"ГОСТ Р 72253-2025. Национальный стандарт Российской Федерации. Материал посадочный плодовых и ягодных культур. Фитосанитарные требования"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 01.09.2025 N 975-ст)

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением "Федеральный научный селекционно-технологический центр садоводства и питомниководства" (ФГБНУ ФНЦ Садоводства), Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский центр карантина растений" (ФГБУ "ВНИИКР"), Федеральным государственным бюджетным учреждением "Российский сельскохозяйственный центр" (ФГБУ "Россельхозцентр")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 359 "Семена и посадочный материал"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 1 сентября 2025 г. N 975-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт распространяется на посадочный материал (подвои, черенки, саженцы, рассаду) плодовых и ягодных культур, предназначенный для реализации и закладки маточных и многолетних насаждений, адаптированные растения садовых культур после культуры in vitro.

Настоящий стандарт устанавливает фитосанитарные требования к посадочному материалу плодовых и ягодных культур в питомниках различных форм собственности или специализированных в них подразделениях, осуществляющих производство; на самостоятельных предприятиях, имеющих собственный генофонд плодовых и ягодных культур и специализирующихся на получении исходных растений перспективных сортов и гибридов плодовых и ягодных культур (селекционно-питомниководческих и селекционно-семеноводческих центрах), в питомниках, осуществляющих свою деятельность по тиражированию исходных растений на основе договора с селекционно-питомниководческим или селекционно-семеноводческим центром, базовых питомниках всех форм собственности, а также предназначен для питомников, выпускающих сертифицированный (проверенный) посадочный материал репродукций I, II, III, а также на растительный материал, ввозимый из-за рубежа согласно [1].

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.010 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.3.041 Система стандартов безопасности труда. Применение пестицидов для защиты растений. Требования безопасности

ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.011 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и квалификация

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 12.4.103 Система стандартов безопасности труда. Одежда специальная защитная, средства индивидуальной защиты рук и ног. Классификация

ГОСТ 12430-2019 Карантин растений. Методы и нормы отбора образцов подкарантинной продукции при карантинном фитосанитарном досмотре и лабораторных исследованиях

ГОСТ 21507 Защита растений. Термины и определения

ГОСТ 28311 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 33662.1 (ISO 5149-1:2014) Холодильные системы и тепловые насосы. Требования безопасности и охраны окружающей среды. Часть 1. Определения, классификация и критерии выбора

ГОСТ 33829 Защита растений. Требования к производству продукции растительного происхождения при риске развития чрезвычайной фитосанитарной ситуации

ГОСТ 34231 Материал посадочный плодовых и ягодных культур. Термины и определения

ГОСТ IEC 61010-2-020 Безопасность электрических контрольно-измерительных приборов и лабораторного оборудования. Часть 2-020. Частные требования к лабораторным центрифугам

ГОСТ ISO/IEC 17025-2019 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ Р 8.857 Государственная система обеспечения единства измерений. pH-метры. Методика поверки

ГОСТ Р 53228 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 54109 Защитные технологии. Продукция полиграфическая защищенная. Общие технические требования

ГОСТ Р 56169 Оптика и оптические приборы. Микроскопы операционные. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ Р 58972 Оценка соответствия. Общие правила отбора образцов для испытаний продукции при подтверждении соответствия

ГОСТ Р 59653 Материал посадочный плодовых и ягодных культур. Технические условия

ГОСТ Р ЕН 12469 Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 34231, ГОСТ Р 59653, ГОСТ 21507, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 фитосанитарные требования: Обязательные для исполнения фитосанитарные правила, подтверждающие надлежащее состояние посадочного материала, отсутствие в нем вредных, опасных для природы или человека организмов, зафиксированные в нормативных правовых документах.

3.1.2 фитосанитарный мониторинг: Система наблюдений за состоянием защищенности экосистем, их компонентов или продукции растительного происхождения от вредных организмов, наблюдений за вредными организмами и влияющими на них факторами окружающей среды, проводимых в постоянном режиме для анализа, оценки и прогноза фитосанитарной обстановки на определенной территории, а также для определения причинно-следственных связей между состоянием растений и воздействием факторов среды обитания.

3.1.3 повреждение [поражение] растения вредным организмом: Повреждение [поражение] отдельных органов живого растения или продукции растительного происхождения, вызванное деятельностью вредного организма.

3.1.4 болезнь растений: Нарушение нормального обмена веществ клеток, органов и целого растения под влиянием фитопатогена, неблагоприятных условий окружающей среды или их сопряженного воздействия.

3.1.5 фитопатоген: Организм, вызывающий заболевание растений.

3.1.6 бактериоз растений: Болезнь растений, вызываемая бактериями.

3.1.7 вироз растений: Болезнь растений, вызываемая вирусами.

3.1.8 микоз растений: Болезнь растений, вызываемая грибами и грибоподобными организмами.

3.1.9 зараженность: Присутствие живого организма, вредного для растения или продукции растительного происхождения.

3.1.10 кандидат в исходное растение in vitro: Растение, свободное от основных вредоносных вирусов, полученное путем оздоровления с применением in vitro.

Примечание - Перед его тиражированием с целью получения исходных растений требуется проверка на продуктивность и генетическую стабильность, которая проводится комиссионно селекционерами и технологами, а исходному растению присваивается наименование - клон.

3.1.11 кандидат в исходное растение in vivo: Растение, свободное от основных вредоносных вирусов, проверенное на продуктивность, полученное без применения in vitro.

Примечание - При его тиражировании с целью получения исходных растений не требуется проверка на продуктивность и генетическую стабильность.

3.1.12 исходное растение: Растение плодовой (ягодной) культуры, полученное от кандидата в исходное растение способами вегетативного размножения, исключающими нарушение генетической стабильности помологического сорта или его клона (в случае применения для оздоровления in vitro), проверяемое на пораженность болезнями и вредителями и тестируемое на наличие наиболее вредоносных вирусов.

Примечание - Предназначено для тиражирования с целью закладки репозиториев и базисных маточников, содержащееся в условиях, исключающих заражение растения, и используемое для получения компонентов, применяемых при производстве базисных растений.

