7.18 pH-метр точностью со стеклянными электродами для биохимических исследований или равноценный.
7.19 Колба Эрленмейера объемом 100 см3.
7.23 Лопастная мешалка [по типу гомогенизатора Stomacher], обеспечивающая скорость от 6 до 8 ударов/с с подходящими контейнерами однократного применения.
7.24 Камера влажности, камера искусственного тропического климата или другая емкость, обеспечивающая поддержание условий высокой влажности.
7.25 Холодильник, обеспечивающий поддержание температуры на уровне от 2 °C до 8 °C при допуске +/- 2 °C.
7.26 Морозильные камеры, с настройкой на температуры ниже 70 °C, и ниже 20 °C при допуске +/- 2 °C.
7.27 Весы, обеспечивающие удобство считывания показания до 0,01 г.
7.28 Пластиковые мешки однократного применения для пищевых продуктов, которые используют для выемки пробы.
7.29 Бокс для микробиологических тестов (MSC Тип II) или другая система с аналогичными характеристиками.
7.30 Водяные бани, одна - для поддержания постоянной температуры (46 +/- 2) °C, другая - для поддержания температуры от 70 °C до 90 °C.
Реактивы, используемые в испытаниях, должны быть аналитической чистоты и/или марки, соответствующей применению в микробиологических анализах.
Обезвоженные продукты, имеющиеся в продаже, рекомендуется использовать при приготовлении питательных сред строго в соответствии с инструкциями изготовителя.
Вода аналитической чистоты для микробиологических сред и приготовления реактивов, которая получена непосредственно после дистилляции и/или ионообменника, или ультрафильтра и/или профильтрована с помощью обратного осмоса (OO = RO). Она не должна содержать токсичных или подавляющих рост грибков веществ.
Диоктилсульфосукцинат натрия для приготовления суспензии спор. Концентрация анионного поверхностно-активного вещества в чистой воде (8.1) составляет 50 мг/дм3. Стерилизуют этот раствор в автоклаве (7.3) при температуре 121 °C в течение 20 мин.
8.3 Питательная среда
Используют питательную среду, приготовленную, как описано ниже. Можно использовать готовые имеющиеся в продаже среды после соответствующего подтверждения правильности выбора.
Для питательных сред, которые не будут использованы сразу же после приготовления, рекомендуется хранение при температуре от 5 °C до 10 °C сроком хранения не более 1 месяца.
Эта среда способствует спорообразованию грибков.
Примечание - Данная среда будет использована для метода переноса.
8.3.4.1 Наливают приблизительно 10 см3 предварительно нагретого и полностью растворенного агара PDA (см. 8.3.2) в стерилизованную пробирку.
8.3.4.2 Затыкают пробирку пробкой из хлопковой ваты и стерилизуют паром.
8.3.4.3 После стерилизации помещают пробирку под углом приблизительно 15° относительно горизонтального уровня на чистом лабораторном столе и оставляют до застывания содержимого.
8.3.4.4 Если на застывшем агаре не выступает вода, то для использования растворяют и отверждают среду заново.
Если невозможно достичь достаточной нейтрализующей силы, можно отрегулировать содержимое полисорбата 80 или лецитина, или добавить другое нейтрализующее вещество. Имеющиеся в продаже растворы нейтрализаторов можно использовать после тестирования их эффективности (см. приложение B). Применение неустановленного нейтрализатора необходимо указать в протоколе с наименованием и концентрацией.
9.1 Контрольные грибки и споры пересевают и работают с ними в стерильном боксе (7.29) или равноценном помещении.
9.2 Стерилизуют ватные пробки, горловины пробирок в пламени или химическим способом до и после пересева.
9.3 Соскребают небольшое количество грибков с первичных грибков, распределяют споры по выступившей воде в нижней части скошенного агара (8.3.4) и смазывают до верхнего конца скошенной поверхности прямым мазком или зигзагом (см. рисунок 1).
![]() 1 - выступившая вода; 2 - скошенный агар
Рисунок 1 - Пересев на скошенный агар
9.4 Каждый раз при пересеве грибков другого типа пользуются заново стерилизованными в пламени платиновой (бактериологической) петлей (7.4) и крюком (7.5).
9.5 Помещают засеянный скошенный агар в инкубатор (7.6) при температуре (25 +/- 2) °C как минимум на восемь дней и, прежде чем консервировать их при температуре от 5 °C до 10 °C, подтверждают, что образовалось достаточное количество спор.
9.6 В течение трех месяцев пересаживают пересеянные грибки на новый скошенный агар для последующей инкубации и консервации.
