <6>.

--------------------------------

<5> Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" (далее - Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ); постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий" (далее - постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416).

<6> Пункты 6.13, 7.2 МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008.

3.4. Среды обогащения делятся на неселективные первичные (забуференная пептонная вода) и среды селективного обогащения (бульон Раппапорт-Василиадиса с соей (англ. Rappaport Vassiliadis Soya, далее - RVS-бульон), модифицированный полужидкий агар Раппопорта-Василиадиса (англ. modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis, далее - MSRV-агар), тетратионатный бульон Мюллер-Кауфмана (англ. Muller-Kauffmann tetrathionate, далее - MKT-бульон), тетратионатно-новобиоциновый бульон Мюллер-Кауфмана (англ. Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin, далее - MKTTn-бульон) магниевая, селенитовая).

3.5. Неселективное обогащение. Рекомендуемой средой для неселективного обогащения является забуференная пептонная вода с условиями инкубации: температура плюс (37 1) °C в течение (22 2) ч. Время инкубации при неселективном обогащении может зависеть от рекомендаций производителя забуференной пептонной воды.

3.6. Селективное обогащение. Необходимо минимизировать перенос частиц пробы из среды неселективного обогащения в две селективные среды обогащения. Основными средами для селективного обогащения являются RVS-бульон (0,1 мл суспензии образца добавляют в 10 мл среды обогащения и инкубируют при температуре плюс (41,5 1) °C в течение 24 - 48 ч) и MKT-бульон (1 мл суспензии образца добавляют в 10 мл среды обогащения и инкубируют при температуре плюс (37 1) °C в течение (22 2) ч). При отсутствии одной или обеих сред допускается замена на магниевую и (или) селенитовую среды. Для магниевой и селенитовой среды суспензию образца добавляют в соотношении 1:10 и инкубируют при температуре плюс (37 1) °C в течение (22 2) ч.

3.7. Наряду с использованием сред селективного обогащения, указанных в п. 3.6, возможно применение MSRV-агара и MKTTn-бульона. MSRV-агар предназначен для обнаружения подвижных бактерий рода Salmonella и не подходит для неподвижных штаммов Salmonella. MKTTn-бульон по сравнению с MKT-бульоном включает новобиоцин.

В качестве базовых сред можно применять комбинации сред RVS-бульона - MSRV-агара - MKTTn-бульона при исследовании пищевой продукции, предназначенной для употребления человеком и продукции для кормления животных, образцов окружающей среды из зоны прозводства и переработки пищевых продуктов, образцов, отобранных на стадии первичной переработки продовольственного сырья, таких как фекалии животных, пыль и смывы в соответствии с методическими документами <7>.

--------------------------------

<7> ISO 6579-1:2017 "Горизонтальный метод выявления, подсчета и определение серотипа бактерий рода бактерий рода Salmonella spp. Часть 1. Выявление бактерий рода Salmonella spp" (англ. "Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella. Part 1: Detection of Salmonella spp.").

Для MSRV-агара в качестве посевного материала используют 0,1 мл суспензии образца после неселективного обогащения (см. п. 3.5). 0,1 мл суспензии образца вносят на поверхность MSRV-агара (в центральную часть чашки Петри) в виде одной - трех равноудаленных капель. Капли не должны растекаться по поверхности агара.

Засеянные чашки MSRV-агара инкубируют при температуре плюс (41,5 1) °C в течение (24 3) ч. Чашки MSRV-агара не переворачивают.

На чашках MSRV-агара, предположительно содержащих сальмонеллы, проявляется серо-белая мутная зона, выходящая за пределы инокулированной капли. На чашках MSRV-агара, не содержащих сальмонеллы, зона роста отсутствует или не выходит за пределы инокулированной капли.

При наличии роста на MSRV-агаре определяют самую дальнюю точку непрозрачного роста в местах иннокуляции и погружают 1 мм³ петлю непосредственно внутри границы непрозрачного роста. Петлю извлекают, убедившись, что не извлекаются большие куски MSRV-агара. Делают высев на дифференциально-диагностические среды (п. 3.12).

3.8. Для нивелирования изменений в концентрации компонентов селективной среды обогащения при разбавлении анализируемой пробой используют посев пробы в среду обогащения двойной концентрации в соотношении объемов пробы и среды 1:1.

3.9. Дифференциально-диагностические среды делятся на слабоселективные и высокоселективные. К первым относятся питательная среда Эндо, Агар МакКонки, Агар с бриллиантовым зеленым. Ко вторым - Бактоагар Плоскирева, Сальмонелла-шигелла агар (англ. Salmonella Shigella Agar, далее - SS-агар), ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар (англ. xylose lysine deoxycholate agar, далее - XLD-агар, Рамбах агар, Висмут-сульфит агар, Гектоен-агар. Характер роста сальмонелл на указанных средах приведен в табл. 3.1.

3.10. Перед использованием плотные питательные среды подсушивают, на их поверхности не должна оставаться конденсационная жидкость.

3.11. Параллельно с высевом биологического материала на среды обогащения можно проводить прямой посев материала на плотные дифференциально-диагностические среды (приложение 2 к настоящим МУ). При посеве на плотные среды исследуемый материал наносят с помощью бактериологической петли, стерильного ватного тампона, пипетки, стеклянной палочки, затем при помощи бактериологической петли рассевают истощающим штрихом до изолированных колоний.

3.12. В качестве дифференциально-диагностических сред рекомендуется использовать XLD-агар в комбинации с агаризованной селективной средой. XLD-агар инкубируют при температуре плюс (37 1) °C в течение (22 2) ч. Второй селективный агар инкубируют в соответствии с инструкциями производителя. Высев на дифференциально-диагностические среды делают таким образом, чтобы получить хорошо изолированные колонии.

4.1.1. Основным типом клинического материала для лабораторной бактериологической диагностики сальмонеллеза является кал. Также для исследования на наличие сальмонелл могут быть использованы рвотные массы и промывные воды желудка, кровь, моча, а при наличии специальных показаний - желчь, дуоденальное содержимое, спинномозговая жидкость и секционный материал.

4.1.2. Материал для исследований следует доставлять в лабораторию в возможно короткий срок, но не позднее 12 ч после отбора, образцы кала - не позднее 3 - 4 ч.; посев крови производят в специальные флаконы для гемокультивирования сразу после забора у пациента (без транспортировки нативной крови).

4.1.3. В случае невозможности доставки в установленные сроки материал посылают в консерванте или в транспортной среде. Такой материал до исследования хранят при температуре плюс (5 1) °C не более 24 ч.