3.1.13 базисное растение: Растение плодовой (ягодной) культуры, полученное от исходного растения способами вегетативного размножения, исключающими нарушение генетической стабильности помологического сорта или клона (за исключением семенных подвоев), возникновение мутаций и химер, проверяемое на пораженность болезнями и вредителями и тестируемое на наличие вредоносных вирусов.

Примечание - Предназначено для закладки базисного маточника, возделываемого в условиях, исключающих вторичное заражение растений, и используемого для получения компонентов, применяемых при производстве сертифицированных/проверенных растений.

3.1.14 сертифицированное [проверенное] растение: Вегетативное потомство базисного/проверенного растения плодовой (ягодной) культуры, отвечающее требованиям сортовой и фитосанитарной чистоты, тестируемое на наличие наиболее вредоносных вирусов.

Примечание - Предназначено для закладки сертифицированного [проверенного] маточника, используемого для получения компонентов, применяемых при производстве сертифицированных [проверенных] растений первой и последующих репродукций. Условия содержания сертифицированного [проверенного] маточника те же, что и для базисных растений.

3.1.15 репродукция сертифицированного [проверенного] растения: Вегетативное потомство сертифицированного [проверенного] растения плодовой (ягодной) культуры, полученное посредством последовательного размножения с соответствующим понижением категории, отвечающее требованиям сортовой и фитосанитарной чистоты, тестируемое на наличие наиболее вредоносных вирусов.

Примечание - Первая и вторая репродукции сертифицированных [проверенных] растений используют для закладки маточников соответствующей категории. Закладка маточника высшей категории качества третьей репродукцией не допускается.

3.1.16 рядовое [непроверенное] растение (рядовой посадочный материал): Вегетативное потомство растений плодовых (ягодных) культур, не подвергавшихся процессам оздоровления и тестирования, сертифицированные растения четвертой и последующих репродукций, а также адаптированные микрорастения.

Примечание - Не используется для закладки маточных насаждений. Используется для закладки многолетних насаждений.

3.1.17 фитосанитарное состояние: Состояние экосистем, их компонентов, продукции или партии продукции растительного происхождения на определенной территории в конкретно указанное время по составу и уровню развития вредных организмов.

3.1.18 адаптированное микрорастение плодовых [ягодных] культур: Микрорастение плодовых [ягодных] культур, высаженное в нестерильные условия и успешно прошедшее адаптацию (ex vitro растение).

3.1.19 микроплата: Пластиковая пластина с лунками, которая служит основой для проведения иммуноферментного анализа.

3.1.20 референтный образец: Растительный материал, свойства которого однородны и позволяют использовать его в качестве положительного контроля.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

ДИЕКА - N, N-диэтилдитиокарбамат натрия;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ДНК-полимераза - фермент, компонент ПЦР-смеси;

ИФА - иммуноферментный анализ;

кДНК - комплементарная ДНК;

НД - нормативная документация на оборудование и методы испытаний;

НИУ - научно-исследовательское учреждение;

ОТ - обратная транскрипция;

ПО - программное обеспечение;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

СИ - средства измерения;

УФ - ультрафиолетовое;

dNTP - нуклеозидтрифосфат, компонент ПЦР-смеси;

in vitro - в данном контексте термин относится к выращиванию живой культуры в культуральном сосуде;

in vivo - в данном контексте термин, относящийся к выращиванию растений в естественных условиях.

4.1.1 При выполнении исследования необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

4.1.2 При использовании в процессе исследования образцов, а именно при работе с взрывоопасными материалами необходимо соблюдать правила техники безопасности по ГОСТ 12.1.010.

4.1.3 Для предотвращения и уменьшения воздействия опасных и вредных производственных факторов при работе в лаборатории персонал должен использовать специальную одежду, соответствующую проводимым исследованиям, а также использовать средства индивидуальной защиты в соответствии с ГОСТ 12.4.011. При работе с вредными и опасными реактивами необходимо строго соблюдать требования техники безопасности.

4.1.4 Средства индивидуальной защиты регламентируются в соответствии с ГОСТ 12.4.103.

4.1.5 Помещение, в котором проводят исследования, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

4.1.6 При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019.

4.1.7 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4.1.8 При работе с УФ-излучением необходимо использовать защитный экран и защитные очки.

4.1.9 Утилизацию зараженного посадочного материала проводят автоклавированием в течение 20 мин при температуре от 121 °C до 125 °C.

4.2.1 Общие требования к лаборатории - по ГОСТ ISO/IEC 17025-2019 (подраздел 4.2, раздел 5, подразделы 6.1 - 6.4, пункт 7.2.1, подразделы 7.3 - 7.5, 7.7, пункты 7.8.1 - 7.8.3, 7.8.8, подразделы 7.10, 7.11).

Помещения лаборатории и условия окружающей среды должны быть пригодны для осуществления лабораторной деятельности и не должны оказывать негативного влияния на достоверность полученных результатов испытаний.

4.2.2 Лаборатория должна разработать, внедрить и поддерживать в рабочем состоянии систему контроля качества, охватывающую помещения, персонал, ресурсы, объекты испытаний и виды деятельности лаборатории. Система контроля качества должна обеспечивать компетентность проводимых испытаний и достоверность полученных результатов.

4.2.3 Все инструкции, стандарты, технические руководства и справочные материалы, нормативные документы, относящиеся к деятельности лаборатории, должны быть актуальными, аттестованными в соответствии с законодательством Российской Федерации и предоставляться персоналу в свободном доступе.

4.2.4 Отклонение от требований к испытаниям допустимо только в том случае, если оно согласовано с заказчиком, технически выполнимо и санкционировано уполномоченным лицом.

4.2.5 Лаборатория должна иметь все необходимое для осуществления деятельности оборудование, СИ, ПО, эталоны, стандартные образцы, справочные материалы, расходные материалы, реактивы, испытательное и вспомогательное оборудование. Лабораторное оборудование должно обеспечивать проведение испытаний в соответствии с НД. В зависимости от типа проводимого тестирования, различные этапы диагностики вредителей растений могут быть объединены в одной рабочей зоне, при условии, что будут приняты необходимые меры для предотвращения перекрестной контаминации образцов и оборудования.

4.3.1 Персонал лаборатории должен иметь базовое образование, или дополнительное обучение по теме выполняемых работ не менее 250 академических часов, быть компетентным, выполнять испытания в соответствии с системой контроля качества, проводить работы в соответствии с требованиями той, или иной зоны лаборатории и быть осведомленным об ограничениях, налагаемых на работу в таких зонах.