9.7 Повторяют пересев с интервалом до трех месяцев. Пересеваемую культуру, однако, не следует пересевать более пяти раз. Нельзя использовать грибки старше трех месяцев для дальнейшего субкультивирования.
Примечание - Длительная консервация возможна методом лиофилизации при температуре минус 80 °C.
10.1 Общие положения
См. рисунок 2.
![]() 1 - предварительный посев на чашку с PDA; 2 - этап 1;
3 - этап 2; 4 - этап 3; 5 - этап 4; 6 - этап 5
Рисунок 2 - Этапы процедуры для приготовления суспензии спор
10.2.1 Пользуются короткой пипеткой Пастера (см. 7.10) или аналогичным приспособлением для забора 0,5 см3 стерилизованной воды, содержащей анионное поверхностно-активное вещество (см. 8.2) (этап 1).
10.2.2 Медленно выпускают ее примерно в пять приемов на споры в центре чашки с агаром, чтобы осторожно смыть поверхность (этап 2).
Примечание - Допускаются небольшие изменения, например, увеличение количества воды для смыва. Все условия в таких случаях записывают.
10.3 Сбор и диспергирование суспензии спор из питательной среды
10.3.1 Суспензию спор (10.2) берут с помощью пипетки Пастера (7.10) или аналогичного приспособления.
10.3.2 Переносят ее приблизительно в 5 см3 стерилизованной воды, содержащей анионное поверхностно-активное вещество (8.2).
10.3.3 Пипеткой "забирают-выпускают" 100 раз или перемешивают суспензию на специальном устройстве для встряхивания (7.22) три раза в течение 20 с или применяют легкую ультразвуковую очистку в течение 5 мин для того, чтобы споры диспергировали в достаточной степени.
10.3.4 Визуально проверяют, чтобы суспензия выглядела слегка мутной (этап 3).
10.4 Фильтрование для удаления гиф и нитей
Для фильтрования пользуются воронкой (7.8) или другим приспособлением с марлей (7.1) или стекловатой (этап 4).
Примечание - Марля (7.1) или стекловата могут состоять из сложенных в стопку от 3 до 5 слоев в форме квадрата стороной 5 x 5 см.
10.5 Использование разделения на центрифуге и повторное суспендирование для удаления надосадочной жидкости
10.5.1 После фильтрования выполняют разделение на центрифуге приблизительно при ускорении 2000g в течение не менее 5 мин при температуре (25 +/- 2) °C или при комнатной температуре, если центрифуга (см. 7.13) не имеет устройства для контроля температуры.
10.5.2 Удаляют надосадочную жидкость.
10.5.3 Добавляют 5 см3 анионного поверхностно-активного вещества (8.2) в 10.5.2.
10.5.4 Осторожно перемешивают с помощью пипетки, чтобы диспергировать споры, или с помощью устройства для встряхивания (7.22), или, применяя легкую ультразвуковую очистку в течение примерно 5 мин, чтобы споры были диспергированы в достаточной степени (этап 5).
10.6 Подтверждение концентрации суспензии спор
Проверяют следующие позиции на гемоцитометре.
10.6.1 Подсчет спор и статус спор: подтверждают, что количество спор составляет от 1·106/см3 до 3·106/см3 и что более 90% спор являются отдельными спорами без гиф.
10.6.2 В случае слишком большого количества спор разводят суспензию стерилизованной водой, содержащей анионное поверхностно-активное вещество (8.2), чтобы снизить число спор от 1·106/см3 до 3·106/см3, снова проверяют количество спор.
10.6.3 В случае недостаточного количества спор повторяют центрифугирование, чтобы удалить надосадочную жидкость, и используют стерилизованную воду, содержащую анионное поверхностно-активное вещество (8.2) для регулирования числа спор на уровне от 1·106/см3 до 3·106/см3, и снова подсчитывают споры.
10.7.1 Для метода поглощения используют 1/20 SDB в поверхностно-активном веществе (8.2) для регулирования суспензии спор на уровне от 1·105/см3 до 3·105/см3 для анализа.
Примечание - Чтобы получить 1/20 SDB в анионном поверхностно-активном веществе добавляют 5 см3 SDB (8.3.1) в 95 см3 анионного поверхностно-активного вещества (8.2).
10.7.2 Для метода переноса готовят посевной материал только в анионном поверхностно-активном веществе (8.2) (SDB 1/20 не требуется).
10.7.3 После разбавления хорошо перемешивают суспензию.
10.7.4 Охлаждают суспензию на льду и используют в течение 4 ч.