4.1.4. Кал собирают сразу после дефекации с помощью стерильной стеклянной палочки или деревянного шпателя. При наличии патологических примесей (например, слизь, кровь, гной) их включают в отбираемую пробу. В случае невозможности получения кала после дефекации материал берут непосредственно из прямой кишки с помощью "зонд-тампона", вводя его в кишку на 3 - 4 см. Тампон помещают в пробирку с консервантом.

При профилактических обследованиях лиц на носительство сальмонелл накануне отбора кала для исследования можно применить солевое слабительное (25 - 30 г магнезии сульфата - MgSO₄). Не принимается для исследования материал, взятый на дому в отсутствие медицинского работника.

4.1.5. Кровь для исследования берут в начале заболевания, а также повторно в период лихорадки или в разгар рецидивов стерильным шприцем из локтевой вены в объеме 2 - 10 мл (в зависимости от возраста пациента); в более поздние сроки или при слабовыраженной клинической картине - 15 - 20 мл. Возможно использовать микробиологические анализаторы детекции роста микроорганизмов (бактерий и грибов) в пробах крови и других стерильных в норме жидкостей.

У детей до одного года кровь берут из пальца, пятки или мочки уха.

4.1.6. Рвотные массы и промывные воды желудка отбирают при заболевании, сопровождающемся соответствующей симптоматикой, в объеме до 100 мл. Для исследования используют первые порции промывных вод, полученные без применения бактерицидных средств.

В случае кислой реакции (pH < 4,5) рвотных масс их перед посевом нейтрализуют 10%-м раствором бикарбоната натрия, промывные воды центрифугируют 15 минут при 3000 об./мин и в дальнейшем используют осадок. В случае невозможности центрифугирования допускается высев нативного материала.

4.1.7. Желчь (дуоденальное содержимое) собирают в стерильные пробирки или одноразовые контейнеры. При этом отдельно собирают дуоденальное содержимое, пузырную желчь и желчь из желчных протоков (порции A, B и C соответственно).

Кислая реакция, белесоватый оттенок, наличие хлопьев свидетельствуют о примеси желудочного сока и делают материал непригодным для бактериологического исследования.

4.1.8. Для анализа используют среднюю порцию мочи в объеме 20 - 30 мл, которую собирают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию. Мочу центрифугируют 15 минут при 3000 об./мин. Для исследования используют осадок. Допускается высев нативного материала.

4.1.9. Спинномозговая жидкость подлежит исследованию при наличии менингеального или менингоэнцефалитического синдромов. Пробу (3 - 5 мл) помещают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию, предохраняя материал от замораживания (можно использовать термос).

4.1.10. Операционный и секционный материал для исследования отбирают в случае необходимости при хирургических вмешательствах. Масса пробы должна быть не менее 20 г.

4.1.11. В сопроводительном документе указывается: какое учреждение направляет материал, фамилия, имя, отчество и возраст обследуемого, место работы (для детей - название детского учреждения или школы), дата заболевания, предполагаемый диагноз или показания к обследованию, дата и час отбора пробы материала, фамилия и должность лица, посылающего материал.

4.2.1. Доставленные в лабораторию образцы клинического материала подготавливают к посеву в среды обогащения и на дифференциально-диагностические среды.

4.2.2. Операционный и секционный материал массой не менее 20 г растирают в ступках.

4.3.1. Блок-схема алгоритма выделения сальмонелл из кала представлена в приложении 2 к настоящим МУ.

4.3.2. Образцы кала, доставленные в фосфатно-буферном растворе или физиологическом растворе, высевают в среды селективного обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1 (см. п. 3.6).

4.3.3. Образцы кала, доставленные в глицериновом консерванте или транспортной среде, высевают на среды селективного обогащения (см. п. 3.6) и параллельно высевают на плотные дифференциально-диагностические среды (см. п. п. 3.11, 3.12).

4.3.4. Образцы кала, доставленные без консерванта, суспендируют в физиологическом растворе в соотношении 1:5, высевают в селективные среды обогащения (см. п. 3.6) и параллельно высевают нативный образец на плотные дифференциально-диагностические среды (см. п. п. 3.11, 3.12).

4.3.5. Кровь, взятую из вены, высевают в селективную среду двойной концентрации в соотношении 1:1. В случае отсутствия селективной среды используют 10 - 20% желчный бульон для сальмонелл. После (18 2) часов инкубирования делают высев на дифференциально-диагностические среды (см. п. 3.12). При отрицательном результате делают повторные посевы на 3, 5, 8-е сутки.

4.3.6. Осадки (рвотные массы, промывные воды желудка и мочи) высевают в среды селективного обогащения (см. п. 3.6). В случае исследования материала без центрифугирования посев проводят в селективную среду обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1. По завершении обогащения проводят высев на дифференциально-диагностические среды (см. п. 3.12).

4.3.7. Каждую порцию желчи (дуоденального содержимого) высевают во флаконы со слабощелочным питательным бульоном в соотношении 1:10 и на дифференциально-диагностические среды (см. п. 3.12). Через (22 2) часа из флаконов осуществляют повторный высев на дифференциально-диагностические среды. В случае получения отрицательных результатов высев повторяют на 3, 5, 7-е сутки, используя среды слабой селективности (см. п. 3.9).

4.3.8. Спинномозговую жидкость высевают на плотные питательные среды в соответствии с методическими документами <8>.

--------------------------------

<8> Пункт 5.1 МУК 4.2.1887-04 "Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов", утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 04.03.2004.

4.3.9. Операционный и секционный материал высевают в селективные среды обогащения (см. п. 3.6) в соотношении 1:5. Допускается одновременный высев суспензии материала в селективные среды обогащения (см. п. 3.6) и на дифференциально-диагностические среды (см. п. 3.12).

4.3.10. При наличии другого клинического материала его высевают в селективные среды обогащения (см. п. 3.6) и 2 - 3 дифференциально-диагностические среды, комбинируя высоко- и слабоселективные среды (см. п. 3.9, п. 3.12).

5.1.1. Объектами исследования могут являться пищевые продукты и остатки пищи (блюд), употребленной заболевшими кишечной инфекцией, а также сырье и полуфабрикаты, которые использовали при ее приготовлении, суточные пробы готовой пищи и др. подозреваемые в качестве фактора передачи возбудителя инфекции.

5.1.2. Общие принципы отбора проб пищевых продуктов для микробиологических исследований описываются в документах по стандартизации <9>.

--------------------------------

<9> ГОСТ 31904-2012 "Методы отбора проб для микробиологических испытаний", введенный приказом Росстандарта от 05.06.2013 N 148-ст (далее - ГОСТ 31904-2012).

5.1.3. Мясо, птица и продукты их переработки. Отбор образцов мяса, птицы и продуктов их переработки осуществляется в соответствии с документами по стандартизации <10> и производится путем отбора образцов в потребительской таре, а также может включать методы смыва ополаскиванием, протирания и вырезания (иссечения) кусочков ткани продукта.