4.3.2 Персонал, участвующий в исследованиях, должен владеть методами испытаний, иметь соответствующее образование, а также техническую подготовку для обращения с лабораторным оборудованием.

4.3.3 Разрешение на посещение лаборатории, цеха, участка, конкретного рабочего места инженерно-техническому персоналу, не работающему постоянно в организации, выдает руководитель подразделения. Посещение должно осуществляться в сопровождении сотрудника структурного подразделения после прекращения работы и проведения текущей дезинфекции. Посещение регистрируют в специальном журнале.

Лаборатория должна быть оснащена следующим оборудованием для проведения исследований по оценке фитосанитарного состояния:

- камера холодильная с диапазоном температур от 2 °C до 5 °C по ГОСТ 33662.1;

- бокс микробиологической безопасности по ГОСТ Р ЕН 12469;

- измеритель pH диапазоном измерений от 0 до 14 ед. pH, имеющий минимальную чувствительность 0,1 ед. pH по ГОСТ Р 8.857;

- весы лабораторные по ГОСТ Р 53228;

- микроскоп-бинокуляр должен удовлетворять требованиям ГОСТ Р 56169;

- анализатор фотометрический иммуноферментный;

- дозаторы одноканальные варьируемого объема по ГОСТ 28311;

- центрифуга лабораторная для микроцентрифужных пробирок по ГОСТ IEC 61010-2-020;

- термостат твердотельный с возможностью регулирования температурного диапазона;

- амплификатор нуклеиновых кислот;

- амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени;

- электрофоретические камеры для горизонтального электрофореза;

Допускается использование аналогичного оборудования, с соответствующими техническими характеристиками.

5.1 Фитосанитарное состояние посадочного материала плодовых и ягодных культур должно соответствовать требованиям, установленным в таблице 1.

5.2 Карантинные объекты должны регулироваться соответствующими службами в рамках действующего законодательства. Подразумевается, что весь посадочный материал должен быть свободен от объектов, относящихся к карантинным в соответствии с единым перечнем карантинных объектов Евразийского экономического союза eec.eaeunion.org.

5.3 Карантинные объекты, включенные в единый перечень ЕАЭС (см. [2]), на посадочном материале регулируются согласно [3].

5.4 Оценка фитосанитарного состояния посадочного материала должна проводиться с периодичностью, указанной в таблице 2.

6.1 Отбор образцов от партии товарной продукции (далее - отбор образцов) проводят при фитосанитарном мониторинге маточных насаждений, исходных растений и базисных растений, продаже и иных случаях в целях обеспечения контроля фитосанитарного состояния растений согласно [4].

6.2 При проведении визуального осмотра посадочного материала (см. визуальный метод выявления) в случае обнаружения вредных организмов, или симптоматики поражения вредными организмами, проводится отбор проб, соответствующая маркировка и дальнейшее лабораторное исследование.

6.3 При наличии на растениях вредных организмов или их симптомов, отбирают пробы посадочного материала в зависимости от локализации фитопатогена.

6.4 Отбор точечных образцов от саженцев (включая сеянцы), подвоев плодовых, ягодных (далее - саженцы, подвои и черенки) проводят методом случайного отбора и методом отбора с фиксированной пропорцией, в соответствии с ГОСТ Р 58972 и ГОСТ 12430-2019 (раздел 10).

6.5 От партии саженцев (включая сеянцы), подвоев и черенков проводят отбор точечных образцов саженцев, подвоев и черенков из разных мест партии в соответствии с таблицей 3 (не менее 1% от общего объема, всегда не менее 2 шт. образцов с партии).

6.6 Отобранные от партии саженцев (включая сеянцы), подвоев и черенков точечные образцы объединяют в единый образец, размещают на гладкой чистой поверхности и просматривают поштучно на наличие вредных организмов, симптомов поражения и признаков повреждения или заселения вредными организмами. Лабораторная проба формируется в зависимости от результатов визуальной оценки фитосанитарного состояния партии посадочного материала, в соответствии ГОСТ 12430-2019 (приложение А).

6.7 Образцы, отобранные от исходных и базисных растений, из маточных насаждений подлежат лабораторным исследованиям в полном объеме, без формирования объединенного образца и выделения среднего образца. При отборе проб следует учитывать неравномерное распределение фитопатогенов по растению.

Примечание - При температуре окружающей среды свыше 30 °C в течение 5 сут. необходимо исключить отбор образцов для вирусологических исследований с середины июля до начала сентября.

Для вирусологических исследований посадочного материала в период покоя растений отобранные образцы (побеги) подвергают искусственному пробуждению в лабораторных условиях и используют их вегетативные и цветочные почки, а также камбиальный слой.

6.8.1 Пробы должны храниться в чистом инертном контейнере (упаковке), создающем достаточную защиту от внешних загрязнений и повреждений в процессе транспортирования и хранения, а также от распространения фитопатогенов и вредителей, которые могут присутствовать в пробе.

6.8.2 Материал упаковки, контактирующей с образцом продукции, должен быть воздухо- и светонепроницаемым, водо- и жиростойким, нерастворимым и неабсорбирующим и не должен изменять физическое состояние образца.

6.8.3 Пробы должны быть доставлены в лабораторию максимально быстро, с соблюдением мер против протекания, высушивания, повреждения проб (промерзания, нагрева свыше 35 °C, плесневения, подгнивания).

6.8.4 Время доставки проб не должно превышать 24 ч (до 7 сут при температуре 2 °C - 8 °C) с момента отбора проб, если иное не установлено нормативными документами.

6.8.5 Транспортирование образцов посадочного материала должно осуществляться в условиях, обеспечивающих сохранение состояния, состава и качества проб, а также безопасность окружающей среды, на оборудованном для таких целей автотранспортном средстве по ГОСТ 33829. При транспортировании проб на значительные расстояния допускается использование авиационного или железнодорожного транспорта общего пользования при условиях выделения для сумок (укладок), содержащих контейнеры с образцами посадочного материала, отдельного багажного места.

6.9.1 Условия отбора проб должны быть зарегистрированы в акте отбора проб (приложение Г).

