"ГОСТ Р ИСО 21571-2014. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2014 N 1656-ст)

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки "Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева" Российской академии наук (ИФР РАН) на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 447 "Биологическая безопасность пищевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 ноября 2014 г. N 1656-ст.

4 Настоящий стандарт является идентичным международному стандарту ИСО 21571:2005 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот" (ISO 21571:2005 "Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Nucleic acid extraction"), включая техническую поправку: Amd.1:2013.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации и межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Исследование генетически модифицированных организмов (далее - ГМО) и производных продуктов осуществляется посредством следующих стадий, выполняемых последовательно или одновременно. После отбора проб нуклеиновые кислоты выделяются из анализируемой пробы. Выделенные нуклеиновые кислоты далее могут быть очищены от возможных примесей в самом процессе выделения или после него. Следующими этапами являются: оценка количества выделенных нуклеиновых кислот (при необходимости), разведение нуклеиновых кислот (при необходимости) и выполнение аналитических процедур, например полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР). Указанные этапы подробно изложены в настоящем стандарте и следующих международных стандартах:

- ИСО 21568 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор проб";

- ИСО 21569 "Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Качественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте";

- ИСО 21570 "Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте".

Дополнительная информация об общих требованиях и определениях, относящихся к упомянутым выше этапам, приведена в ИСО 24276 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения".

В 2013 г. в ИСО 21571:2005 была внесена техническая поправка N 1 (Amd.1:2013) в части уточнения условий экстракции ДНК и добавления нового подраздела A.5.2 (приложение A), касающегося применения гуанидин-хлороформного метода для соевого лецитина. В настоящем стандарте техническая поправка N 1 выделена на полях одиночной вертикальной чертой.

1. Область применения

Настоящий стандарт устанавливает общие требования и специфические методы выделения, очистки и количественной оценки дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее - ДНК). Эти методы изложены в приложениях A и B.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, но может быть также применен к другим продуктам, например семенам и кормам.

Настоящий стандарт следует применять совместно с ИСО 21569, ИСО 21570 в части аналитических методов на основе нуклеиновых кислот, в частности качественных аналитических методов, установленных в ИСО 21569, и количественных аналитических методов, установленных в ИСО 21570.

2. Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта.

ИСО 24276:2006 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения (ISO 24276:2006, Foodstuffs.Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. General requirements and definitions)

ИСО 21568:2003 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор образцов (ISO 21658:2003, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling)

3. Принципы

3.1. Общие положения

Основная цель применения методов экстракции нуклеиновых кислот - обеспечение выделения нуклеиновых кислот, пригодных для последующего анализа (см. ИСО 24276).

Примечание - "Качество" ДНК зависит от средней длины экстрагированных молекул ДНК, химической чистоты и структурной целостности одной нити и двойной спирали ДНК (например, внутри- и межцепочечные связи оснований ДНК, выпадение оснований в цепочке ДНК, перекрестные сшивки с высокомолекулярными спиртами, гемином и т.д.). Кроме того, такие структурные изменения часто являются специфичными для определенной последовательности ДНК и поэтому не распределены по геному случайным образом (см. [1] - [4]).

Пользователям настоящего стандарта необходимо иметь в виду, что некоторые методы (например, методы на основе диоксида кремния) могут быть запатентованы.

3.2. Экстракция ДНК

Основной принцип выделения присутствующей в пробе ДНК заключается в одновременной или последующей очистке ДНК от ингибиторов полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Методы выделения и очистки ДНК изложены в приложении A. Выбор метода основывается на опыте пользователя с учетом области применения и примеров продуктов, которые указаны в каждом методе.

Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующем продукте, подлежащем исследованию.

3.3. Количественная оценка содержания ДНК

Количественная оценка экстрагированной ДНК может потребоваться для последующего ПЦР-анализа.

Такая оценка может выполняться либо физическими (например, измерением поглощения при специфической длине волны), физико-химическими (например, применением интеркалирующих или связующих агентов, обладающих флюоресцентными свойствами), ферментативными (например, биолюминесцентным обнаружением) методами, либо путем количественной ПЦР. Последний метод применяется для продуктов сложного состава, проб с низким содержанием ДНК или проб, в которых ДНК подверглась деградации.

Существует несколько методов, применяемых для определения количества ДНК, присутствующей в растворе. Эти методы изложены в приложении B.

Выбор наиболее подходящего метода осуществляется пользователем в зависимости от количества и качества ДНК, подлежащей количественному определению, а также от продукта, из которой была экстрагирована ДНК.

Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующем продукте.

4. Общие требования к лаборатории

Вследствие воздействия пыли и распыляемых аэрозолей может происходить случайная контаминация ДНК, поэтому организация рабочих мест в лаборатории основывается на строгом соблюдении:

- последовательности всех установленных методологических этапов, используемых для получения промежуточных и конечных результатов;

- принципа "прямого потока" при обращении с пробами.

Использование последнего принципа гарантирует, что ДНК, подлежащая анализу, и полученная в результате ПЦР амплифицированная ДНК, остаются физически разделенными.

Дополнительные требования к лабораториям приведены в ИСО 24276.

5. Методика

5.1. Приготовление проб для анализа

5.1.1 Общие положения

Специфические параметры анализируемого продукта (например, влажность) и его обработка могут влиять на количество и качество ДНК, выделяемой из анализируемого продукта. В связи с этим рабочие характеристики применяемого метода экстрагирования ДНК зависят от конкретного анализируемого продукта.

Необходимо принять соответствующие меры, чтобы гарантировать, что проба для анализа является представительной, отобранной из лабораторной пробы.

Проба для анализа должна быть достаточной(го) массы (объема) и содержать достаточное количество молекул ДНК для обеспечения представительности лабораторной пробы.

Исходя из практических и технических соображений не рекомендуется, чтобы масса пробы для анализа превышала 2 г.

Любые ограничения, связанные с массой (объемом) пробы для анализа, не позволяющие рассматривать ее как представительную, должны быть учтены при интерпретации аналитических результатов и указаны в протоколе испытаний.

Методы экстракции ДНК, приведенные в приложении A, устанавливают массу пробы для анализа от 200 до 500 мг, что обычно является приемлемым для продукции с высоким содержанием ДНК (молотое зерно, мука). Однако некоторые продукты содержат очень малое количество ДНК или деградировавшую ДНК, в связи с этим указанная масса пробы не позволит выделить достаточное для анализа количество ДНК. В таких случаях масса (объем) пробы может быть увеличена.

Выделение ДНК должно выполняться не менее чем из двух параллельных проб одной и той же продукции.

Хранение стандартных образцов, лабораторных проб и анализируемых проб должно соответствовать требованиям ИСО 24276 и быть организовано таким образом, чтобы анализируемые биохимические параметры были сохранены (подробнее см. ИСО/МЭК 17025).

5.1.2 Пробы

В случае жидких проб сосуд с пробой необходимо встряхивать для обеспечения гомогенизации продукта. В случае негомогенных продуктов типа неочищенных масел необходимо убедиться, что осадок и все нерастворимые составляющие полностью удалены со стенок сосуда.

Если какие-либо компоненты лабораторной пробы были удалены до проведения экстракции ДНК, то это должно быть указано в протоколе испытаний с описанием проведенных операций.

Для твердых или пастообразных готовых пищевых продуктов с высоким содержанием липидов достаточно трудно достичь требуемого размера частиц за один этап измельчения. В таких случаях допускается перед измельчением применять дополнительные процедуры, такие как удаление липидов гексаном после промежуточного измельчения, замораживание или сублимационная сушка.

Для улучшения измельчения пастообразных или вязких продуктов в некоторых случаях можно использовать одну из следующих обработок:

- нагрев до максимальной температуры 40 °C;

- растворение в соответствующей жидкости, например в воде;

- замораживание при температуре минус 20 °C или ниже.

Во время проведения процедур размола и измельчения необходимо соблюдать меры, гарантирующие нагрев лабораторной пробы на минимальном уровне и не допускающие ее сильного нагревания, так как нагрев может отрицательно воздействовать на качество выделяемой ДНК.