--------------------------------

<10> ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб", введенный в действие постановлением Госстандарта СССР от 21.05.1973 N 1291; ГОСТ 7702.2.0-2016 "Продукты убоя птицы, полуфабрикаты из мяса птицы и объектов окружающей производственной среды. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям", введенный приказом Росстандарта от 08.09.2016 N 1091-ст; ГОСТ 31467-2012 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям", введенный приказом Росстандарта от 18.10.2012 N 547-ст.

5.1.4. Яйца и яйцепродукты. Отбор образцов пищевых яичных продуктов, выработанных из пищевых яиц сельскохозяйственной птицы, осуществляется в соответствии с документами по стандартизации <11>.

--------------------------------

<11> ГОСТ 31720-2012 "Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Методы отбора проб и органолептического анализа", введенный приказом Росстандарта от 29.11.2012 N 1459-ст.

5.1.5. Рыба. Отбор образцов рыбы, нерыбных объектов и продукции, вырабатываемой из них, осуществляется путем отбора точечных (мгновенных) проб из разных мест продукции каждой вскрытой единицы транспортной тары или составлением объединенных проб в соответствии с документами по стандартизации <12>.

--------------------------------

<12> ГОСТ 31339-2006 "Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб", введенный приказом Ростехрегулирования от 27.12.2006 N 501-ст.

5.1.6. Молочные продукты. Объем выборки для конкретного наименования молочного продукта, а также отбор проб для анализа производится в соответствии с документами по стандартизации <13>. Отбор производится взвешиванием для сгущенных, полутвердых, твердых и сухих продуктов или измерением объема для жидких продуктов.

--------------------------------

<13> ГОСТ 26809.1-2014 "Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты", введенный приказом Росстандарта от 12.12.2014 N 1977-ст (далее - ГОСТ 26809.1-2014); ГОСТ 26809.2-2014 "Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты", введенный приказом Росстандарта от 10.12.2014 N 1954-ст (далее - ГОСТ 26809.2-2014).

5.1.7. Продукция предприятий общественного питания и многокомпонентные продукты. Пробы продукции предприятий общественного питания и многокомпонентных продуктов отбирают таким образом, чтобы в них входили все компоненты в том же соотношении, в котором они представлены в продукте. При необходимости допускается отбирать пробы каждого компонента отдельно.

5.1.8. Соления. Отбор проб соленых и квашеных овощей, соленых и моченых фруктов, их смесей и полуфабрикатов из них осуществляется в соответствии с документами по стандартизации <14>.

--------------------------------

<14> ГОСТ 34129-2017 "Овощи соленые и квашеные, фрукты соленые и моченые. Правила приемки, отбор и подготовка проб", введенный приказом Росстандарта от 29.08.2017 N 978-ст.

5.1.9. Консервированные продукты. Отбор проб продуктов переработки фруктов и овощей, мясных и мясорастительных консервов осуществляется в соответствии с документами по стандартизации <15>.

--------------------------------

<15> ГОСТ 26671-2014 "Продукты переработки фруктов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов", введенный приказом Росстандарта от 30.03.2015 N 197-ст.

Остатки консервов направляют в лабораторию непосредственно в той банке, из которой их использовали в пищу. Поступающая в лабораторию проба должна быть не поврежденной и не потерпевшей изменений при транспортировании или хранении. При отсутствии остатков консервов исследованию подлежит содержимое 2 - 5 невскрытых банок с аналогичной маркировкой.

5.1.10. Продукты, исследуемые по эпидемиологическим показаниям.

Остатки фактически употребляемой пищи отбирают в той посуде, в которой обнаружили.

Суточные пробы направляют для исследования непосредственно в той посуде, в которой они хранились в холодильнике.

5.1.11. Посуду, инструменты и материалы, соприкасающиеся с продуктом во время отбора проб, стерилизуют одним из способов: насыщенным паром - в течение 30 минут в автоклаве при температуре плюс (121 1) °C; горячим воздухом в стерилизаторе: с принудительной циркуляцией воздуха при температуре плюс 170 - 175 °C в течение 60 минут или без принудительной циркуляции воздуха при температуре плюс 180 - 185 °C в течение 15 минут, при температуре плюс 160 - 165 °C в течение 120 минут. Допускается обрабатывать инструменты погружением в этиловый спирт с последующим фламбированием.

5.1.12. Отобранные пробы, предназначенные для испытания вне предприятия-изготовителя, пломбируют и опечатывают печатью организации, в чьей собственности находится продукция, и транспортируют в лабораторию.

5.1.13. Каждую отобранную лабораторную пробу маркируют этикетками с указанием наименования продукта, предприятия-изготовителя, номера партии, даты (с указанием времени отбора проб) и местом проб отбора, а также цели микробиологического испытания.

5.1.14. При направлении проб продуктов дополнительно указывают, какой из продуктов подозревается в качестве фактора риска.

5.1.15. Пробы замороженных продуктов укладывают в изотермические емкости (термос, термоконтейнер) или обкладывают сухим льдом (CO₂), или упаковывают другим способом, обеспечивающим сохранение проб в замороженном состоянии при температуре, не превышающей минус (15 1) °C.

5.1.16. Пробы консервов и продуктов транспортируют в соответствии с условиями транспортирования продукции, установленными в нормативно-технической документации на конкретный вид продукции.

5.1.17. Пробы скоропортящихся продуктов транспортируют при температуре плюс 5 °C не более 6 ч, за исключением продуктов, на которые предусмотрены специальные условия, предусмотренные в нормативно-технической документации на конкретный вид продукта.

5.2.1. Выявление бактерий рода Salmonella: определение присутствия или отсутствия бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта осуществляется в соответствии с документами по стандартизации <16>.

--------------------------------

<16> ГОСТ 31904-2012.

5.2.2. При исследовании пищевых продуктов делают навеску. Величина навески определяется видом продукта, масса которого должна соответствовать микробиологическому нормативу <17> на отсутствие в нем бактерий рода Salmonella.

--------------------------------

<17> Приложение 1 технического регламента Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" (ТР ТС 021/2011), утвержденного решением Комиссии Таможенного союза от 09.12.2011 N 880, с изменениями, внесенными решениями Коллегии Евразийской экономической комиссии от 11.06.2013 N 129, от 10.06.2014 N 91, от 24.12.2019 N 236, решением Совета Евразийской экономической комиссии от 08.08.2019 N 115, от 14.07.2021 N 61, от 25.11.2022 N 173, от 23.06.2023 N 70.

5.2.3. Пищевые продукты плотной консистенции гомогенизируют или растирают в стерильных ступках.