10.8 Подсчет культур
Разведение 10-2 до 10-3 анионным поверхностно-активным веществом рассчитывают по 11.2.4.
11.1 Подготовка образцов для анализа и посев
11.1.1 Общие положения
Для метода посева используют метод поглощения или метод переноса. Образцы для каждого метода готовят, как описано ниже. Метод переноса применяют к пробам текстильных изделий, не поглощающим воду.
11.1.2 Метод поглощения
11.1.2.1 Промывание пробы
При необходимости, например, чтобы оценить продолжительность обработки, образцы промывают по [1] или иным подходящим способом, и после окончательной промывки образцы споласкивают водой для того, чтобы смыть моющее средство. Применение неустановленного способа должно быть указано в протоколе испытания.
11.1.2.2 Масса и форма образцов
Получают образцы массой (0,40 +/- 0,05) г, вырезанные по размеру, удобному для испытания. Предпочтительная масса одного образца 0,4 г. Получают шесть контрольных образцов из контрольной ткани и шесть образцов для испытания из ткани для испытания, прошедшей противогрибковую обработку.
Примечание - Три контрольных и три испытуемых образца после противогрибковой обработки используют для нулевого момента времени (момента отсчета), сразу после посева. Остальные образцы используют для времени контактирования, после инкубации.
11.1.2.3.1 Расположение образцов
Каждый из образцов помещают в отдельные флаконы (7.7), выбрав один из следующих способов в соответствии с характером образца:
- если образец представляет собой изделие из текстиля, который может легко скручиваться, или содержит ватин или пух, на образец во флаконе (7.7) помещают стеклянную палочку. В качестве альтернативы связывают оба конца образца ниткой;
- если образец представляет собой пряжу, ее завязывают узлом и на полученный таким образом испытуемый образец во флаконе (7.7) помещают стеклянную палочку;
- если образцы взяты от ковров или аналогичных изделий, отрезают пучок и на полученный таким образом испытуемый образец во флаконе (7.7) помещают стеклянную палочку.
11.1.2.3.2 Стерилизация
При необходимости, например, для загрязненных образцов, стерилизуют их в автоклаве (7.3) в соответствии со следующей процедурой.
Закрывают верхнюю часть флаконов (7.7) с образцами алюминиевой фольгой.
Помещают закрытые флаконы (7.7) в металлическую корзинку для автоклавирования.
Оборачивают крышки флаконов алюминиевой фольгой и помещают их в металлическую корзинку.
Стерилизуют крышки и флаконы (7.7) с образцами в автоклаве (7.3) при температуре 121 °C (103 кПа) в течение 20 мин.
После стерилизации снимают алюминиевую фольгу и дают образцам в флаконах (7.7) просохнуть в течение не менее 60 мин, поместив их в стерильный бокс или любое другое место, где нет риска загрязнения из воздуха.
Примечание 1 - Если использовать автоклав невозможно, используют альтернативное средство стерилизации, например, газообразный этиленоксид или гамма-лучи, вносят их в протокол испытания.
Примечание 2 - Определенный способ стерилизации может дезактивировать или увеличить выделение определенных противомикробных веществ и, следовательно, привести к неправильным результатам.
Примечание 3 - Контрольную ткань можно стерилизовать способом, описанным выше.
11.1.2.3.3 Закрывают флакон пробкой
Плотно закупоривают флаконы после обработки для того, чтобы сохранить условия стерильности до посева.
11.1.2.4 Посев на испытуемые образцы
11.1.2.4.1 Открывают пробку флакона
11.1.2.4.2 Точно отбирают пипеткой 0,2 см3 посевного материала, приготовленного по 10.7 (от 1·105/см3 до 3·105/см3), и наносят в нескольких точках на каждом испытуемом образце, подготовленном по 11.1.2.3.
Если посевной материал плохо поглощается образцом, можно прижать его, например, стеклянной палочкой.
11.1.2.4.3 Необходимо убедиться в том, что суспензия хорошо перемешана перед нанесением и хорошо впиталась в образец, после чего закрывают флакон, следя за тем, чтобы посевной материал не попал на пробку.
11.1.3 Метод переноса
11.1.3.1 Подготовка образцов
По шаблону (7.20) вырезают шесть образцов диаметром (3,8 +/- 0,1) см.
Образцы не должны включать швы, кромки, вышивки, застежки и т.д.
При необходимости образцы промывают по [1] или иным подходящим способом, и после окончательного промывания образцы споласкивают водой для того, чтобы смыть моющее средство. Если используют неустановленный способ, его указывают в протоколе испытания.