По возможности необходимо избегать способов размола/измельчения, при которых возникает высокий риск перекрестного загрязнения (например, комбинированное использование жидкого азота и ступки, а также использование одной и той же ступки для разных образцов). Одним из основных требований является необходимость изолирования любого методологического этапа, при проведении которого происходит образование пыли, от всех других аналитических этапов и процедур.

В случае присутствия в лабораторной пробе солей, специй, сахарной пудры и/или других веществ, которые потенциально могут оказывать влияние на выделение ДНК или последующий аналитический метод, должны быть предприняты дополнительные соответствующие процедуры очистки в соответствии с используемым методом (см. приложение A).

Например, в случае образцов сложного состава целевой материал для исследования (например, панировочный слой рыбных палочек) может быть отделен от остальной части продукта для выделения ДНК.

5.2. Экстракция и очистка ДНК

5.2.1 Общие положения

При разработке методов выделения ДНК необходимо учитывать следующие требования.

Качество и выход экстрагированной нуклеиновой кислоты при использовании того или иного метода для того или иного продукта должны быть как повторяемыми, так и воспроизводимыми при условии содержания достаточного количества нуклеиновой кислоты в анализируемой пробе, из которой она была выделена.

Для получения ДНК хорошего качества рекомендуется при необходимости удалить следующие компоненты:

- полисахариды (пектин, целлюлозу, гемицеллюлозу, крахмал, загустители и т.д.) путем обработки соответствующим ферментом (например пектиназой, целлюлазой, гемицеллюлазой, ) или экстрагирования органическим растворителем (например гексадецилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ)/хлороформ);

- рибонуклеиновые кислоты (далее - РНК) и/или белки путем соответствующей обработки, например ферментативной обработки рибонуклеазой и протеиназой соответственно;

- липидные фракции путем ферментативной обработки или использования растворителей (например гексана);

- солей (например из буфера для выделения и лизиса, добавляемых в раствор на стадии осаждения), способных оказывать влияние на последующий анализ.

В частности, в случае твердых или высушенных проб объем буфера для выделения и лизиса должен быть таким, чтобы гарантировать растворение в нем ДНК.

Примечание - Очистка ДНК может выполняться различными способами, например путем фракционного осаждения с использованием таких растворителей, как фенол, хлороформ, этанол, изопропанол, и/или с использованием адсорбции на твердые матрицы (ионообменную смолу, силикагель или жидкое стекло, диатомовую землю, мембраны и т.д.). Можно объединить несколько принципов очистки ДНК. При необходимости выделение и очистка могут совмещаться путем выполнения на одном и том же этапе.

В случае использования соосадителей ДНК, например гликогена, полиэтиленгликоля (ПЭГ), транспортной РНК (т-РНК), для увеличения выхода ДНК в ходе стадий осаждения они не должны обладать нуклеазной активностью (содержать детектируемый уровень нуклеаз), содержать ингибиторы и/или конкуренты ПЦР или последовательности нуклеиновых кислот, гомологичные анализируемым последовательностям. При выделении ДНК из генетически модифицированных растений в качестве соосадителя может быть использована ДНК-носитель, например ДНК из спермы лосося или сельди.

При использовании сублимационных сушилок для высушивания осадка ДНК, полученного после стадии осаждения, необходимо учитывать риск перекрестного загрязнения.

Необходимо повторно растворяют ДНК в воде или буферном растворе для предотвращения деградации ДНК.

Пример - Для ресуспендирования или разбавления ДНК пригоден трис/ЭДТА (1^x или 0,1^x) с 8,0 ед. pH.

При применении нового метода выделения ДНК или одного из методов, описанных в приложении A, для новых продуктов потенциальные качество и целостность выделенной ДНК с использованием выбранного метода должны быть проверены следующим образом: путем добавления в лизирующий буфер известного количества меченой ДНК вместе с пробой, из которой необходимо выделить ДНК. Если оценка нового метода производится на основании использования меченой ДНК, количество (масса) которой известно, или подсчета количества копий определенной последовательности ДНК, необходимо оценить возможную перекрестную реактивность такой ДНК с ДНК, содержащейся в исследуемой пробе.

Примечание - Использование меченой ДНК является наилучшим приближением к реальной ситуации, когда предполагается образование комплекса ДНК данного продукта с другими компонентами (например белками). Такой метод также может использоваться для оценки присутствия растворимых ингибиторов ПЦР в выделенной ДНК (см. ИСО 24276, ИСО 21569 и ИСО 21570).

Однако меченая ДНК может привести к ложному представлению о степени извлечения ДНК, так как она может гораздо легче выделяться из продукта, чем целевая ДНК.

5.2.2 Процедуры контроля

Процедуры контроля, подлежащие использованию при проведении анализа, описаны в таблице 1 ИСО 24276. Они должны включать, как минимум, отрицательный и положительный контроли экстрагирования, а также могут включать контроль окружающей среды.

5.2.3 Контроль чистоты ДНК. Внутренний контроль ПЦР

При отработке нового метода экстрагирования присутствие ингибиторов ПЦР в экстрагированной ДНК может быть оценено с помощью внесения чужеродной ДНК (внутренний стандарт, см. ИСО 24276, ИСО 21569 и ИСО 21570). Количество добавленной ДНК не должно превышать максимальный уровень, допустимый для применяемой системы ПЦР, и должно содержать установленное число копий последовательности целевой ДНК. Это число необходимо определять отдельно для каждой последовательности целевой ДНК и указывать как кратное нижнему пределу обнаружения. В идеальном случае концентрация целевой ДНК в ПЦР при положительном контроле должна соответствовать чувствительности, требуемой для анализа. При использовании в качестве положительного контроля ПЦР высококонцентрированной клонированной целевой последовательности ДНК необходимо соблюдать осторожность из-за высокой опасности перекрестного загрязнения. По возможности нуклеиновые кислоты положительного контроля должны максимально соответствовать параметрам нуклеиновых кислот исследуемого материала.

5.3. Количественная оценка экстрагированной ДНК

5.3.1 Общие положения

Количественная оценка ДНК помогает:

- при определении эффективности различных методов выделения ДНК для определенного вида объектов (повторяемость);

- измерении концентрации нуклеиновых кислот перед анализом.

5.3.2 Область применения

Каждый метод количественной оценки должен применяться в пределах его динамического диапазона с учетом уровня точности измерения.

5.3.3 Количественные стандарты

Точность методов количественной оценки зависит от стандартов нуклеиновых кислот, используемых для калибровки метода.

При использовании метода, чувствительного к размеру и/или качеству фрагментов нуклеиновой кислоты, должны применяться стандарты нуклеиновой кислоты, которые соответствуют ожидаемым размеру и/или качеству нуклеиновой кислоты, экстрагированной из пробы.

Используемый контрольный материал (национальный или международный стандартный образец) должен обеспечивать проявление заявленных характеристик по непрерывной цепи при сравнении со стандартами национального или международного эталона (см. Руководство ИСО 30).

При применении метода с использованием интеркалирующих (встраивающихся в ДНК) агентов необходимо применять стандарт ДНК с высокой молекулярной массой, если количественной оценке подлежит ДНК с высокой молекулярной массой. Соответственно необходимо использовать стандарт ДНК с низкой молекулярной массой при количественной оценке ДНК с низкой молекулярной массой. Нуклеиновая кислота с высокой молекулярной массой, как правило, содержит некоторое количество фрагментов с более низкой молекулярной массой. Это означает, что многие методы количественной оценки ДНК имеют определенную степень неточности, которую необходимо учитывать при оценке результатов.

Примечание - Кроме того, в зависимости от исследуемого материала и применяемого метода выделения некоторая часть ДНК может быть извлечена в виде одноцепочечной ДНК (которая имеет гораздо более низкую способность к интеркаляции), что приводит к занижению общего содержания ДНК. С другой стороны, одноцепочечная ДНК также хорошо обнаруживается путем физических измерений.

Для построения калибровочного графика требуется не менее трех точек, предпочтительно в нескольких повторностях. Количество стандартной ДНК, использованной для каждой точки калибровочного графика, зависит от чувствительности метода и динамического диапазона измерений.

5.4. Стабильность выделенной ДНК

Выделенная из пробы ДНК должна храниться в условиях, которые обеспечивают ее стабильность для проведения последующих анализов.