5.2.4. Подготовку проб крема, сливочного масла, сметаны, кефира, мороженого и других молочных продуктов проводят в соответствии с документами по стандартизации <18>.

--------------------------------

<18> ГОСТ 26809.1-2014, ГОСТ 26809.2-2014.

5.2.5. Для пищевых продуктов с высоким содержанием соли следует использовать забуференную пептонную воду без добавления хлорида натрия (NaCl), а также более высокое соотношение навески продукта и забуференной пептонной воды для того, чтобы обеспечить снижение концентрации соли в суспензии для предварительного обогащения.

5.2.6. Жидкие пищевые продукты, имеющие кислую реакцию (pH < 4,5), перед посевом нейтрализуют 10%-м стерильным раствором бикарбоната натрия до слабощелочной реакции (pH 7,0 - 7,4).

5.2.7. При исследовании яиц скорлупу обрабатывают спиртом и обжигают, после чего яйца разбивают и отделяют желток и белок в стерильную посуду, объединяя отдельно по пять желтков и белков в одной пробе. Желтки и белки гомогенизируют и используют для посева. При необходимости помимо исследования внутренней микрофлоры яиц может потребоваться исследование обсемененности их поверхности, для чего проводят испытания в соответствии с п. 6.1.3.

5.3.1. Блок-схема алгоритма выделения сальмонелл из пищевых продуктов представлена в приложении 3 к настоящим МУ.

5.3.2. Для предварительного обогащения в неселективной жидкой среде необходимое количество анализируемого образца добавляют к соответствующему количеству забуференной пептонной воды комнатной температуры. Чаще всего используют навеску 25 г и 225 мл неселективной среды. Однако для некоторых типов образцов может потребоваться использование другого соотношения, указанного в соответствующей методической документации для анализируемого типа образца. Полученную пробу инкубируют при условиях, описанных в п. 3.5.

5.3.3. После инкубирования посевов на неселективной среде обогащения проводится процедура селективного обогащения на двух средах селективного обогащения (см. п. п. 3.6, 3.7).

RVS-бульон имеет преимущества перед другими селективными средами при исследовании сырых рыбных продуктов, креветок и высококонтаминированной пищи.

5.3.4. Материал, прошедший инкубацию на средах селективного обогащения, высевают на дифференциально-диагностические среды (см. п. 3.12).

6.1. Основными объектами окружающей среды, подлежащими исследованию на наличие сальмонелл, являются различные предметы на эпидемиологически значимых объектах и в лечебно-профилактических учреждениях, а также вода (питьевая, открытых водоисточников, сточная) и почва.

6.2.1. Отбор проб смывов осуществляют стерильными ватными или ватно-марлевыми тампонами. Тампоны монтируют на деревянной палочке или проволоке, пропущенной через пробку, помещают в пробирку и стерилизуют 30 минут при температуре плюс 120 °C. Затем в каждую пробирку наливают 2 мл предварительной среды обогащения - забуференной пептонной воды pH 7,0. Непосредственно перед отбором смыва тампон увлажняют, наклоняя пробирку, излишек влаги отжимают о стенку пробирки.

Также допускается использование транспортных систем (стерильные готовые к применению наборы, предназначенные для сбора и транспортировки образцов для их последующего микробиологического исследования).

6.2.2. Смывы берут с площади не менее 100 см², если нет специальных указаний для данного объекта.

6.2.3. При отборе смывов с яичной скорлупы один тампон используют для исследования 10 яиц.

Альтернативный способ исследования поверхностной обсеменнености яиц включает следующую процедуру. Неповрежденное яйцо целиком или его скорлупу помещают в стерильный пакет для отбора проб или другую стерильную посуду, добавляют забуференную пептонную воду в количестве, необходимом для полного смачивания. Затем пробу перемешивают, цельное яйцо извлекают и используют полученную жидкость в качестве исходной суспензии для последующих испытаний.

6.2.4. Отбор проб питьевой воды, поверхностных водных объектов и сточных вод проводят в соответствии с методическими документами <19>.

--------------------------------

<19> Глава XIII МУК 4.2.3963-23 "Бактериологические методы исследования воды", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 01.09.2023 (далее - МУК 4.2.3963-23).

6.2.5. Анализ почвы на наличие сальмонелл проводят по эпидемическим показаниям. Навеску в 50 г помещают в среду неселективного обогащения в соотношении 1:10 (см. п. 3.5).

6.3.1. Подготовка к исследованию воды необходима при использовании метода мембранной фильтрации. Фильтрация проводится в соответствии с методическими документами <20>.

--------------------------------

<20> Глава XIII МУК 4.2.3963-23.

6.4.1. Блок-схема алгоритма выделения сальмонелл из объектов окружающей среды представлена в приложении 4 к настоящим МУ.

6.4.2. Образцы смывов (см. п. п. 6.2.1 - 6.2.3) или навеску почвы в неселективной среде обогащения (см. п. 6.2.5) инкубируют (22 2) ч при температуре плюс (37 1) °C (см. п. 3.5). После инкубирования образцов проводят посев материала в две среды селективного обогащения (см. п. п. 3.6, 3.7).

6.4.3. При исследовании образцов воды (питьевой, поверхностных водных объектов и сточных вод) берут 2 пробы по 500 см³ и вносят в равный объем селективной среды обогащения двойной концентрации (см. п. п. 3.6, 3.8).

6.4.4. При использовании мембранной фильтрации для исследования полученные фильтры помещают в среды селективного обогащения (см. п. 3.6) объемом 100 см³ каждая.

6.4.5. Материал, прошедший инкубацию на средах селективного обогащения, высевают на дифференциально-диагностические среды (см. п. 3.12).

7.1. После инкубирования чашек с дифференциально-диагностическими средами в течение (22 2) ч производится учет характера роста. Единичную колонию, с характерным ростом для рода Salmonella, высевают на одну из сред для первичной идентификации (Агар Клиглера, Ресселя, Олькеницкого) или на скошенный питательный агар с последующим проведением биохимических тестов. С каждой чашки с дифференциально-диагностической средой анализируют по 3 - 5 колоний. В случае чрезвычайной эпидемической ситуации культуру, выросшую на указанных средах, можно использовать для последующей ориентировочной реакции агглютинации, но с обязательным подтверждением определения антигенной структуры чистой культуры.

7.2.1. О ферментации лактозы (и сахарозы) в среде Олькеницкого и ферментации лактозы в среде Клиглера и Ресселя судят по появлению желтой окраски в скошенной части агара, а о ферментации глюкозы - по такому же окрашиванию в столбике. Газообразование устанавливают по наличию пузырьков газа и разрыву агара, а образование сероводорода - по почернению среды. В среде Олькеницкого при росте культуры, гидролизирующей мочевину, среда приобретет диффузный яркий красно-малиновый цвет.