6.9.2 В лаборатории должна быть система уникальной идентификации образцов при получении и направлении на испытания для обеспечения независимости испытаний. Идентификатор образца должен сохраняться до тех пор, пока этот образец хранится в лаборатории и должен быть отражен в протоколе испытаний.

При проведении фитосанитарного мониторинга необходимо подтверждать наличие фитопатогенов в посадочном материале и проводить идентификацию скрининговым и, в случае выявления, подтверждающим - арбитражным методами.

7.1.1 Сущность метода заключается в визуальном осмотре листьев, почек, древесины и корневой системы на наличие симптомов поражения фитопатогенами или наличие самих фитопатогенов.

7.1.2 В зависимости от вида и площади обследуемого участка устанавливают следующие нормы обследования:

- на участках площадью от 3 до 10 га - от 10% до 15%;

- на участках от 10 до 50 га - от 5% до 7%;

- на участках более 50 га - от 3% до 5% растений.

7.1.3 В маточных насаждениях, в местах хранения исходных растений обследуют каждое растение.

7.1.4 При обследовании одновременно осматривают корневую поросль растений и дикорастущие растения, произрастающие вблизи насаждений ягодных и плодовых культур.

7.1.5 В случае обнаружения симптомов поражения фитопатогенными объектами, проводят отбор образцов в соответствии с разделом 6 для последующей идентификации серологическими, микробиологическими и молекулярными методами.

7.1.6 После завершения обследования составляют акт, который подписывает представитель хозяйства и обследователь.

Эту группу методов применяют для выявления и последующей идентификации грибов, находящихся на поверхности и/или во внутренних тканях растений в виде мицелия или неактивного спороношения согласно [5].

7.2.1 Сущность метода заключается в том, что при создании благоприятных условий (повышенной влажности) происходит стимулирование роста мицелия или спороношения грибов.

7.2.2.1 Для анализа отбирают растения плодовых и ягодных культур с признаками угнетения или увядания, а также загнивающие зеленые черенки сортов крыжовника, подвоев яблони и груши, подвоев и сортов вишни и сливы [в двух - трех повторностях (не менее) на одно растение].

7.2.2.2 Пораженный фрагмент растения предварительно отмывают в водопроводной воде, затем проводят поверхностную стерилизацию в 70%-ном этиловом спирте и после ополаскивания в стерильной воде помещают во влажные камеры согласно [6] или на селективные среды, или их модификации. Выбор концентрации дезинфектанта и времени экспозиции зависит от целей исследования и характера исследуемого материала. Стерилизуют объект, используя 3%-ную перекись водорода или 2%-ный раствор марганцевокислого калия или 70%-ный этиловый спирт. Объект выдерживают в растворе в течение 1 - 5 мин и многократно промывают стерильной водой. Подготовленные образцы пинцетом помещают в простерилизованные чашки Петри на влажные диски из фильтровальной бумаги.

7.2.2.3 Чашки Петри инкубируют 7 сут в термостате при температуре от 22 °C до 25 °C. При проявлении патогенов (мицелий, спороношение) проводят микроскопирование и отсев на соответствующие питательные среды для выделения в чистую культуру.

7.2.2.4 Для получения чистых культур грибов в целях дальнейшего изучения применяют различные питательные среды. Выбор того или иного типа питательного субстрата зависит от потребностей грибного организма и целей проводимого эксперимента.

Для идентификации фитопатогена проводят дальнейшее микроскопирование с интерпретацией результатов в соответствии со справочниками-определителями согласно [7] - [9] и другие действующие определители.

Примечание - Для обнаружения и идентификации возбудителей грибной этиологии используют методы визуального осмотра, влажной камеры, выделения возбудителя на питательную среду, микроскопирования и морфометрии, плавающих приманок согласно [10] и приложению В (в случае с фитофторозными корневыми гнилями), а определение до вида - методом полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (при необходимости для установления карантинного или труднодиагностируемого объекта). Определение фитопаразитических нематод проводят в соответствии с приложениями А, Б и согласно [11].

7.3.1 Сущность теста методом индикаторных растений заключается в приготовлении смеси исследуемого образца растения с экстрагирующим буферным раствором, инокуляции полученной смесью травянистых или древесных индикаторных растений с целью последующего обнаружения специфических симптомов заражения вирозами согласно [12].

7.3.2 Для проведения теста методом индикаторных растений их выращивают в зимних теплицах в сосудах с простерилизованной почвой. Перед инокуляцией и сразу после нее растения в течение суток целесообразно содержать в темноте.

7.3.3 Для тестирования одного образца необходимо использовать пять растений-индикаторов, дополнительно одно контрольное растение обрабатывают дистиллированной водой (всегда не менее 2 шт. образцов с партии).

7.3.4 Посадочный материал гомогенизируют в соотношении 1:5 - 1:6 с экстрагирующим буфером в ступке. Сок отжимают через три-четыре слоя стерильной марли и втирают с помощью стеклянного шпателя, марли или руки в предварительно опыленные карборундом листья индикаторов. После инокуляции остатки сока смывают с листьев дистиллированной водой. Экстрагирующий буфер и ступки перед использованием необходимо охладить до 2 °C - 4 °C.

7.3.5 Для проведения теста рекомендуется использовать следующие экстрагирующие буферы:

7.3.5.1 Ягодные кустарники и земляника (тест-органы - молодые листья и цветки):

- 2%-ный водный раствор никотин-основания;

- 2%-ный раствор поливинилпирролидона (ПВП) в 0,02 - 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,4 - 7,6.

7.3.5.2 Семечковые культуры (тест-органы - цветки или камбий):

- 0,01 М трис/HCl буфер, pH 7,5 (или 0,1 М боратный буфер, pH 9,0) + MgSO₄ (0,005 М) + Na₂SO₃ (0,1%) + аскорбиновая кислота (0,1%) + никотин-основание (1,0%).

7.3.5.3 Косточковые и семечковые культуры (тест-органы - молодые листья):

- 0,03 М фосфатный буфер, pH 8,5 + ДИЕКА (0,015 М) + дифенилдитиомочевина (0,015 М) + кофеин (0,03 М);

- 0,02 М калийфосфатный буфер, pH 8,0 + ДИЕКА (0,014 М) + никотин-основание (2,5%) + полиэтиленгликоль (2%) + меркаптоэтанол (0,02 М) + кофеин (0,4).