Следует избегать многократного замораживания и оттаивания растворов ДНК.

6. Оценка результатов

Применяемый метод экстракции ДНК должен обеспечивать получение нуклеиновой кислоты, качество и количество которой соответствуют требованиям последующих анализов.

Дополнительные параметры для оценки совместимости метода указаны в ИСО 21569, ИСО 21570 и ИСО 24276.

7. Протокол испытаний

В случае представления протокола испытаний в соответствии с ИСО 24276 в него должна быть включена следующая дополнительная информация о деятельности лаборатории:

- описание происхождения проб для анализа и предварительной обработки пробы перед экстракцией нуклеиновой кислоты;

- масса проб для анализа, используемых для экстракции нуклеиновой кислоты;

- используемый метод экстракции нуклеиновой кислоты;

- любые нетипичные ситуации, наблюдаемые во время проведения испытаний;

- любая операция, не указанная в методе или рассматриваемая как необязательная, которая может оказать влияние на результаты;

- оценка результатов;

- персонал.

Обработка и хранение исходных данных изложены в ИСО/МЭК 17025.

A.1. Получение применимой для ПЦР ДНК методами экстракции ДНК на основе фенола/хлороформа

A.1.1. Основной метод на основе фенола/хлороформа

A.1.1.1 Общие положения

Настоящий метод является общепринятым (см. [5]) и применяется для экстракции ДНК из большой группы продуктов (см. A.1.1.8).

Фенол обычно подходит для деструкции нуклеаз и денатурации белка.

При исследовании листьев или зеленой массы растений (например, листьев цикория, высушенной люцерны) вместе с ДНК могут совместно осаждаться многие ингибиторы ПЦР. По этой причине могут возникнуть трудности, связанные с воспроизводимостью получения ДНК, амплифицируемой в ПЦР.

С учетом агрессивных и опасных свойств фенола в качестве альтернативы целесообразно применять методы экстрагирования ДНК, основанные на ЦТАБ и/или поливинилпирролидоне (ПВП) и/или на адсорбции диоксидом кремния.

A.1.1.2 Статус валидации

Этот метод широко применяется во всех областях биологии, агрономии и медицины на протяжении 40 лет, однако он никогда не подвергался оценке путем межлабораторных исследований для обнаружения ГМО в пищевых продуктах.

A.1.1.3 Принцип метода

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и высокой концентрации этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и последующее удаление загрязняющих примесей (например, липофильных молекул, полисахаридов и белков) и нуклеаз из водной фазы, содержащей ДНК, с помощью фенола и хлороформа. Заключительное осаждение этиловым спиртом концентрирует ДНК и удаляет соли и остаточный хлороформ. Критическим этапом метода является стадия лизиса [5].

A.1.1.4 Меры предосторожности

Работы с органическими реактивами необходимо выполнять в вытяжном шкафу.

A.1.1.5 Реактивы

A.1.1.5.1 Этиловый спирт (C₂H₅OH), 96%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °C.

A.1.1.5.2 Ледяная уксусная кислота, CH₃COOH.

A.1.1.5.3 Калия ацетат, C₂H₃O₂K.

A.1.1.5.4 Соляная кислота, HCl, 37%-ная.

A.1.1.5.5 Изоамиловый спирт [(CH₃)₂CHCH₂CH₂OH].

A.1.1.5.6 Фенол, C₆H₅OH.

A.1.1.5.7 Хлороформ, CHCl₃.

A.1.1.5.8 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), C₄H₁₁NO₃.

A.1.1.5.9 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двукалиевая соль (K₂ЭДТА), C₁₀H₁₄N₂O₈K₂.

A.1.1.5.10 Калия гидроксид, KOH.

A.1.1.5.11 Калия хлорид, KCl.

A.1.1.5.12 Натрия додецилсульфат (SDS), C₁₂H₂₅O₄SNa.

A.1.1.5.13 Протеиназа K, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

A.1.1.5.14 Рибонуклеаза-A, выделенная из бычьей поджелудочной железы, очищенная от ДНК, приблизительно 50000 ед./мг лиофилизата.

A.1.1.5.15 Уравновешенный фенол, > 7,8 ед. pH

Используется фенол, уравновешенный буфером для экстрагирования/лизиса (A.1.1.5.18), без SDS, или приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

A.1.1.5.16 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (A.1.1.5.7) и одну объемную часть изоамилового спирта (A.1.1.5.5).

A.1.1.5.17 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают одну объемную часть уравновешенного фенола (A.1.1.5.15) и одну объемную часть смеси хлороформ - изоамиловый спирт (A.1.1.5.16).

A.1.1.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса

Молярные концентрации компонентов: Трис = 0,050 моль/дм³, K₂ЭДТА = 0,050 моль/дм³; массовая концентрация SDS = 30 г/дм³. Доводят pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или KOH.

A.1.1.5.19 Буфер TE, Трис = 0,010 моль/дм³, K₂ЭДТА = 0,001 моль/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или KOH.

A.1.1.5.20 Раствор протеиназы-K в стерильной воде, 20 мг/см³.

Автоклавирование раствора не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегать многократного замораживания и оттаивания.

A.1.1.5.21 Раствор рибонуклеазы-A, 10 мг/см³ лиофилизата

Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегать многократного замораживания и оттаивания.

A.1.1.5.22 Раствор этилового спирта, C₂H₅OH, 70%-ный.

Следует хранить при температуре минус 20 °C.

A.1.1.5.23 Раствор ацетата калия, (C₂H₃O₂K), 3 моль/дм³

Доводят значение pH до 5,2 ед. pH ледяной уксусной кислотой. Автоклавирование раствора не допускается. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

A.1.1.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

A.1.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 10000 g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

A.1.1.6.2 Водяная баня или инкубатор с рабочим диапазоном температур от 60 °C до 70 °C.

A.1.1.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

A.1.1.6.4 Сублимационная сушилка (при необходимости).

--------------------------------

<1> Vortex - это пример коммерчески доступного оборудования, пригодного для использования с описываемым методом. Эта информация приводится исключительно для информации пользователей настоящего стандарта и ни при каких условиях не может служить рекомендацией или одобрением конкретного типа оборудования. Допускается использование аналогичного оборудования, при условии, что оно позволяет получать такие же результаты.

A.1.1.6.6 Реакционные сосуды, способные выдержать заморозку в жидком азоте.

A.1.1.7 Методика

A.1.1.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера анализируемой пробы необходимо соответственно скорректировать массы и объемы реактивов и буферных растворов.

A.1.1.7.2 Методика выделения

Взвешивают 0,25 г анализируемой пробы в микропробирке. Добавляют 1,6 см³ буфера для экстрагирования/лизиса (A.1.1.5.18) и в случае необходимости (например, для проб с высоким содержанием белка) 50 мм³ раствора протеиназы-K (A.1.1.5.20). Инкубируют при температуре от 60 °C до 70 °C, обычно в течение от 30 мин до 2 ч (также возможно инкубирование в течение ночи). Добавляют рибонуклеазу-A (A.1.1.5.21) до конечной массовой концентрации 0,1 мкг/см³. Центрифугируют при ускорении 5000 g в течение 30 мин. Извлекают образовавшийся верхний слой (супернатант) и переносят в чистую пробирку. Добавляют к нему один объем уравновешенного фенола (A.1.1.5.15), затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000g в течение 15 мин, переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Добавляют к верхнему слою один объем смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (A.1.1.5.17), затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000g в течение 15 мин, переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. В зависимости от состава анализируемой пробы (продукта) данную процедуру повторяют один или несколько раз до тех пор, пока граница раздела фаз не станет четкой.

Добавляют к верхнему слою один объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (A.1.1.5.16), затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000 g в течение 10 мин и переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Повторяют до тех пор, пока граница раздела фаз не станет четкой. Смешивают образовавшийся верхний слой с 0,1 объема раствора ацетата калия (A.1.1.5.23) и 2,5 объема 96%-ного этилового спирта (A.1.1.5.1), затем тщательно перемешивают, переворачивая пробирки. Выдерживают в течение по меньшей мере 5 мин в жидком азоте или 1 ч при температуре минус 80 °C, или всю ночь при температуре минус 20 °C. Центрифугируют при ускорении 10000g (или до 13000g) при температуре 4 °C в течение по меньшей мере 15 мин, затем осторожно сливают образовавшийся верхний слой.