7.2.2. У подозрительных культур изучают ферментативные характеристики, позволяющие определить родовую принадлежность выделенных бактерий. Для этих целей используют тесты, позволяющие определить способность к образованию индола, наличие роста на средах с цитратами, наличие лизин-декарбоксилазы, фенилаланиндезаминазы, способность к разложению мочевины и образованию ацетил-метил-карбинола в реакции Фогес-Проскауэра. Ставят также пробу с метиловым красным и определяют подвижность.

7.2.3. Сальмонеллы индола не образуют, способны расти на средах с цитратами, декарбоксилировать лизин (за исключением некоторых штаммов S. Typhimurium, S. Enteritidis), не имеют фенилаланиндезаминазы, не разлагают мочевину, отрицательны в реакции Фогес-Проскауэра, положительны в пробе с метил-рот, подвижны (за исключением S. Gallinarum).

7.2.4. Если культура не ферментирует лактозу, не расщепляет мочевину, но ферментирует глюкозу с газообразованием и образует сероводород, то она подозрительна на принадлежность к роду Salmonella и подвергается дальнейшему изучению.

7.2.5. Для определения таксономической принадлежности культур рекомендуется использовать современные системы для идентификации микроорганизмов, зарегистрированные и разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке <21>:

--------------------------------

<21> Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

- пластины биохимические, дифференцирующие энтеробактерий (например, набор для идентификации Enterobacteriaceae Api20E <22>);

--------------------------------

<22> Примечание: допускается использовать биохимические, дифференцирующие энтеробактерин пластины с аналогичными или лучшими характеристиками.

- автоматические микробиологические анализаторы для качественного и количественного определения микроорганизмов (например, БАК ТРАК, VITEK <23>);

--------------------------------

<23> Примечание: допускается использовать автоматические микробиологические анализаторы для качественного и количественного определения микроорганизмов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- прямое белковое профилирование культуры бактерии с использованием программно-аппаратного комплекса с системой времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (англ. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry, далее - MALDI-ToF MS) (например, MALDI Biotyper <24>). Идентификация на основе прямого белкового профилирования обладает высокой диагностической и экономической эффективностью, быстротой получения результатов и простотой выполнения исследования и позволяет провести идентификацию штамма только до рода Salmonella.

--------------------------------

<24> Примечание: допускается использовать программно-аппаратные комплексты MALDI-ToF MS с аналогичными или лучшими характеристиками.

Серотипирование штамма сальмонеллы включает в себя определение O-антигена (соматический (термостабильный), и H-антигена (жгутиковый (термолабильный). Большинство сероваров сальмонелл имеют H-антиген двух фаз. Такие сальмонеллы называют двуфазными (например, S. Typhimurium антигенная формула - O: 1, 4, [5]; H : 12: i : 1, 2). Известны монофазные серовары сальмонелл (например, S. Enteritidis, антигенная формула - O: 1, 9, 12; H: g, m : -). Неподвижные (бесфазные) - S. Gallinarum (O: 1, 9, 12; H: - : -).

Определение серовара основано на комбинации O- и H-антигенов (приложение 5 к настоящим МУ), каждый из которых (в том числе каждая фаза H-антигена) характеризуется набором комплекса факторов. Вся совокупность факторов представляет антигенную формулу.

7.3.1.1. Определение O- и H-антигенов проводится в реакции агглютинации на стекле.

Диагностические агглютинирующие адсорбированные сыворотки содержат антитела к O- и H-антигенам сальмонелл, которые образуют агглютинат с бактериями, обладающими соответствующими антигенами.

7.3.1.2. Растворять сухие сальмонеллезные O- и H-сыворотки следует в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия (или 2,0 мл) в соответствии с инструкцией изготовителя.

7.3.1.3. На предметное стекло наносится одна капля сыворотки и одна капля изотонического раствора хлорида натрия. С питательного агара берется полная петля культуры, выращенной при температуре плюс (37 1) °C в течение (22 2) часов. Культура наносится на предметное стекло вблизи капли изотонического раствора хлорида натрия и эмульгируется (контроль на отсутствие спонтанной агглютинации). При отсутствии спонтанной агглютинации манипуляцию повторяют в капле O- и H-сыворотки, формируя равномерную непрозрачную суспензию. Учет результатов проводят в течение 1 - 2 минут, мягко покачивая стекло. Агглютинация проявляется через несколько секунд (или 1 минуту) в виде хлопьев (зерен) агглютината, формирующихся внутри капли на фоне ее просветления. Образование хлопьев агглютината внутри капли расценивается как положительный результат. Гомогенная суспензия свидетельствует об отрицательном результате. Штаммы, находящиеся в R-форме, обладают самопроизвольной агглютинацией. Их дальнейшее серотипирование не представляется возможным без дополнительных манипуляций. Такие штаммы пересевают на слабощелочной агар для того, чтобы выбрать колонию с ровными краями и вернуть штамм в S- (гладкую) форму и повторить агглютинацию. Результаты определения O- и H-антигенов штамма фиксируются в протоколе лабораторных исследований.

7.3.1.4. Если агглютинация с поливалентными O-сыворотками не происходит, а по биохимическим свойствам культура соответствует роду Salmonella, такой штамм направляется в Референс-центр по мониторингу за сальмонеллезами ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора <25> (далее - Референс-центр).

--------------------------------

<25> Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации" (далее - Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116).

7.3.1.5. Для реакции агглютинации с O-сывороткой следует брать культуру с верхней части скошенного агара, для H-сывороток - конденсат или с нижнего участка роста (наиболее подвижные бактерии).

7.3.1.6. Серологическую идентификацию сальмонелл начинают с испытания их в реакции агглютинации на стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сывороткой к сальмонеллам групп A, B, C, Д, E, а в случае получения отрицательного результата с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сывороткой к сальмонеллам редких групп (F-67).

7.3.1.7. При получении положительных результатов агглютинации со смесью O-сывороток культуру испытывают с каждой O-сывороткой (входящей в смесь) по отдельности. После установления принадлежности культуры к одной из O-групп выявляют наличие дополнительных O-антигенов, присущих представителям указанной группы.

7.3.1.8. Для определения H-антигенов используют ту же культуру, выросшую на питательном агаре. Для исследования берут полную петлю культуры из суспензии, образованной путем смеси культуры и конденсата внутри пробирки со скошенным агаром. Вначале используют H-сыворотки, соответствующие H-антигенам 1 фазы, а затем H-антигенам 2 фазы. Начинать следует с H-сывороток, соответствующих более распространенным сероварам данной группы.