7.3.6 Оптимальная температура воздуха для проведения теста 18 °C - 22 °C, продолжительность теста 25 - 30 дней.

7.3.7 Рекомендуемые индикаторные растения приведены в таблице 4.

7.4.1 Сущность методов ИФА заключается в выявлении в образце иммунного комплекса "антиген - антитело" к выявляемому возбудителю вироза путем присоединения к одному из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией в сравнении с положительными и отрицательными контролями.

7.4.2 Для проведения теста рекомендуется использовать следующие буферные растворы:

7.4.2.1 Покрывающий буфер

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ с 800 см³ дистиллированной воды растворяют 1,59 г карбоната натрия и 2,93 г гидрокарбоната натрия. Доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Проверяют pH буферного раствора, который должен быть (9,6 +/- 0,1) ед. pH.

Срок хранения покрывающего буфера в сосуде в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 10 сут.

7.4.2.2 Промывающий (промывочный) буфер

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ с 800 см³ дистиллированной воды растворяют 8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия, 2,9 г гидрофосфат додекагидрата натрия и 0,2 г дигидроортофосфата калия. Доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Проверяют pH буферного раствора, который должен быть (7,3 +/- 0,1) ед. pH. Далее переливают 800 см³ полученного раствора в пустую колбу и добавляют 0,5 см³ Твин-20. Доводят дистиллированной водой до метки 1000 см³ и перемешивают.

Срок хранения промывочного буферного раствора в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 5 сут.

7.4.2.3 Экстрагирующий буфер

В мерную колбу вместимостью 500 см³ наливают 400 см³ промывочного буферного раствора по 7.4.2.2, добавляют 10 г поливинилпирролидона и 1 г яичного или бычьего сывороточного альбумина.

Доводят дистиллированной водой до метки 500 см³ и перемешивают.

7.4.2.4 Конъюгатный буфер

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ с 800 см³ дистиллированной воды растворяют 8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия, 2,9 г гидрофосфат додекагидрата натрия и 0,2 г дигидроортофосфата калия. Доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Проверяют pH буферного раствора, который должен быть (7,3 +/- 0,1) ед. pH. В мерной колбе с 100 см³ приготовленного буферного раствора растворяют 0,5 г 0,5%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина.

Срок хранения буферного раствора для конъюгата в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 3 сут.

7.4.2.5 Приготовление субстратного буферного раствора с pH 9,8

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ с 800 см³ дистиллированной воды растворяют 97 см³ диэтаноламина. Доводят концентрированной соляной кислотой pH до (9,8 +/- 0,1) ед. pH, затем доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения субстратного буферного раствора в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 4 °C - не более 10 сут.

7.4.3 Допускается использование готовых буферных растворов в соответствии с инструкциями изготовителей.

7.4.4 Серологические методы исследования фитопатогенных вирусов представлены наиболее часто используемым для диагностики вирусов сэндвич-вариантом ИФА с поликлональными и моноклональными антителами и конъюгатами антител с щелочной фосфатазой в модификациях.

В лунки полистиролового планшета с плоским дном (микроплаты) согласно [13] вносят по 200 мкл специфичных (поликлональных или моноклональных) иммуноглобулинов, разведенных покрывающим буфером, приготовленным по 7.4.2.1. Микроплаты инкубируют в течение 16 - 18 ч при 4 °C - 6 °C. Затем осуществляют трехкратную промывку лунок: содержимое лунок выливают, микроплаты тщательно стряхивают, заполняют лунки промывающим буфером по 7.4.2.2 в объеме 200 мкл и стряхивают внесенный буферный раствор. После последней промывки микроплаты тщательно стряхивают и подсушивают на фильтровальной бумаге.

Примечание - При промывке полистиролового планшета допускается использование автоматизированных промывающих устройств (вошеров) при возможности соблюдения вышеуказанных требований.

7.4.6 Образец растения (всегда не менее 2 шт. образцов растений с партии), отобранный по разделу 6, массой 0,25 г гомогенизируют совместно с 5 мл экстрагирующего буферного раствора по 7.4.2.3. Измельчение можно проводить с помощью фарфорового пестика и ступки, или в пластиковых пакетах с использованием роликов, а также с использованием различных автоматизированных гомогенизаторов до получения однородной суспензии. Затем полученную смесь осветляют центрифугированием в течение 5 мин при скорости 2000 об/мин с охлаждением до температуры 5 °C. Отцентрифугированные образцы вносят в лунки по 200 мкл и инкубируют при 4 °C в течение 16 ч. Используют по две лунки для каждого образца и для положительного контроля и не менее двух лунок для отрицательного контроля.

Примечание - Необходимо, чтобы тесты проводились с использованием свежих растительных экстрактов, приготовленных по 7.4.6. В зависимости от типа вируса (например, стабильности частиц) можно использовать сублимированный или замороженный посадочный материал или экстракты.

7.4.7 После инкубации осуществляют трехкратную промывку лунок: содержимое лунок выливают, микроплаты тщательно стряхивают, заполняют лунки промывающим буфером в объеме 200 мкл и стряхивают внесенный буферный раствор. После последней промывки микроплаты тщательно стряхивают и подсушивают на фильтровальной бумаге.

В лунки микроплат вносят по 200 мкл конъюгата (поликлональных антител или моноклональных антител 5B-IVIA, конъюгированных с щелочной фосфатазой или биотином), разведенного с коньюгатным буфером по 7.4.2.4. Микроплаты инкубируют в течение 2 ч при 37 °C, затем осуществляют стандартную процедуру их промывки (трехкратно).

В каждую лунку вносят по 200 мкл субстратного буфера по 7.4.2.5 с добавлением 4-нитрофенил-фосфата (количество мг на мл). Планшет закрывают и инкубируют при температуре от 18 °C до 25 °C, затем считывают показания на иммуноферментном фотометрическом анализаторе при длине волны 405 нм через 30, 60, 90 и 120 мин.

Результат исследования считают отрицательным, если значение абсорбции образца не более двукратного значения абсорбции в отрицательном контроле.

7.4.11 При тестировании методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем следует пользоваться рекомендациями производителя, указанными в спецификации.