Тщательно промывают осадок ДНК в пробирке после центрифугирования двумя объемами 70%-ного раствора этилового спирта (A.1.1.5.22). Центрифугируют при ускорении от 10000g до 13000g при температуре 4 °C в течение 15 мин, затем осторожно сливают образовавшийся верхний слой. Эта стадия является особенно важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Высушивают осадок в пробирке после центрифугирования и повторно растворяют его в 100 мм³ воды или соответствующего буфера, например буфера TE (A.1.1.5.19). Полученный раствор представляет собой основной раствор ДНК. Добавляют рибонуклеазу-A (A.1.1.5.21) до конечной массовой концентрации 0,1 мкг/см³.

A.1.1.8 Перечень примеров

Описанный метод был успешно применен для экстрагирования ДНК <1> из следующих продуктов: квашеные соевые бобы <1>, обезвоженная люцерна, детское сухое печенье <1>, детское молоко <1>, бактерии и их споры, семена ячменя, говяжий/свиной паштет <1>, пиво <1>, "голубой сыр", шоколадное пирожное с орехами <1>, консервированная кукуруза, семена моркови, брикетированный зерновой концентрат <1>, сыр, наггетсы куриные, листья цикория, корни цикория, печенье, глазированное шоколадом <1>, шоколадная паста <1>, печенье с корицей <1>, компоты, кукурузные хлопья <1>, дробленый рис, десертный крем <1>, высушенные семена гороха, кукурузное печенье, кормовой кукурузный жмых, кукурузная мука, кукурузный глютеновый корм, семена кукурузы, гранулированный корм из маниоки, мясо в муке из маниоки, мясо свежее и подвергнутое тепловой обработке <1> (говядина, свинина, курица и индейка), мякоть дыни, семена дыни, рубленое мясо, ингредиенты мюсли, мюсли <1>, побеги золотистой фасоли <1>, семена овса, клубни картофеля, кормовой рапсовый жмых, "глупаколца", семена рапса, колбаса (реализуемая в ломтиках <1> и комбинированная <1> (см. A.1.2 для усовершенствованного метода экстракции ДНК), шницель, суповые шарики, соевый белок в мясных продуктах <1>, соевый лецитин (необработанный коричневый и желтый рафинированный <1>), побеги сои <1>, соевые напитки, соя, соевый крем, кормовой соевый жмых, соевый творог, соус для спагетти <1>, семена полбы, сахарная свекла (сушеный жом), сахарная свекла (свежие корнеплоды), семена сахарной свеклы, семена подсолнечника, тофу (японский соевый творог), свежие томаты, томатная паста <1>, семена томатов, вегетарианский гамбургер, вафли (с шоколадом <1> и без шоколада <1>), пшеничные отруби, пшеничная мука, глютеновый корм из пшеницы, семена пшеницы, крупка из твердой пшеницы, йогурт <1> (см. A.1.3 для усовершенствованного метода экстрагирования).

--------------------------------

<1> Повторяемость может зависеть от партии продукта и/или технологии его получения. В некоторых случаях ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказываются ниже предела обнаружения метода независимо от используемых праймеров и/или протоколов ПЦР. Это может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.

A.1.2. Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур колбас, подвергаемых ферментации

A.1.2.1 Общие положения

Этот метод предназначен для экстракции суммарной ДНК, включая бактериальную геномную ДНК, из колбас. Применимость метода для получения ДНК высокого качества, пригодной для специфического обнаружения рекомбинантной ДНК с использованием ПЦР, была продемонстрирована на колбасах, подвергнутых ферментации [6], а также на колбасах, подвергнутых ферментации и термической обработке, так называемых "летних колбасах" [7]. Кроме того, было показано, что настоящий метод экстракции пригоден для выделения суммарной ДНК из сливок специально для обнаружения Staphylococcus aureus в этом пищевом продукте [8]. (Перечень продуктов, для которых применим этот метод, приведен в A.1.2.8).

A.1.2.2 Статус валидации

Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании проб массой 0,4 г (см. A.1.2.9).

A.1.2.3 Принцип метода

Метод заключается в выделении бактериальных клеток из пищевого продукта путем гомогенизации проб колбас с последующим центрифугированием. Полученный осадок содержит не только бактериальные клетки, но также и частицы мяса. Для проведения специфического лизиса бактериальных клеток их оболочки расщепляют, добавляя лизоцим. Для улучшения расщепления клеточных оболочек молочнокислых бактерий может быть добавлен мутанолизин. Полный лизис клеток происходит при добавлении детергента SDS (додецилсульфата натрия) и протеиназы-K, а затем несколько раз проводится экстрагирование водной фазы фенолом и/или хлороформом. Стадия экстрагирования фенолом/хлороформом является важной для устранения любой нуклеазной активности и ингибиторов ПЦР, включая те, которые возникли из пищевого продукта (например гематина). Последним этапом является осаждение ДНК этиловым спиртом.

A.1.2.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

A.1.2.5 Реактивы

A.1.2.5.1 Изопропанол [CH₃CH(OH)CH₃].

A.1.2.5.2 Этиловый спирт, C₂H₅OH, 96%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °C.

A.1.2.5.3 Ледяная уксусная кислота, CH₃COOH.

A.1.2.5.4 Соляная кислота, HCl, 37%-ная.

A.1.2.5.5 Натрия гидроксид, NaOH.

A.1.2.5.6 Изоамиловый спирт [(CH₃)₂CHCH₂CH₂OH)].

A.1.2.5.7 Фенол, C₆H₅OH.

A.1.2.5.8 Хлороформ, CHCl₃.

A.1.2.5.9 Трис (оксиметил) аминометан (Трис), C₄H₁₁NO₃.

A.1.2.5.10 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль, (Na₂ЭДТА), C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂.

A.1.2.5.11 Натрия додецилсульфат (SDS), C₁₂H₂₅O₄SNa.

A.1.2.5.12 Лизоцим

50000 ед./мг белка (1 ед. будет давать в минуту при 6,24 ед. pH и температуре 25 °C, используя суспензию Micrococcus lysodeikticus в качестве субстрата, в 2,6 см³ реакционной смеси при длине оптического пути 1 см).

A.1.2.5.13 Сахароза, C₁₂H₁₂O₁₁.

A.1.2.5.14 Протеиназа-K, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

A.1.2.5.15 Натрия ацетат (C₂H₃O₂Na).

A.1.2.5.16 Уравновешенный фенол

Используют фенол, уравновешенный буферным раствором Трис/HCl (> 7,8 ед. pH) или приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

A.1.2.5.17 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (A.1.2.5.8) и одну объемную часть изоамилового спирта (A.1.2.5.6).

A.1.2.5.18 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 25 объемных частей уравновешенного фенола (A.1.2.5.16) с 24 объемными частями хлороформа (A.1.2.5.8) и одной объемной частью изоамилового спирта (A.1.2.5.6).

A.1.2.5.19 Раствор мутанолизина в стерильной воде, содержащий 500 или 5000 ед./см³ мутанолизина

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегая многократного замораживания и оттаивания.

A.1.2.5.20 Раствор лизоцима в стерильной воде концентрацией 10 мг/см³

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегая многократного замораживания и оттаивания.

A.1.2.5.21 Раствор сахарозы, C₁₂H₁₂O₁₁, 400 г/дм³.

A.1.2.5.22 Буферный раствор A, (Трис) = 0,020 моль/дм³, (Na₂ЭДТА) = 0,020 моль/дм³, (NaCl) = 0,1 моль/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.1.2.5.23 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий одну объемную часть буфера A (A.1.2.5.22) и одну объемную часть раствора сахарозы (A.1.2.5.21).

A.1.2.5.24 Раствор SDS, (SDS) = 250 г/дм³.

A.1.2.5.25 Раствор протеиназы-K концентрацией 20 мг/см³

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегая многократного замораживания и оттаивания.