7.3.1.9. Образование хлопьев агглютината внутри капли расценивается как положительный результат. Гомогенная суспензия свидетельствует об отрицательном результате. Если культура малоподвижна, можно применять полужидкий (0,7%) агар, условно называемый агаром для роения. В центр чашки добавляют 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия и вносят петлю исследуемой культуры. Посев инкубируют (22 2) ч при температуре плюс (37 1) °C.

7.3.1.10. В случае отсутствия реакции агглютинации с сыворотками одной из H-фаз проводят инверсию (подавление) обнаруженной H-фазы (метод Свена-Гарда). Для определения не выявленного H-антигена готовят чашки Петри с полужидким (0,7%) агаром. После застывания агара в центр чашки добавляют 0,1 мл сыворотки против выявленного H-антигена первой или второй фазы, а затем в центр капли петлей наносят культуру. Вместо чашки можно использовать U-образную трубку. Инкубировать посев (22 2) ч при температуре плюс (37 1) °C (чашки не переворачивать).

7.3.1.11. Соответствующая сыворотка (антитела) связывает выявленный H-антиген, подвижность (роение) штамма будет происходить за счет клеток, содержащих H-антиген не обнаруживаемой фазы. Неизвестная фаза H-антигена определяется тем же способом, что и выявленная. При этом культура берется с периферии выросшей макроколонии или с противоположного относительно посеву колена U-образной трубки.

7.3.1.12. После суммирования результатов O- и H-серотипирования определяется серовар штамма согласно в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта (см. приложение 5 к настоящим МУ).

7.4.1. В пределах некоторых сероваров сальмонелл наблюдается различная ферментативная активность штаммов в отношении отдельных углеводов, органических кислот или многоатомных спиртов. Это позволяет проводить биохимическое типирование штаммов сальмонелл, относящихся к одному серовару.

7.4.2. Типирование можно осуществлять по любой комбинации тестов, по отношению к которым выявлены вариабельные свойства у штаммов одного серовара.

7.4.3. Наибольшее число биоваров сальмонелл выявлено среди штаммов S. Typhimurium.

7.4.4. Определение биоваров S. Enteritidis проводят по способности к ферментации бульона Штерна и наличию лизиндекарбоксилазы. S. Enteritidis var. ratin характеризуется отсутствием указанных ферментов, а S. Enteritidis var jena - их наличием. Определение штаммов S. Enteritidis var. ratin имеет важное эпидемиологическое значение, так как ранее, вопреки рекомендациям ВОЗ по их запрету, такие штаммы использовали для борьбы с грызунами [7]. При выделении таких штаммов их необходимо направлять в Референс-центр для подтверждения.

7.4.5. В схеме Кауфмана-Уайта (см. приложение 5 к настоящим МУ) выделяемые ранее серовары сальмонелл, имеющие одинаковую антигенную структуру и отличающиеся только по биохимическим характеристикам, объединены в один серовар (S. Isangi объединена с S. Mission, S. Gallinarum с S. Pullorum, S. Paratyphi B с S. Java). Кроме этого, O-группа E1 объединена с O-группой E2 и E3.

7.4.6. Могут встречаться "безгазовые варианты" штаммов (ферментирующие глюкозу до кислоты, без газообразования), многих сероваров.

7.5.1. По окончании идентификации выделенных культур из исследуемых проб в документе о результатах проведенного исследования (например, журнал регистрации патогенных биологических агентов, объектов (проб, образцов), поступивших для исследования <26>) указывается, обнаружены или не обнаружены бактерии рода Salmonella: "В пробе X бактерии рода Salmonella не обнаружены" или "В пробе X обнаружены бактерии рода Salmonella серовар Y", где вместо "Y" указывается идентифицированный серовар Salmonella или антигенная формула серовара (см. приложение 5 к настоящим МУ), а вместо "X" указываются характеристики в зависимости от вида пробы:

--------------------------------

<26> Таблица 1 приложения 7 СанПиН 3.3686-21.

- для пробы клинического материала указывается тип клинического материала (согласно п. 4.1.1) с идентификационным номером пробы;

- для пробы пищевого продукта указывается наименование пищевого продукта или сырья с информацией о массе (x грамм) или объеме (x см³) исследованной пробы с идентификационным номером пробы;

- для пробы объекта окружающей среды указывается наименование объекта или участка исследованной поверхности с информацией о массе (x грамм) или объеме (x см³) исследованной пробы с идентификационным номером пробы.

7.5.2. Род, вид и серовар для бактерий рода Salmonella приводится в соответствии с п. 2.4. В случае отсутствия информации о сероваре указывается "В пробе X обнаружены бактерии рода Salmonella".

7.5.3. При выполнении количественного анализа проб питьевой воды, поверхностных водных объектов и сточных вод наиболее вероятное число сальмонелл (НВЧ) в 1000 см³ воды определяют в соответствии с методическими документами <27>.

--------------------------------

<27> Приложение 8 МУК 4.2.3963-23.

8.1. Бактериологическая диагностика имеет приоритетное значение, так как выделение возбудителя позволяет получить полную информацию о его фенотипических и генотипических свойствах, включая чувствительность к антимикробным препаратам.

8.2. Серологический метод диагностики бактериальных острых кишечных инфекций (далее - ОКИ) (шигеллезов, сальмонеллезов, брюшного тифа и паратифов) является ретроспективным, регистрирует иммунный ответ макроорганизма на инфицирование появлением специфических антител к O-антигенам возбудителей.

8.3. Диагностическое значение имеет определение в сыворотке крови инфицированных лиц количественного содержания (уровня) суммарных антител и иммуноглобулина G (IgG).

8.4. Серологическая диагностика способствует совершенствованию системы эпидемиологического надзора за ОКИ, так как количественная и качественная характеристика иммунного ответа на встречу с возбудителями позволяет диагностировать стертые и субклинические формы болезни, выявлять ранее переболевших, обеспечивает более полную и обоснованную информацию для оценки активности эпидемического процесса.

8.5. Серологический метод позволяет дифференцировать транзиторное носительство от субклинической форм заболеваний. При транзиторном носительстве отсутствует достоверный сдвиг в уровнях сывороточных антител. Наличие положительной динамики указывает на развитие патологического процесса, который может характеризоваться субклиническим течением.

8.6. Выявление антител и определение их класса может использоваться для оперативного эпидемиологического анализа в очагах ОКИ с целью уточнения фактической распространенности инфекции в коллективе и поиска источника. Выявление всех инфицированных в очаге позволяет конкретизировать санитарно-противоэпидемические (профилактические) мероприятия и способствует ликвидации очага.