При необходимости образцы можно стерилизовать в автоклаве (7.3), газообразном этиленоксиде, гамма-лучах или любым другим подходящим способом. Если используют неустановленный способ, его указывают в протоколе испытания.
Готовят 12 чашек Петри (7.2) диаметром 60 мм или шесть чашек Петри диаметром 90 мм с агаром SDA (8.3.3) для переноса.
Засевают 1 см3 исходной суспензии спор из 10.7 в диапазоне концентраций от 1·105/см3 до 3·105/см3 на агар, наклоняя чашку в нескольких направлениях для того, чтобы полностью омыть поверхность агара. Дают избытку жидкости максимально впитаться. Оставляют на (300 +/- 30) с.
11.1.3.3 Перенос культуры на образцы
11.1.3.3.1 Готовят шесть образцов контрольной ткани и шесть испытуемых образцов, прошедших противогрибковую обработку.
11.1.3.3.2 Выбирают два контрольных образца: один для момента отсчета и другой - для времени 48 ч. Устанавливают каждый образец на агаровую поверхность (11.1.3.2) в чашку Петри диаметром 60 мм (7.2) или два образца в чашку Петри диаметром 90 мм (7.2) (таким образом, чтобы исключить наложение образцов друг на друга) и придавливают гирей массой 200 г из нержавеющей стали (7.21) в течение (60 +/- 5) с. Убирают гирю и каждый образец.
Помещают один образец в чашку Петри диаметром 60 мм (7.2), размещая поверхность, на которую перенесены грибки, вверх в инкубаторе.
Помещают другой образец в стерильный мешок или флакон для испытания по 11.2.
11.1.3.3.3 Повторяют 11.1.3.3.2 еще для четырех контрольных образцов. Затем готовят три контрольных образца для нулевого момента и три контрольных образца для времени инкубации 48 ч.
11.1.3.3.4 Повторяют 11.1.3.3.2 для шести испытуемых образцов для того, чтобы получить три образца для нулевого момента и три образца для времени инкубации 48 ч.
В случае метода поглощения сразу же после инкубирования образцов добавляют 20 см3 среды SCDLP (8.3.5) в каждый из шести флаконов (7.7), в которых расположены один контрольный и один испытуемый образец, закупоривают пробками и встряхивают, как описано в a) или b).
В случае метода переноса сразу же после переноса помещают каждый образец в стерильный мешок или флакон, содержащий 20 см3 среды SCDLP и встряхивают в соответствии с нижеследующими a), b) или c).
Перемешивание с помощью вихревого смесителя в течение 1 мин x 5 циклов.
Берут флакон в руки и встряхивают по дуге приблизительно 30 см в течение 1 мин x 5 циклов.
c) Встряхивание на лопастной мешалке (7.23).
Помещают помеченный мешок однократного применения (7.28) в лопастную мешалку типа гомогенизатора Stomacher (7.23) и включают на 1 мин с каждой стороны мешка.
11.2.2 Инкубирование 48 ч
В случае метода поглощения инкубируют флаконы (7.7) (три контрольных и три испытуемых образца) при температуре (30 +/- 2) °C в течение (48 +/- 2) ч.
В случае метода переноса инкубируют чашки Петри (7.2) с образцами в камере повышенной влажности (7.24) при температуре (30 +/- 2) °C и относительной влажности выше 95% в течение (48 +/- 2) ч.
В случае метода поглощения после инкубации добавляют 20 см3 среды SCDLP в каждый из флаконов, плотно закрывают пробку и встряхивают в соответствии с 11.2.1.
В случае метода переноса после инкубации помещают каждый образец в стерильный мешок или флакон, содержащий 20 см3 среды SCDLP (8.3.5) и встряхивают по 11.2.1.
11.2.4.1 Приготовление серии разведений
11.2.4.1.2 Берут 1 см3 суспензии 11.2.1 или 11.2.3 пипеткой (7.9), добавляют в пробирку, содержащую (9,0 +/- 0,1) см3 анионного поверхностно-активного вещества (8.2) и энергично встряхивают. Это будет разведение 10-1.
11.2.4.1.3 Повторяют эту процедуру последовательно и готовят серию разведений 100 и 10-1 для нулевого момента инкубации и 100 до 10-4 для 48 ч инкубации.
11.2.4.2 Инкубирование серии разведений суспензии
11.2.4.2.1 Подсчет выполняют на поверхности среды SDA в чашке Петри. Распространяют 0,1 см3 суспензий и 0,1 см3 их серий разведений на поверхности среды SDA (одна чашка на один подсчет), используя пластиковый или стерилизованный нагревом инструмент.