A.1.2.5.26 Раствор этилового спирта, C₂H₅OH, 70%-ный

Следует хранить при температуре и использовать при температуре минус 20 °C.

A.1.2.5.27 Раствор натрия ацетата, C₂H₃O₂Na концентрацией 3 моль/дм³

Доводят значение pH до 5,2 единиц ледяной уксусной кислотой.

A.1.2.5.28 Буфер TE, (Трис) = 0,010 моль/дм³, (Na₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.1.2.6 Оборудование

A.1.2.6.1 Инструменты для измельчения пробы (например, скальпель).

A.1.2.6.2 Центрифуга, поддерживающая ускорение, как минимум, 12000g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

A.1.2.6.3 Водяная баня или инкубатор.

A.1.2.6.4 Вакуумная сушилка (при необходимости).

A.1.2.6.5 Смеситель, например, Vortex.

A.1.2.7 Методика

A.1.2.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера навески пробы требуется соответственно масштабировать массу реактивов и объемы буферов.

A.1.2.7.2 Приготовление пробы

Измельчают колбасу, гомогенизируют и добавляют к 200 - 500 мг гомогената три объема воды (до 1,5 см³). Выдерживают при комнатной температуре приблизительно 10 мин.

A.1.2.7.3 Методика выделения ДНК

Осторожно переносят 500 мм³ водной фазы (суспензии) в новую пробирку. Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 12000g.

Надосадочную жидкость отбрасывают и повторно растворяют осадок в 500 мм³ буфера для экстрагирования/лизиса (A.1.2.5.23).

Добавляют 50 мм³ раствора лизоцима (A.1.2.5.20). Инкубируют при температуре 37 °C в течение 1 ч. Если результаты неудовлетворительные, можно добавить к лизоциму 10 ед. мутанолизина (A.1.2.5.19). Однако перед систематическим применением необходимо проверить специфичное для продукта воздействие этой добавки.

Добавляют 25 мм³ раствора SDS (A.1.2.5.24) и 25 мм³ раствора протеиназы-K (A.1.2.5.25), затем инкубируют в течение 10 мин при температуре 60 °C.

Добавляют один объем смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (A.1.2.5.18) и перемешивают.

Центрифугируют смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят верхнюю водную фазу в новую пробирку.

Добавляют один объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (A.1.2.5.17) и перемешивают.

Центрифугируют смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят верхнюю фазу в новую пробирку.

Добавляют 0,1 объема раствора ацетата натрия (A.1.2.5.27) и один объем изопропанола (A.1.2.5.1). Осторожно перемешивают несколько раз путем переворачивания пробирки.

Выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000g. Надосадочную жидкость удаляют.

Осадок после центрифугирования тщательно промывают не менее 500 мм³ раствора этилового спирта (A.1.2.5.26), осторожно перемешивают, несколько раз переворачивая пробирку. Центрифугируют смесь в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12000g. Эта стадия является особенно важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Надосадочную жидкость отбрасывают.

Осадок после центрифугирования высушивают и повторно растворяют его в 100 мм³ воды или соответствующего буфера, например буфера TE (A.1.2.5.28). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

A.1.2.8 Перечень примеров

См. таблицу A.1.

A.1.2.9 Эффективность применения метода

Данные по эффективности применения, приведенные в таблице A.2, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии" Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [6].

При проведении этого исследования два образца дали ложноположительные результаты, вызванные, возможно, недостатками упаковки. Для данного исследования мутанолизин не использовался.

A.1.3. Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур йогурта

A.1.3.1 Общие положения

Настоящий метод описывает процедуру экстрагирования основной массы ДНК из заквасочных культур, используемых для ферментации йогурта из молочных продуктов. Эта методика успешно применяется для обычных йогуртов, включая йогурты, содержащие различные ингредиенты, такие как фрукты, добавки и стабилизаторы, а также для продуктов с различным содержанием жира (см. A.1.3.8 и [9] - [11]). Из йогуртов, подвергнутых термической обработке [12], также экстрагируется ДНК, пригодная для ПЦР.

A.1.3.2 Статус валидации

Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании (см. A.1.3.9).

A.1.3.3 Принцип метода

Этот метод основывается на способе выделения ДНК с помощью фенола/хлороформа, который адаптирован к специальному пищевому продукту. Грамположительные заквасочные культуры йогуртов концентрируются после расщепления коагулированного казеина при щелочном pH. Выделенные клетки повторно суспендируют в буферном водном растворе и обрабатывают лизоцимом (и мутанолизином) для расщепления клеточных оболочек. Лизис клеток происходит при добавлении ионного детергента, такого как додецилсульфат натрия (SDS). Белки удаляют путем обработки протеиназой-K, а затем экстрагируют смесью фенол - хлороформ и хлороформом в несколько стадий. Последней стадией является осаждение ДНК этиловым спиртом.

A.1.3.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

A.1.3.5 Реактивы

A.1.3.5.1 Изопропанол [CH₃CH(OH)CH₃].

A.1.3.5.2 Этиловый спирт, C₂H₅OH, 96%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °C.

A.1.3.5.3 Ледяная уксусная кислота, CH₃COOH.

A.1.3.5.4 Хлорид натрия, NaCl.

A.1.3.5.5 Цитрат натрия, C₆H₅Na₃O₇.

A.1.3.5.6 Соляная кислота, HCl, 37%-ная.

A.1.3.5.7 Гидроксид натрия, NaOH.

A.1.3.5.8 Изоамиловый спирт [(CH₃)₂CHCH₂CH₂(OH)].

A.1.3.5.9 Фенол, C₆H₅OH.

A.1.3.5.10 Хлороформ, CHCl₃.

A.1.3.5.11 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), C₄H₁₁NO₃.

A.1.3.5.12 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Na₂ЭДТА), C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂.

A.1.3.5.13 Додецилсульфат натрия (SDS), C₁₂H₂₅O₄SNa.

A.1.3.5.14 Лизоцим, 50000 ед./мг белка (1 ед. будет давать в минуту при 6,24 ед pH и температуре 25 °C, используя суспензию Micrococcus lysodeikticus в качестве субстрата, в 2,6 см³ реакционной смеси при оптической длине пути 1 см).

A.1.3.5.15 Сахароза, C₁₂H₂₂O₁₁.

A.1.3.5.16 Протеиназа-K, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

A.1.3.5.17 Ацетат натрия, C₂H₃O₂Na.

A.1.3.5.18 Раствор цитрата натрия, C₆H₅Na₃O₇, 400 г/дм³.

A.1.3.5.19 Раствор гидроксида натрия, NaOH, 0,4 моль/дм³

Растворяют в стерильной воде. Автоклавирование не допускается. Перед использованием готовят свежий раствор.

A.1.3.5.20 Раствор хлорида натрия/цитрата натрия (SSC 5^x, концентрированный 5-кратный основной раствор), (NaCl), 0,75 моль/дм³, (C₆H₅Na₃O₇), 0,075 моль/дм³.

Целесообразно готовить концентрированный основной раствор SSC 20^x (например, 20-кратный основной раствор, так как растворы с высокой концентрацией солей обычно более устойчивы). Разбавляют перед использованием.

A.1.3.5.21 Уравновешенный фенол

Используется фенол со значением 8,0 ед. pH и уравновешенный буфером Трис/HCl (> 7,8 ед. pH) или, например, приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

A.1.3.5.22 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (A.1.3.5.10) и одну объемную часть изоамилового спирта (A.1.3.5.8).

A.1.3.5.23 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 25 объемных частей насыщенного фенола (A.1.3.5.21) с 24 объемными частями хлороформа (A.1.3.5.10) и одной объемной частью изоамилового спирта (A.1.3.5.8).

A.1.3.5.24 Раствор мутанолизина в стерильной воде, содержащий 500 или 5000 ед./см³ мутанолизина

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегать многократного замораживания и оттаивания.

A.1.3.5.25 Раствор лизоцима в стерильной воде, содержащий 10 мг/см³ лизоцима

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегать многократного замораживания и оттаивания

A.1.3.5.26 Раствор сахарозы, C₁₂H₂₂O₁₁, 400 г/дм³.