7.4.12 В тест-системе должны быть представлены следующие компоненты:

- вирусоспецифические иммуноглобулины (поликлональные или моноклональные) и конъюгирующие антитела;

- контрольные образцы (с положительным и отрицательным подтвержденным статусом);

- буферные растворы или спецификация по их приготовлению в лабораторных условиях;

- спецификация к тест-системе.

7.5.1 Молекулярные методы исследования и идентификации представлены классической ПЦР и классической ПЦР с ОТ, ПЦР в формате FLASH и ПЦР с ОТ в формате FLASH, ПЦР в режиме реального времени и ПЦР с ОТ в режиме реального времени, а также секвенированием продуктов ПЦР.

7.5.2 Молекулярные методы применяют в качестве отборочных при тестировании посадочного материала на выявление возбудителей бактериальных, фитоплазменных, некоторых вирусных, вироидных и грибных заболеваний, а также для их идентификации.

Для проведения исследования рекомендуется использовать готовые диагностические наборы для детекции фитопатогена, или наборы реагентов (мастер-миксы). Приготовление реакционных смесей осуществляют в соответствии с инструкциями изготовителей, инструкциями к наборам и имеющимися литературными данными.

Зону по подготовке проб и выделению нуклеиновых кислот размещают в боксированном помещении. Работу проводят в боксе биологической безопасности класса II или III.

В рабочей зоне располагают оборудование и предметы, необходимые только для предварительной обработки, выделения нуклеиновых кислот.

Все помещения должны быть оборудованы бактерицидными лампами, или системой обеззараживания воздуха.

Каждая рабочая зона должна иметь свой набор мебели, лабораторного оборудования, реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, защитной одежды, обуви, резиновых перчаток, уборочного инвентаря и пр., используемых только в данной комнате (рабочей зоне).

7.5.4.1 При проведении ПЦР из исследуемого образца растения или фитопатогена (всегда не менее 2 шт. образцов растений от одной партии), отобранного по разделу 6, выделяют РНК с последующей амплификацией кДНК или ДНК с использованием наборов реагентов для выделения нуклеиновых кислот в соответствии с инструкциями изготовителей.

7.5.4.2 В случае невозможности идентификации патогена (до вида или штамма) следует провести секвенирование.

7.5.5 Проведение ПЦР (см. [5])

7.5.5.1 ПЦР осуществляют в микропробирках, содержащих 5 - 50 мкл реакционной смеси.

Основные компоненты стандартной смеси:

- ДНК-полимераза (в большинстве случаев Taq-полимераза);

- буферный раствор, подходящий для используемой ДНК-полимеразы (обычно содержит Трис-HCl (pH 8,8), MgCl₂/MgSO₄, KCl);

- праймеры, рекомендованные для исследуемого патогена;

- смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ; dNTP) - 200 мкМ;

- 1 - 10 нг анализируемой ДНК (кДНК);

- деионизированная вода (наивысшая степень очистки).

Примечание - При необходимости, в соответствии с протоколом конкретной ПЦР, в состав реакционной смеси могут быть включены дополнительные компоненты.

7.5.5.2 В целях подтверждения корректности проведенной реакции (ПЦР), обязательно использование контрольных образцов: положительный и отрицательный контроли.

Примечание - Положительный контрольный образец представляет собой олигонуклеотидную последовательность, строго соответствующую искомой, полученную из референтного образца или искусственно синтезированную. Отрицательный контрольный образец включает в себя все компоненты реакции, в котором анализируемый образец ДНК заменяют на соответствующее количество деионизированной воды.

7.5.5.3 Помимо положительного и отрицательного контролей рекомендуется использовать внутренний контроль - искусственно сконструированную последовательность ДНК, которая имеет принципиально отличную от искомой последовательности нуклеотидов. Для амплификации внутреннего контроля в состав реакционной смеси вводят соответствующую дополнительную пару праймеров.

7.5.5.4 ПЦР осуществляют с использование специального оборудования - термоциклера (амплификатора ДНК). Режим амплификации задают в соответствии с протоколом постановки ПЦР, рекомендованным для каждой конкретной культуры, с учетом температуры плавления праймеров, длины целевого амплифицируемого фрагмента (ампликона) и используемого оборудования.

7.5.6 Праймеры для идентификации фитопатогенов методом ПЦР-РВ представлены в таблице 5.

8.1 Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

- наименование образца;

- количество образцов;

- наименование организации;

- латинское наименование выявленного вредного организма;

- дату выявления и идентификации вредного организма;

- код или номер образца (для возможности отслеживания);

- природу зараженного материала, в том числе, по возможности, латинское наименование растения-хозяина;

- описание признаков или симптомов (включая фотографии в соответствующих случаях, или указание об их отсутствии);

- методы выявления и идентификации вредного организма, а также результаты, полученные с помощью каждого метода;

- документирование результатов исследований;

- наименование лаборатории и фамилию лиц, ответственных за исследование;

- комментарии о степени точности идентификации.

8.2 В протоколе результатов испытаний результат диагностики должен быть представлен точно, ясно, однозначно, достоверно и объективно. Заключение должно обеспечивать возможность принятия решений по выдаче рекомендаций по дальнейшему обращению посадочного материала.

8.3 Образец протокола испытаний приведен в приложении Л.

9.1.1 Выделение растений по помологическим, фитосанитарным качествам и продуктивности.

9.1.2 Тестирование на наличие вирусной, фитоплазменной инфекции, грибных, бактериальных заболеваний.

9.1.3 Оздоровление с применением культуры in vitro в случае обнаружения вирусной, фитоплазменной инфекции.

9.1.4 Содержание потомства в условиях, исключающих перезаражение растений с пыльцой, а также воздушными или почвообитающими векторами вирусов.

9.1.5 Проверка на генетическую стабильность, наличие мутаций.

9.1.6 Отбор продуктивного клона с наиболее выраженными помологическими признаками и оценка фитосанитарного состояния согласно приложению Д.

9.1.7 Отбор растений-кандидатов в исходные растения.

Отбор кандидатов в исходные растения (in vivo) проводится с целью выделения высокоурожайных с типичными сортовыми признаками растений, свободных от возбудителей вирозов, микозов, бактериозов, а также свободных от вредителей, указанных в таблице 1 в соответствии с культурой.