8.7. Использование реакции пассивной гемагглютинации (далее - РПГА) для диагностики сальмонеллезов имеет вспомогательное значение, т.к. в крови практически здоровых или привитых людей могут присутствовать антитела к антигенам сальмонелл. Вследствие этого понятие "диагностического титра" антител носит весьма условный ориентировочный характер. Следует учитывать и то, что для разных районов страны величина "диагностического титра" будет различной, что связано с территориальными особенностями эпидемической ситуации. Большее диагностическое значение имеет нарастание уровня антител в динамике заболевания, для чего сыворотку нужно брать сразу после выявления больного, а затем в конце первой или в начале второй недели болезни. В более поздние сроки заболевания уровень антител снижается, что также может служить диагностическим критерием.

8.8. Серологическая диагностика сальмонеллезов проводится в соответствии с методическими документами <28>.

--------------------------------

<28> МР 4.2.0249-21 "Серологическая диагностика острых кишечных инфекций методом РПГА (шигеллеза, сальмонеллеза и брюшного тифа)", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 20.05.2021.

9.1.1. Все работы, связанные с применением молекулярно-генетических методов при исследовании материала, содержащего микроорганизмы рода Salmonella, проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <29>, а также методическими документами <30>.

--------------------------------

<29> Глава IV СанПиН 3.3686-21; глава X СанПиН 2.1.3684-21 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 3 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный N 62297), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 26.06.2021 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 07.07.2021, регистрационный N 64146), от 14.12.2021 N 37 (зарегистрировано Минюстом России 30.12.2021, регистрационный N 66692), 14.02.2022 N 6 (зарегистрировано Минюстом России 17.02.2022, регистрационный N 67331).

<30> МУ 1.3.2569-09.

9.1.2. Молекулярно-генетические методы исследования в отношении микроорганизмов рода Salmonella обладают особенностями, которые необходимо учитывать при определении оптимальной области их применения и правильной интерпретации получаемых результатов:

- объектом детекции является ДНК возбудителя, обнаружение которой не является доказательством жизнеспособности микроорганизма;

- аналитическая чувствительность различных тест-систем на основе МАНК колеблется в пределах 100 - 500 бактериальных клеток/мл и в ряде случаев может уступать аналитической чувствительности микробиологического исследования с использованием сред селективного обогащения.

9.1.3. При работе с пробами пищевых продуктов и пробами объектов окружающей среды обнаружение ДНК сальмонелл требует дополнительного микробиологического исследования для выявления культуры возбудителя.

9.1.4. При работе с клиническим материалом обнаружение ДНК сальмонелл может использоваться в качестве скринингового диагностического теста при групповой заболеваемости сальмонеллезом и у пациентов с антибактериальной терапией, начатой до первичного лабораторного исследования.

9.1.5. Обнаружения нежизнеспособных микроорганизмов дает возможность результативного исследования образцов при неинформативности микробиологического метода (пищевые продукты после термической обработки, с нарушенными сроками хранения, клинические образцы от пациентов после проведения антибактериальной терапии). Тест-системы на основе МАНК для выявления ДНК бактерий рода Salmonella могут выявлять все микроорганизмы рода Salmonella, включая и возбудителей тифо-паратифозных заболеваний, без серогрупповой дифференцировки между ними.

9.2.1. Для выявления ДНК микроорганизмов рода Salmonella в клиническом и биологическом материале используются диагностические тест-системы, зарегистрированные и разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке <31>. Используются диагностические тест-системы, обладающие максимальной степенью контаминационной безопасности (тест-системы с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени или по конечной точке).

--------------------------------

<31> Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

9.2.2. Клинический материал для исследования (образцы кала, рвотные массы, желчь) следует забирать, исключая его возможную контаминацию ДНК, содержащейся в продезинфицированной посуде (использовать стерильные контейнеры, одноразовые пластиковые пакеты, подкладываемые в судно перед дефекацией, производить забор кала из памперсов или в автоклавированную для разрушения остаточной ДНК многоразовую посуду).

9.2.3. При одновременном проведении молекулярно-генетического и микробиологического исследований возможен унифицированный забор клинического материала (см. п. 9.2.2). При невозможности исследования нативного кала возможно его хранение в виде суспензии с использованием транспортных сред в соответствии с инструкцией производителя транспортной среды. При необходимости длительного хранения проб проводить молекулярно-генетические исследования можно при замораживании образцов в транспортных средах с криопротектором в соответсвии с инструкцией производителя тест-системы. Забор материала проводится в объеме 2 - 5 мл.

9.2.4. Условия и сроки хранения и транспортировки клинического материала, а также методы его предварительной обработки определяются в соответствии с инструкцией производителя тест-системы.

9.2.5. Исследование пищевых продуктов на наличие ДНК сальмонелл проводят в соответствии с методическими документами <32>. Выделение ДНК микроорганизмов рода Salmonella из проб пищевых продуктов и объектов окружающей среды проводят после селективного обогащения образца в соответствии с п. п. 3.6, 3.7, 5.3.3, 6.3.2. Дальнейшее выявление ДНК сальмонелл в культуральной среде проводят в соответствии с инструкцией производителя тест-системы.

--------------------------------

<32> ГОСТ Р 57989-2017 "Продукция пищевая специализированная. Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции", введенный приказом Росстандарта от 24.11.2017 N 1825-ст; МУК 4.2.2872-11 "Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 15.06.2011.

9.3.1. Исследования по оценке степени генетического сходства штаммов сальмонелл в рамках реализации федерального государственного санитарно-эпидемиологического контроля (надзора) проводятся на базе соответствующих референс-центров, региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности, центров секвенирования и научно-исследовательских организаций <33>.

--------------------------------

<33> Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116.

9.3.2. В рамках реализации федерального государственного санитарно-эпидемиологического контроля (надзора) для оценки степени генетического сходства ДНК микроорганизмов рода Salmonella используют методы субвидового генетического типирования, обеспечивающие:

- необходимую для исследований разрешающую способность (способность дифференцировки штаммов микроорганизмов внутри определенного серовара сальмонелл, циркулирующих на данной территории);

- межлабораторную воспроизводимость результатов исследований, отсутствие субъективизма при интерпретации их результатов;

- эпидемиологическую согласованность - соответствие данных эпидемиологического анализа результатам субвидового генетического типирования, обеспечиваемое стабильностью изучаемого признака в рамках эпидемиологического явления.

9.3.3. Различные методы субвидового генетического типирования микроорганизмов рода Salmonella, выделенных из различных источников, имеют максимальную информативность при их использовании на чистых культурах, выделенных при первичном исследовании образцов.

9.3.4. Перечень рекомендованных к применению методов генетического субвидового типирования микроорганизмов рода Salmonella:

- полногеномное секвенирование ДНК изолированной из чистых культур с реализацией алгоритмов в формате сравнения ортологичных однонуклеотидных вариаций, расположенных на хромосомной ДНК или полногеномное мультилокусное секвенирование-типирование (англ. multilocus sequence typing, MLST). Полногеномное секвенирование является референтным методом субвидового типирования для бактериальных изолятов.