A.1.3.5.27 Буферный раствор A, (Трис), 0,020 моль/дм³, (Na₂ЭДТА), 0,020 моль/дм³, (NaCl), 0,100 моль/дм³

Доводят значение до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.1.3.5.28 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий 1 объемную часть буферного раствора A (A.1.3.5.27) и одну объемную часть раствора сахарозы (A.1.3.5.26).

A.1.3.5.29 Раствор SDS, (SDS), 250 г/дм³.

A.1.3.5.30 Раствор протеиназы-K в стерильной воде, 20 мг/см³

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегать многократного замораживания и оттаивания.

A.1.3.5.31 Раствор этилового спирта, (C₂H₅OH), 70%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °C.

A.1.3.5.32 Раствор ацетата натрия, (C₂H₃O₂Na), 3 моль/дм³

Доводят значение pH до 5,2 ед. pH ледяной уксусной кислотой.

A.1.3.5.33 Буфер TE, (Трис), 0,010 моль/дм³, (Na₂ЭДТА), 0,001 моль/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.1.3.6 Оборудование

Применяется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

A.1.3.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 12000g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

A.1.3.6.2 Водяная баня или инкубатор.

A.1.3.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

A.1.3.6.4 Смеситель, например, .

A.1.3.7 Методика

A.1.3.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления навески анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.

При изменении размера пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

A.1.3.7.2 Методика экстракции ДНК

Йогурт хорошо встряхивают или перемешивают. Переносят 250 мм³ йогурта в пробирку вместимостью 2 см³. Добавляют 80 мм³ раствора цитрата натрия (A.1.3.5.18). Добавляют 150 мм³ раствора NaOH (A.1.3.5.19) и хорошо перемешивают. Центрифугируют при ускорении 12000g в течение 2 мин.

Осадок после центрифугирования должен иметь диаметр не более 0,7 см и занимать объем не более 100 мм³. В противном случае указанные стадии (добавление 80 мм³ раствора цитрата натрия и 150 мм³ раствора NaOH) необходимо повторить.

Отбрасывают верхний слой жира и образовавшийся верхний водный слой и осадок после центрифугирования повторно суспендируют в 500 мм³ раствора SSC 5^x (A.1.3.5.20). Центрифугируют не менее 2 мин при ускорении приблизительно 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают. Повторно суспендируют осадок после центрифугирования в 500 мм³ раствора SSC 5^x. Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении приблизительно 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают.

Осадок после центрифугирования повторно суспендируют в 500 мм³ буфера для экстрагирования/лизиса (A.1.3.5.28). Добавляют 50 мм³ раствора лизоцима (A.1.3.5.25). Инкубируют при температуре 37 °C в течение 1 ч. Если результаты неудовлетворительные, к раствору лизоцима может быть добавлено 10 ед. мутанолизина (A.1.3.5.24). Однако перед систематическим применением необходимо проверить воздействие этой добавки для соответствующего продукта.

Добавляют 25 мм³ раствора SDS (A.1.3.5.29) и 25 мм³ раствора протеиназы-K (A.1.3.5.30). Инкубируют в течение 10 мин при температуре 60 °C. Добавляют 500 мм³ смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (A.1.3.5.23) и перемешивают. Центрифугируют в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят верхнюю водную фазу в новую пробирку. Добавляют один объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (A.1.3.5.22) и перемешивают. Центрифугируют в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000g.

Переносят верхнюю фазу в новую пробирку. Добавляют 0,1 объема раствора ацетата натрия (A.1.3.5.32) и один объем изопропанола (A.1.3.5.1). Выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают. Тщательно промывают осадок после центрифугирования не менее 500 мм³ раствора этилового спирта (A.1.3.5.31). Центрифугируют смесь в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12000g. Эта стадия является очень важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказывать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Надосадочную жидкость отбрасывают.

Осадок после центрифугирования высушивают и повторно растворяют его в 100 мм³ воды или соответствующего буфера, например буфера TE (A.1.3.5.33). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

A.1.3.8 Перечень примеров

См. таблицу A.3.

A.1.3.9 Эффективность применения метода

Данные по эффективности применения методики, приведенные в таблице A.4, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии" Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [11].

При проведении этого исследования две лаборатории не выполнили проверку гибридизацией. Для данного исследования мутанолизин не использовался.

A.1.4. Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для дрожжей и/или гифомицетов, собранных с пищевых продуктов

A.1.4.1 Общие положения

Данный метод описывает одноступенчатое выделение и очистку ДНК, пригодной для ПЦР, из дрожжей, гифомицетов [13] или выделенных микробных популяций. Метод применим для выделения ДНК из генетически модифицированных микроорганизмов в продуктах очень сложного состава [14], [15]. Метод может использоваться для выделения общей ДНК из продукта [14], [15] или из микробной фракции, которая непосредственно выделена из продукта либо собрана из заквасочных культур (колонии на жидких или агаровых средах).

Примечание - Предварительное выделение микробной фракции из образца для анализа дает наиболее достоверные результаты при выделении ДНК.

Общую ДНК из продукта выделяют с помощью альтернативных методов, приведенных в приложении A. Однако эти методы не гарантируют, что достаточное количество ДНК будет выделено из всех микроорганизмов (особенно из грибов, устойчивых к лизису, или грамотрицательных бактерий). Данный метод может использоваться для выделения общей ДНК из таких продуктов, как йогурт, молоко или сыр. Однако достоверное хорошее выделение ДНК обеспечивается только для тонкоизмельченных или размолотых твердых продуктов. В силу этого перед применением метода его эффективность необходимо всегда проверять на ДНК основного исследуемого продукта.

A.1.4.2 Статус валидации

Этот метод выделения ДНК был применен и проверен [13] на представителях 25 родов грибов, представляющих 325 видов (включая дрожжи, используемые в хлебопекарном производстве или виноделии, и Penicillia spp. [16], используемые производителями голубого сыра), в форме мицелия и спор (среди которых виды, наиболее устойчивые к лизису, например Aspergillus fumigatus и Cryptococcus neoformans). Данный метод был разработан таким образом, чтобы избежать лабораторного загрязнения и загрязнения между пробами. Такое свойство метода позволяет применять его для проведения систематического выделения ДНК и в больших объемах и применения ее для ПЦР. При применении метода не было обнаружено изменений качества матрицы ДНК при качественной ПЦР после долгосрочного хранения при температуре минус 20 °C в течение по крайней мере пяти лет или вариаций между различными препаратами ДНК из одного и того же организма. Несмотря на то, что качество выделенной данным методом ДНК подходит для качественной ПЦР, она может подвергаться недостаточному расщеплению в процессе рестрикционного анализа. Однако для использования ДНК, полученной данным методом, для количественной ПЦР необходимо выполнить процедуру ее дополнительной очистки с применением другого метода, например такого, который описан в A.4.

A.1.4.3 Принцип метода

Как правило, бактерии, дрожжи или мицелий разрушаются при перемешивании с высокой скоростью в присутствии стеклянных шариков в смеси Трис - фенол - хлороформ - ЭДТА - SDS, а затем ДНК осаждается этиловым спиртом.

A.1.4.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

A.1.4.5 Реактивы

A.1.4.5.1 Этиловый спирт, C₂H₅OH, 96%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °C.

A.1.4.5.2 Ледяная уксусная кислота, CH₃COOH.

A.1.4.5.3 Серная кислота, H₂SO₄, > 90%.

A.1.4.5.4 Бикарбонат калия, KHCO₃.

A.1.4.5.5 Ацетат калия, C₂H₃O₂K.

A.1.4.5.6 Соляная кислота, HCl, 37%-ная.

A.1.4.5.7 Изоамиловый спирт [(CH₃)₂CHCH₂CH₂OH].

A.1.4.5.8 Фенол, C₆H₅OH.

A.1.4.5.9 Хлороформ, CHCl₃.

A.1.4.5.10 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), C₄H₁₁NO₃.

A.1.4.5.11 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Na₂ЭДТА), C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂.

A.1.4.5.12 Гидроксид калия, KOH.

A.1.4.5.13 Додецилсульфат натрия (SDS), C₁₂H₂₅O₄SNa.