9.1.8 Периодичность оценки фитосанитарного состояния кандидатов в исходные растения проводят в соответствии с таблицей 2.

9.1.9 Данные результатов оценки фитосанитарного состояния и сведения о выделенных растениях заносят в аттестат на кандидата в исходное растение (см. приложения Д и Е).

9.1.10 После выделения кандидатов в исходные растения переносят в карантин, обеспечивающий их защиту от заражения через корни, пыльцу, воздушными и почвообитающими переносчиками. Карантином могут служить пространственно изолированный от других плодовых культур участок (расстояние не менее 1 км), непроницаемый для тлей вегетационный домик, изолированный бокс зимней обогреваемой теплицы.

9.1.11 Почва (и растения земляники) в обязательном порядке проверяются на наличие нематод-переносчиков вирусов (см. приложения А и Б).

9.2.1 При переходе растения из категории "кандидат в исходное растение" в категорию "исходное растение" присваивается индивидуальный шифр, который отражается при оформлении аттестата на исходное растение (см. приложение Ж).

9.2.2 Исходные растения необходимо содержать в условиях, обеспечивающих их защиту от заражения путем соприкосновения корней, через пыльцу, воздушными и почвообитающими переносчиками.

9.2.3 Исходные растения должны содержаться в специально оборудованных непроницаемых для переносчиков вирусных фитопатогенов вегетационных домиках или изолированных боксах в зимних теплицах.

9.2.4 При наличии необходимых условий резервный банк исходных растений рекомендуется содержать параллельно в культуре in vitro с максимальным числом пассажей культивирования, равным 12.

9.2.5 Хранят только ограниченное число (два-три) растений каждого вида, сорта или типа подвоя.

9.2.5.1 При необходимости исходное растение размножают, чтобы обеспечить достаточное количество экземпляров для хранения.

9.2.5.2 В начале хранят все выделенные из кандидатов исходные растения данного сорта, но после помологической оценки и отбора наиболее ценных клонов количество их может быть уменьшено.

9.2.6 Исходные растения проверяют на наличие фитопатогенов в соответствии с периодичностью, приведенной в таблице 2.

9.3.1 Базисные растения получают путем вегетативного размножения исходных растений:

- прививкой на безвирусные семенные подвои;

- прививкой на оздоровленные клоновые подвои;

- укоренением черенков;

- микроклональным размножением.

9.3.2 При размножении in vitro необходима проверка на генетическую стабильность и отсутствие химер.

Примечание - С этой целью растения высаживают на изолированные участки для проверки их продуктивности и помологических качеств.

9.3.3 Адаптированные микрорастения плодовых и ягодных культур по фитосанитарному состоянию подразделяют на три группы:

- полученные путем микроразмножения исходного материала, свободного от основных вредоносных вирусов по результатам тестирования двумя и более методами;

- полученные путем микроразмножения исходного материала, свободного от основных вредоносных вирусов по результатам иммуноферментного анализа или ПЦР;

- полученные путем микроразмножения исходного материала, взятого с ценных гибридных форм, выделенных по результатам селекционной оценки, и остродефицитных отечественных и интродуцированных сортов и культур, визуально свободных от симптомов вирусных болезней.

9.3.4 Маточники базисных растений закладывают в научно-исследовательских учреждениях (НИУ), их опытных хозяйствах и в базовых питомниках, находящихся под методическим руководством научных центров.

9.3.5 Маточники размещают на участках, проверенных на отсутствие нематод-переносчиков вирусов и пространственно изолированных от прочих насаждений семечковых и косточковых культур (на расстоянии не менее 2 км от плодоносящих промышленных насаждений).

Примечание - Допускается также содержание маточников в пленочных или сетчатых теплицах-изоляторах.

9.3.6 Количество растений каждого сорта в маточнике определяется потребностью в черенках.

9.3.7 Цветение растений в маточнике не допускается и предотвращается ежегодной сильной обрезкой. Сортовую апробацию проводят на второй-третий год после посадки и затем ежегодно, удаляя растения с отклонениями от сорта и случайные сортовые примеси.

9.3.8 Растения в маточниках должны также быть свободны от заражения другими вредителями и болезнями, что достигается регулярными осмотрами и обработкой пестицидами в соответствии со схемой защитных мероприятий.

9.3.9 Базисные растения проверяют на наличие фитопатогенов в соответствии с периодичностью, приведенной в таблице 2.

9.3.10 Базисные растения должны иметь соответствующую документацию (см. приложение И).

9.4.1 Потомство базисных растений тиражируется в питомниках, производящих сертифицированный (проверенный) посадочный материал.

9.4.2 Питомники, производящие сертифицированный (проверенный) посадочный материал, должны прививать оздоровленные привои исключительно на семенные или оздоровленные клоновые подвои.

9.4.3 Посадочный материал следует размещать на обособленных участках с предварительной проверкой почвы на наличие нематод-переносчиков вирусов (см. приложение А).

9.4.4 Оценка фитосанитарного состояния и качественных показателей на соответствие требованиям нормативно-технической документации проводится с периодичностью, приведенной в таблице 2.

9.4.5 Питомники и частные хозяйства, производящие рядовой посадочный материал, выявившие в результате собственной оценки фитосанитарного состояния производства садовые растения, свободные от фитопатогенов и вредителей, должны перевести данные растения в категорию "сертифицированный (проверенный) посадочный материал", обеспечив при этом изолированное местонахождение данного посадочного материала и зафиксировав результаты обследования в аттестате на сертифицированное (проверенное) растение (см. приложение К).

9.5.1 Должны быть разработаны и документированы процедуры, обеспечивающие идентификацию и прослеживаемость этапов производства посадочного материала.

Процедуры прослеживаемости должны обеспечивать возможность:

- определения категории и статуса посадочного материала;

- учета посадочного материала для оперативного управления и контроля производства;

- изоляции и учета дефектного посадочного материала;

- проведения анализа причин дефектов и проведения корректирующих мероприятий.

9.5.2 Процедуры должны быть внедрены в производственный процесс и увязаны с системой контроля качества посадочного материала.

9.5.3 Идентификация этапов производства сопровождается разработанным в учреждении комплектом документов (акт апробации, акт фитосанитарного обследования, протокол о результатах вирусологического тестирования, акт о проведении оздоровления, генетический паспорт, или акт о молекулярно-генетической идентификации сорта, аттестат на исходное растение).