- анализ набора продуктов рестрикции тотальной ДНК в пульсирующем электрическом поле (например, электрофорез в пульсирующем поле (англ. pulsed-field gel electrophoresis (далее - PFGE) с обязательным использованием стандартизированных протоколов и применением специализированного программного обеспечения для объективного учета результатов. Длительно применявшийся в качестве базового метода субтипирования, имеющий относительно низкую себестоимость и универсальность (возможность исследования различных видов бактерий). Ограниченно негативное влияние на эпидемиологическую конкордантность метода может оказывать участие плазмид в формировании анализируемого паттерна, существование высококлональных серотипов сальмонелл (штаммы которых имеют высокую генетическую схожесть между друг другом), например, штаммы S. Enteritidis.

- анализ участков геномной ДНК бактерии, содержащих тандемные повторы с переменной копийностью (англ. multiple locus variable number of tandem repeats analysis, далее - MLVA) с обязательным использованием стандартизированных протоколов и применением специализированного программного обеспечения для объективного учета результатов. Метод, характеризующийся высокими показателями дифференцирующей способности (в сравнении с PFGE) и воспроизводимостью. Унифицированность (в сравнении с PFGE) метода в отношении различных патогенов более низкая и достигается на уровне вида или серовара.

9.3.5. Результаты оценки степени генетического сходства штаммов получают эпидемиологическую интерпретацию в рамках комплексного эпидемиологического расследования, так как в изолированном виде не могут свидетельствовать о эпидемиологической связи между источниками их выделения, а позволяют лишь исключить наличие такой связи.

9.3.6. Заключение по результатам оценки степени генетического сходства ДНК штаммов Salmonellaм может включать следующую информацию:

- количество, состояние полученных культур микроорганизмов;

- краткое описание используемой методики с указанием используемого оборудования и программного обеспечения, при использовании метода полногеномного секвенирования - основные метрики результатов секвенирования, результаты молекулярного серотипирования, степень генетического сходства штаммов. В зависимости от целей исследования могут быть представлены и другие результаты анализа, например, наличие генов - генетических детерминант резистентности, генов - генетических детерминант вирулентности, филогенетический анализ в который включены штаммы сальмонелл сходного серотипа, циркулирующие на смежных территориях Российской Федерации и (или) за рубежом;

- при использовании методик, результаты которых имеют форму паттернов (MLVA, PFGE), краткое описание используемой методики с указанием используемого оборудования и программного обеспечения, графическое представление полученных результатов, а также заключение о степени генетического сходства штаммов.

9.3.8. При получении дискордантных результатов между рекомендованными методами субвидового генетического типирования (PFGE, MLVA) учитываются результаты метода, продемонстрировавшего более высокую дифференцирующую способность на исследуемой выборке образцов.

9.3.9. Результаты применения методов полногеномного секвенирования бактериальных патогенов имеют количественный характер, требующий различных критериев интерпретации степени генетического сходства при разных эпидемиологических явлениях.

1. При проведении лабораторной диагностики сальмонеллезов, обнаружении сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды применяют средства измерений, вспомогательное и испытательное оборудование, расходные материалы и реактивы, приведенные в таблицах П1.1 - П1.3.

--------------------------------

<34> Примечание:

<1> - при отсутствии одной или обеих сред, допускается замена на магниевую и (или) селенитовую среды (суспензию образца добавляют в соотношении 1:10 или в равном объеме среды двойной концентрации, инкубируют при температуре плюс (37 1) °C (22 2) ч).

--------------------------------

<35> Примечание:

<1> - используется навеска продукта, масса которого соответствует величине норматива на бактерии рода Salmonella в исследуемом продукте при соотношении навески продукта и среды обогащения 1:10;

<2> - время инкубации при неселективном обогащении может зависеть от рекомендаций производителя забуференной пептонной воды;

<3> - при отсутствии одной или обеих сред, допускается замена на магниевую и (или) селенитовую среды (суспензию образца добавляют в соотношении 1:10 или в равном объеме среды двойной концентрации, инкубируют при температуре плюс (37 1) °C (22 2) ч);

<4> - RVS-бульон имеет преимущества перед другими селективными средами при исследовании сырых рыбных продуктов, креветок и высококонтаминированной пищи.

--------------------------------

<36> Примечание:

<1> - при отсутствии одной или обеих сред, допускается замена на магниевую и (или) селенитовую среды (суспензию образца добавляют в соотношении 1:10 или в равном объеме среды двойной концентрации, инкубируют при температуре плюс (37 1) °C (22 2) ч).

1. Для точного определения серовара необходимо определение дополнительных биохимических свойств выделенной культуры в связи с тем, что отдельные серовары имеют идентичную антигенную структуру и различаются только по ферментативным свойствам (табл. П5.1).

2. Схема Кауфмана-Уайта изложена в таблицах П5.2 - П5.20 и в них используются следующие обозначения:

"_" - подчеркнутые факторы O определяются конверсией фага (например, , 14, 18). Они присутствуют только в том случае, если культура лизогенизирована соответствующим конвертирующим фагом. Эти факторы добавляются к факторам, присутствующим в неконверсированном штамме (например, 6, 7 -> 6, 7, 14), кроме группы O:3, 10 (см. ниже). Эти подчеркнутые факторы указаны в табл. для сероваров, в которых они обнаружены. Данная ситуация может повторяться для всех сероваров одной группы O.

"{}" - O-факторы, указанные в фигурных скобках, являются исключающими. В одном сероваре одни факторы в фигурных скобках не могут сосуществовать с другими факторами в фигурных скобках. Некоторые факторы могут быть фаг-детерминированными (подчеркнуто). В группе O:3, 10, факторы O:15 или O:15, 34, когда присутствуют, заменяют O:10. Для обозначения этого явления используются следующие символы: O:3, {10}, {15}, {15, 34}.

"[ ]" - фактор O (без подчеркивания) или фактор H могут присутствовать или отсутствовать независимо от фаговой конверсии. Пример: фактор [5] группы O:4 (B). Когда H-факторы заключены в квадратные скобки, это означает, что они встречаются исключительно у диких штаммов. Например, большинство штаммов Paratyphi A обладают монофазным антигеном фазы 1 (a). Могут быть выделены двухфазные штаммы с H фазой 2:1,5. По этой причине [1, 5] упоминается в квадратных скобках в формуле этого серовара.

"()" - O или H слабоагглютинируемые факторы. H-фактор (k) у S. enterica subsp. arizonae слабо агглютинируется стандартной анти-к-сывороткой (приготовленной против S. enterica subsp. enterica), но обычно агглютинируется поливалентной k-сывороткой.