A.1.4.5.14 Рибонуклеаза-A, выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная от дезоксирибонуклеазы, приблизительно 50 ед./мг лиофилизата.

A.1.4.5.15 Уравновешенный фенол, > 7,8 ед. pH

Используют фенол (A.1.4.5.8), приготовленный в соответствии с [5] или (по выбору) полностью уравновешенный буфером для экстрагирования (A.1.4.5.18) без SDS или в соответствии с рекомендациями изготовителя.

A.1.4.5.16 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (A.1.4.5.9) с одной объемной частью изоамилового спирта (A.1.4.5.7).

A.1.4.5.17 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают одну объемную часть насыщенного фенола (A.1.4.5.15) с одной объемной частью смеси хлороформ - изоамиловый спирт (A.1.4.5.16).

A.1.4.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса, (Трис) = 0,050 моль/дм³, (K₂ЭДТА) = 0,050 моль/дм³, (SDS) = 30 г/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.1.4.5.19 Буфер TE, (Трис) = 0,010 моль/дм³, (K₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.1.4.5.20 Раствор рибонуклеазы-A, = 10 мг/см³ лиофилизата.

Следует хранить при температуре минус 20 °C.

A.1.4.5.21 Раствор этилового спирта, C₂H₅OH, 70%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °C.

A.1.4.5.22 Раствор ацетата калия, (C₂H₃O₂K) = 3 моль/дм³

Доводят значение pH до 5,2 ед. pH ледяной уксусной кислотой. Автоклавирование не допускается. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

A.1.4.5.23 Кондиционированные стеклянные шарики

Стеклянные шарики диаметром 0,2 - 0,5 мм выдерживают в течение ночи в концентрированной серной кислоте (A.1.4.5.3). Промывают их стерильной водой, кипятят в растворе KHCO₃ (A.1.4.5.24), снова промывают стерильной водой и высушивают при температуре 80 °C в вакууме [13], [14].

A.1.4.5.24 Раствор бикарбоната калия, (KHCO₃) = 50 г/дм³

Используют свежеприготовленный водный раствор.

A.1.4.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

A.1.4.6.1 Встряхиватель для полиэтиленовых микропробирок вместимостью 2 см³ с навинчивающимися колпачками. Скорость встряхивания - не менее 100 встряхиваний/мин (например, Mini-BeadBeater^TM <1>).

--------------------------------

<1> Mini-BeadBeater - это пример коммерчески доступного оборудования Biospec products, пригодного для использования с описываемым методом. Эта информация приводится исключительно для информации пользователей настоящего стандарта и ни при каких условиях не может служить рекомендацией или одобрением конкретного типа оборудования. Допускается использование аналогичного оборудования, при условии, что оно позволяет получать такие же результаты.

A.1.4.6.2 Микропробирки, полиэтиленовые пробирки вместимостью 2 см³ с кольцевым уплотнением и навинчивающимися колпачками.

A.1.4.6.3 Устройство для фильтрования, фильтры из стекловолокна диаметром 25 мм.

A.1.4.6.4 Центрифуга с ускорением как минимум 10000 g, с ротором, способным удерживать микропробирки вместимостью 2 см³.

На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

A.1.4.6.5 Водяная баня или инкубатор.

A.1.4.6.6 Вакуумная сушилка (при необходимости). Рекомендуется для приготовления стеклянных шариков (A.1.4.5.23).

A.1.4.6.7 Смеситель, например, .

A.1.4.7 Методика

A.1.4.7.1 Приготовление анализируемой пробы и микробной фракции

Методы выделения микробных фракций, использующие этап обогащения, могут быть приведены в нормативных правовых актах по микробиологическому контролю пищевой продукции. Микробная фракция, полученная после этапа обогащения, может быть использована для выделения ДНК.

Исходя из анализируемой пробы объемом 1 - 2 см³ выделяют микробиологическую популяцию соответствующим образом (см. A.1.3). В качестве альтернативы дрожжи или гифомицеты, выделенные из навески образца, могут культивироваться как заквасочные культуры. В обоих случаях микроорганизмы собираются и подвергаются дальнейшей обработке в соответствии с A.1.4.7.2 или хранятся при температуре минус 20 °C до начала обработки.

A.1.4.7.2 Выделение ДНК

A.1.4.7.2.1 Мицелий, собранный на фильтре из стекловолокна, дважды промывают буфером для экстрагирования/лизиса (A.1.4.5.18), не содержащим SDS. Мицелиальную пленку снимают с фильтра и переносят ее в микропробирку вместимостью 2 см³ с навинчивающимся колпачком (A.1.4.6.2), содержащую 600 мм³ буфера для экстрагирования/лизиса (A.1.4.5.18) и 600 мм³ смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (A.1.4.5.17) и наполовину заполненную кондиционированными стеклянными шариками (A.1.4.5.23). Дальнейшая обработка описана в A.1.4.7.2.3.

A.1.4.7.2.2 С осадками после центрифугирования либо общей микробной популяции, бактерий, мицелия, дрожжей, либо дрожжеподобных микроорганизмов необходимо выполнить следующие процедуры. Клетки промывают один раз 1 см³ буфера для экстрагирования/лизиса (A.1.4.5.18), не содержащего SDS, центрифугируют при ускорении от 10000g до 13000g в течение 10 мин, повторяют по меньшей мере еще один раз, затем повторно растворяют в 600 мм³ буфера для экстрагирования/лизиса (A.1.4.5.18) и переносят в микропробирку, содержащую стеклянные шарики и смесь фенол-хлороформ, как указано в A.1.4.7.2.1.

A.1.4.7.2.3 После стадии A.1.4.7.2.1 или A.1.4.7.2.2 содержимое микропробирки перемешивают на встряхивателе (A.1.4.6.1) со скоростью не менее 100 встряхиваний/мин в течение 1 - 2 мин, затем немедленно инкубируют при температуре 65 °C в течение от 30 до 120 мин. Центрифугируют при ускорении от 10000 до 13000 g в течение 10 мин. Переносят образовавшийся верхний слой в новую микропробирку.

В случае применения ДНК для дальнейшей количественной ПЦР необходимо выполнить следующие процедуры. После 30 мин инкубирования содержимое микропробирки центрифугируют при ускорении от 10000g до 13000g в течение 15 мин. Переносят образовавшийся верхний слой в новую микропробирку. Добавляют рибонуклеазу-A (A.1.4.5.20) до конечной массовой концентрации 0,001 мг/см³ и инкубируют еще в течение 30 - 90 мин при температуре 65 °C.

Добавляют раствор ацетата калия (A.1.4.5.22) до конечной молярной концентрации 0,3 моль/дм³. Перемешивают, добавляют 1,2 см³ этилового спирта (A.1.4.5.1) и инкубируют в течение ночи при температуре минус 20 °C или в течение 1 ч при температуре минус 80 °C. ДНК осаждают центрифугированием при ускорении от 10000g до 13000g в течение 15 мин при температуре минус 4 °C.

После центрифугирования осадок ДНК осторожно промывают раствором этилового спирта (A.1.4.5.21). Сливают образовавшийся сверху слой на бумагу и высушивают содержимое микропробирки в вакууме. ДНК растворяют в 50 - 100 мм³ воды. Допускается длительное (до пяти лет) хранение при температуре минус 20 °C. На основании проведенных проверок [13] допускается использование воды вместо буфера TE (A.1.4.5.19). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

A.1.4.8 Перечень примеров

Количество исследованных видов/штаммов указывается в скобках:

Absidia corymbifera (1), Acremonium spp. (2), Aspergillus spp. (119), Candida spp. (7), Cladosporium spp. (2), Cryptococcus spp. (6), Epidermophyton floccosum (1), Fusarium solani (1), Malbranchea pulchella (1), Geotrichum spp. (2), Microsporum canis (1), Paecilomyces spp. (2), Penicillium spp. (20), Pityrosporum ovale (1), Rhizopus spp. (2), Saccharomyces cerevisiae (1), Schizosaccharomyces pombe (1), Scopu-lariopsis brevicaulis (1), Trichoderma spp. (124), Trichophyton spp. (2), Trichosporon spp. (2), Ulocladium botrytis (1), Verticillium tenerum (1).