Тиражирование (издание) аттестатов (см. приложения Д - К) должно осуществляться в соответствии с требованиями ГОСТ Р 54109.

На участках, отводимых под посадку базисных размножаемых и сертифицированных растений, необходимо отбирать образцы почвы для проверки на наличие следующих нематод-переносчиков вирусов: Xiphinema diversicaudatum (векторы ArMV и SLRSV), L. elongatus (векторы RpRSV, TBRV) и L. attenuatus (вектор TBRV).

Образцы следует отбирать с глубины 10 - 30 см лопатой или полуцилиндрическими пробниками с минимальным диаметром 25 мм. Винтовые пробники или буры меньшего диаметра использовать не рекомендуется из-за риска повреждения нематод при отборе проб.

Образцы отбирают по схеме решетки согласно принятым ранее стандартам: 20 субобразцов с участка до 0,2 га и 40 субобразцов с участков от 0,2 до 4 га. Другой возможной схемой отбора образцов (более трудоемкой, но значительно более тщательной) являются разделение участка на субучастки по 0,2 га и отбор по 60 субобразцов на каждом из этих субучастков. Дополнительные образцы следует отбирать из любых живых изгородей, окружающих участок.

Субобразцы объединяют и тщательно перемешивают, после чего отбирают усредненную пробу массой 1 - 2 кг. Пробу помещают в пакет из полиэтиленовой пленки и снабжают этикеткой. Пробы желательно поместить в темное прохладное место и как можно скорее доставить на анализ.

Выделение нематод из образцов почвы осуществляют методом Флегта, который почти не требует применения специального оборудования.

Образец почвы осторожно, но тщательно перемешивают, отбирают из него два субобразца объемом 250 мл каждый, которые помещают в стеклянные цилиндры или банки и смешивают с водой, доводя общий объем суспензии до 500 мл. Почву замачивают в воде в течение 1 - 3 ч, промывают сквозь сито с ячейками размером 4 мм в 10-литровое ведро, которое заполняют водой почти до верхнего уровня. Тщательно и осторожно перемешивают содержимое ведра, чтобы перевести почву в суспензию, оставляют на 25 с и затем промывают через батарею из трех сит с ячейками размером 150 мкм. Вновь заполняют ведро водой, повторно перемешивают, отстаивают в течение 15 с и промывают через эту же батарею сит.

Собранный на ситах осадок сливают на сито с ячейками 110 мкм. Сито помещают в стеклянную воронку, на раструб которой надет кусочек резинового шланга с пружинным зажимом Мора. Воронку заполняют водой так, чтобы она чуть покрывала осадок на поверхности сита. Через 24 ч, открыв зажим, из воронки сливают 20 - 25 мл жидкости в пробирку или другой стеклянный сосуд. Каждый образец снабжают этикеткой, которую сначала вкладывают в воронку, а затем переносят в пробирку. Подсчет и идентификацию нематод проводят в специализированных лабораториях.

При необходимости полученный образец консервируется формалином.

Для этого пробирки с нематодами помещают на 2 - 4 мин на водяную баню при 50 °C - 55 °C и заливают формалином из расчета одна часть 40%-ного формальдегида на 10 - 20 частей суспензии нематод.

Анализы проводят по ранее апробированной в России методике. Зеленые части растений земляники (почки, усы, цветоносы, листья) измельчают скальпелем или ножницами на кусочки длиной 10 - 15 мм. После перемешивания отбирают навески массой 5 - 10 г и рассыпают их тонким слоем на плоские металлические или пластиковые сита 10 - 12 см с ячейками размером 0,5 - 2 мм. Сито со всем содержимым помещают в стеклянную или полиэтиленовую воронку диаметром 12 - 15 см, на раструб которой надет кусочек резинового шланга длиной 10 - 15 см с пружинным зажимом Морана. Воронку заливают водой так, чтобы она покрывала растительную массу на сите. Через 48 ч, открыв зажим, из воронки сливают 15 - 20 мл жидкости в пробирку или другой стеклянный сосуд. Подсчет и идентификацию нематод проводят в специализированных лабораториях.

При необходимости полученный образец консервируют формалином. Для этого пробирки с нематодами помещают на 2 - 4 мин в водяную баню при 50 °C - 55 °C и заливают формалином из расчета одна часть 40%-ного формальдегида на 10 - 20 частей суспензии нематод.

Выявление P. cactorum проводят по следующей методике. С каждого тестируемого растения отбирают по три центральных листочка, которые помещают в чашки Петри и покрывают водой или стерильной почвой. Листья инкубируют на свету при комнатной температуре (20 °C - 25 °C) и ежедневно в течение трех дней анализируют на наличие спорангиев гриба. Для выявления P. fragariae var. rubi, P. cactorum из почвы рекомендуется использовать разработанные в ФГБНУ ФНЦ Садоводства методы биоприманок согласно [10].

Диагностику почвы на наличие P. fragariae var. rubi осуществляют по следующей методике. Образец тестируемой почвы массой 20 - 30 г помещают в чашку Петри 9 см, выравнивают на дне чашки и заливают водой таким образом, чтобы вода покрывала анализируемую почву слоем 10 мм. С поверхности воды удаляют органическую фракцию почвы и помещают молодые листья малины, малино-ежевичных гибридов или ежевики так, чтобы они касались воды верхней стороной, а не тонули. После пяти дней инкубации на рассеянном свету при 17 °C - 19 °C листья приманки просматривают на наличие некрозов. После того, как некротизированными оказывается 25% - 30% площади листьев, их просматривают под микроскопом на наличие ооспор P. fragariae var. rubi.

Для диагностики почвы на наличие P. cactorum в качестве приманки используют лепестки цветков различных растений: земляники лесной и садовой, вишни, сливы, яблони, груши, малины, калины, спиреи японской. В чашку Петри помещают образец тестируемой почвы массой 20 - 30 г и равномерно распределяют ее по дну. Затем наливают воду таким образом, чтобы она покрывала почву слоем 2 - 3 мм. На поверхность воды помещают лепестки приманки и инкубируют в течение трех дней на свету при комнатной температуре. После развития на лепестках некрозов их анализируют под микроскопом на наличие зооспорангиев гриба.