11.2.4.2.2 Подсчет выполняют в глубине среды SDA в чашке Петри. Переносят 1 см3 каждого разведения в чашки Петри (7.2). Подогревают приблизительно 15 см3 среды SDA до температуры 45 - 46 °C на водяной бане (7.30), добавляют в чашки и тщательно перемешивают. Держат при комнатной температуре и дают среде застыть.
11.2.4.2.3 Переворачивают чашки вверх дном и инкубируют при температуре (28 +/- 2) °C в течение от 24 до 48 ч, наблюдают за ростом колоний грибков.
11.2.4.3 Подсчет колоний
11.2.4.3.1 После инкубирования подсчитывают число колоний на чашках Петри (7.2) серии разведений, в которых выросло от 1 КОЕ до 300 КОЕ.
11.2.4.3.2 Получают концентрацию грибков в растворе согласно ИСО 7218:2007 по формуле
(1)где N - концентрация грибков, КОЕ/см3;
d - первое разведение после двух последовательных разведений;
1,1 - коэффициент для объединения двух последовательных разведений по ИСО 7218:2007;
V - объем посевного материала, помещенного на каждой чашке, мм (0,1 см3).
В том случае, когда ни в одной из чашек Петри не содержится минимум 5 КОЕ, испытание считается неэффективным.
![]() Если нижеприведенные в a), b) и c) условия удовлетворительны, испытание считается эффективным. Если испытание считается неэффективным, выполняют повторное испытание.
a) Испытуемый посевной материал должен быть от 1·105/см3 до 3·105/см3.
b) Разность между десятичными логарифмами максимального количества грибков на трех контрольных тканях сразу после посева должна быть менее единицы. Эта разность сразу после инкубации также должна быть менее единицы.
где F - показатель роста на контрольной ткани;
Ct - среднеарифметическое количество грибков, полученное от трех образцов контрольной ткани после инкубации в течение (48 +/- 2) ч;
C0 - среднеарифметическое количество грибков, полученное от трех образцов контрольной ткани сразу после посева.
12.2 Расчет значения противогрибковой активности
Если условие 12.1 удовлетворяется, испытание считается эффективным. Если испытание считается неэффективным, выполняют повторное испытание.
После подтверждения достоверности результатов испытания используют формулу (3) для получения значения противогрибковой активности.
где A - значение противогрибковой активности;
F - показатель роста на контрольной ткани, F = lg Ct - lg C0;
G - показатель роста на обработанных противогрибковым средством образцах, G = lg Tt - lg T0;
Tt - среднеарифметическое количество грибков, полученное от трех образцов, обработанных противогрибковым средством, после инкубации в течение (48 +/- 2) ч;
T0 - среднеарифметическое количество грибков, полученное от трех образцов, обработанных противогрибковым средством сразу после посева.
В протоколе испытания должна содержаться следующая информация:
a) ссылка на настоящий стандарт;
b) описание испытуемой пробы;
c) тип использованной контрольной ткани;
d) тип использованных референтных штаммов грибков;
e) концентрация спор;
f) метод посева;
g) показатель роста F из формулы (2);
h) показатель противогрибковой активности A каждого образца;
i) все отклонения от настоящего стандарта.
(справочное)
ГРИБКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ИСПЫТАНИЯХ ПО НАСТОЯЩЕМУ СТАНДАРТУ
A.1 Общие положения
Используемые в испытаниях грибки должны быть идентичны указанным в таблице A.1, которые были законсервированы членами Всемирной Федерации коллекций культур [World Federation for Culture Collection (WFCC)].
A.2 Перечень грибков
Данные грибки законсервированы членами Всемирной Федерации коллекций культур.
Таблица A.1
Примечание - После соответствующего подтверждения можно использовать другие культуры и другие коллекции.
(справочное)
Могут быть применены следующие критерии, чтобы показать действенность противогрибковых средств.
Примечание - Рекомендуемый критерий не гарантирует отсутствия роста грибков. Это означает, что грибки на обработанном изделии растут медленнее или не растут совсем по сравнению с контрольным текстильным изделием.
Таблица B.1
Пример эффективности противогрибкового средства
(справочное)
НАЦИОНАЛЬНЫМ И ДЕЙСТВУЮЩИМ В ЭТОМ КАЧЕСТВЕ
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫМ СТАНДАРТАМ
Таблица ДА.1
Вернуться в "Каталог нормативных документов"
Источник информации: https://internet-law.ru/documents/prod/gost-r_gosudarstvennyj-standart/31/gost_49176.html
На правах рекламы:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||