A.1.4.9 Эффективность применения метода

Эффективность метода проверялась в отношении грибов [13]. При количественном анализе эффективности выделения было установлено, что использование дробления с помощью стеклянных шариков было наиболее эффективным [18].

A.2. Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе поливинилпирролидона (ПВП)

A.2.1. Основной метод на основе ПВП

A.2.1.1 Общие положения

Этот простой, быстрый и дешевый метод [19] пригоден для большой группы продуктов, особенно содержащих большие количества полифенольных соединений.

A.2.1.2 Статус валидации

Этот метод был проверен путем внутрилабораторных исследований и применяется для систематического выделения ДНК во многих лабораториях. Данный метод еще не оценивался путем официальных межлабораторных исследований.

A.2.1.3 Принцип

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и высокой концентрации ЭДТА) и последующее удаление из водной фазы, содержащей ДНК, загрязняющих примесей, например полифенольных молекул, полисахаридов, метаболитов и растворимых белков, с помощью ПВП в комбинации с ацетатом аммония. Последним этапом является осаждение ДНК этанолом, что концентрирует ДНК и очищает ее от солей (см. [19] - [23]).

A.2.1.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

A.2.1.5 Реактивы

A.2.1.5.1 Этиловый спирт, C₂H₅OH, 96%-ный.

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °C.

A.2.1.5.2 Изопропанол, CH₃CHOHCH₃.

A.2.1.5.3 Поливинилпирролидон (ПВП), молекулярная масса M = 360 кДа; характеристическая вязкость (значение K) = 80 - 100 <1>.

--------------------------------

<1> SIGMA P-5288 - пример подходящего реактива, имеющегося в продаже. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательность его применения. Могут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.

A.2.1.5.4 Ледяная уксусная кислота, CH₃COOH.

A.2.1.5.5 Соляная кислота, HCl, 37%-ная.

A.2.1.5.6 Хлорид натрия, NaCl.

A.2.1.5.7 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), C₄H₁₁NO₃.

A.2.1.5.8 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Na₂ЭДТА), C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂.

A.2.1.5.9 Додецилсульфат натрия (SDS), C₁₂H₂₅O₄SNa.

A.2.1.5.10 Ацетат аммония, C₂H₃O₂NH₄.

A.2.1.5.11 Раствор этилового спирта, C₂H₅OH, 70%-ный.

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °C.

A.2.1.5.12 Буфер для экстрагирования, pH = 8,0 ед., (Трис) = 0,2 моль/дм³, (NaCl) = 0,250 моль/дм³, (Na₂ЭДТА) = 0,025 моль/дм³, (SDS) = 50 г/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.2.1.5.13 Раствор ацетата аммония, (NH₄C₂H₃O₂) = 7,5 моль/дм³.

Растворяют в стерильной воде. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

A.2.1.5.14 Буфер TE, (Трис) = 0,010 моль/дм³, (Na₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.2.1.6 Оборудование

Необходимо использовать обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

A.2.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение 10000 g.

На некоторых этапах необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

A.2.1.6.2 Водяная баня или инкубатор.

A.2.1.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

A.2.1.6.4 Сублимационная сушилка (при необходимости).

A.2.1.6.5 Смеситель, например .

A.2.1.7 Методика

A.2.1.7.1 Сразу после приготовления навески образца из исследуемого продукта (матрицы) необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера навески образца требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

A.2.1.7.2 Методика выделения ДНК

Взвешивают 0,25 г измельченного или жидкого материала в пробирке. Добавляют 1 см³ буфера для экстрагирования (A.2.1.5.12). Перемешивают суспензию при температуре 65 °C в течение 1 ч, охлаждают до комнатной температуры. Последовательно смешивают суспензию с 60 мг порошка ПВП (A.2.1.5.3) и 0,5 объема раствора ацетата аммония (A.2.1.5.13). Инкубируют на льду в течение 30 мин.

Центрифугируют при ускорении 10000g в течение 10 мин и переносят надосадочную жидкость в чистую пробирку. Смешивают верхний слой с одним объемом изопропанола (A.2.1.5.2) и инкубируют при температуре минус 20 °C в течение 30 мин. Центрифугируют при ускорении 10000g и температуре 4 °C в течение 10 мин и надосадочную жидкость осторожно отбрасывают.

Промывают осадок ДНК в пробирке после центрифугирования двумя объемами раствора этилового спирта (A.2.1.5.11). Этот этап является важным для удаления любых солей, которые могут оказывать влияние на последующий анализ (например, ПЦР). Надосадочную жидкость осторожно отбрасывают (в случае рыхлого осадка центрифугируют при ускорении 10000g и температуре 4 °C в течение 10 мин). Осадок высушивают и повторно растворяют его в 100 мм³ воды или соответствующего буфера, например буфера TE (A.2.1.5.14). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

A.2.1.8 Перечень примеров

Метод был успешно применен для выделения ДНК <1> из следующих продуктов: детское печенье <1>, детское молоко <1>, бельгийский паштет, панировка (пшеничная или кукурузная) рыбных палочек, шоколадное пирожное с орехами <1>, консервированная кукуруза, брикетированный зерновой концентрат <1>, сырный крокет, нугат с курицей, курица, печенье, глазированное шоколадом <1>, шоколадная паста <1>, кукурузные хлопья <1>, хрустящие овощи, десертный крем <1>, композиции для вскармливания детей, кукурузное печенье <1>, кукурузная мука, мясо свежее и подвергнутое тепловой обработке (говядина, свинина, курица и индейка), рубленое мясо, мюсли <1>, воздушная кукуруза, сухое молоко, колбаса (реализуемая в ломтиках <1> и коктейльные сосиски <1>), шницель, побеги сои <1>, суповые шарики, соевый белок в мясных препаратах <1>, соевый лецитин <1>, соевые напитки <1>, соевый крем, соус для спагетти <1>, фигурное печенье, соевый творог, вегетарианский рубленый шницель, вафли с шоколадом <1>, вафли <1>, йогурт <1>.

--------------------------------

<1> Повторяемость может зависеть от партии продукта и/или технологии его получения. В некоторых случаях ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказываются ниже предела обнаружения метода, независимо от используемых праймеров и/или протоколов ПЦР. Это может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.

A.3. Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе ЦТАБ

A.3.1. Основной метод на основе ЦТАБ

A.3.1.1 Общие положения

Этот метод применим для экстракции ДНК из растений и из продуктов, полученных из растений, так как он позволяет удалять полисахариды и полифенольные соединения, которые могут оказывать негативное влияние на качество выделяемой ДНК. Метод также пригоден и для некоторых других продуктов (см. A.3.1.8).

A.3.1.2 Статус валидации

Этот метод был проверен путем кольцевого тестирования (см. A.3.1.9).

Этот метод широко используется во многих лабораториях для систематического выделения ДНК.

A.3.1.3 Принцип

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии ЦТАБ) и следующие за ней несколько стадий для удаления загрязняющих примесей, например полисахаридов и белков [24].

Для некоторых продуктов рекомендуется использовать различные ферменты, как указано в A.3.1.7. добавляется к буферу для лизиса, чтобы разрушить крахмал в случае продуктов, содержащих амилозу. Для большинства продуктов необходима обработка образцов протеиназой-K для удаления белков. Как правило, рекомендуется обработка рибонуклеазой тех продуктов, для которых соосаждение рибонуклеиновой кислоты может создавать трудности для последующего анализа.

Концентрация солей во время проведения стадий выделения - важный параметр для удаления загрязняющих примесей. В случае понижения концентрации солей ниже 0,5 моль/дм³ при комнатной температуре и/или снижения температуры ниже 16 °C будет образовываться осадок - ЦТАБ-нуклеиновая кислота. Очистки от денатурированных белков и полисахаридов, образующих комплексные соединения с ЦТАБ, можно добиться повышением концентрации солей (например, путем добавления хлорида натрия), в то время как нуклеиновые кислоты становятся при этом растворимыми. Для дальнейшей очистки нуклеиновых кислот от ЦТАБ и комплексов полисахарид/белок используется хлороформ.

Окончательно нуклеиновые кислоты очищают путем осаждения изопропанолом и промывки этиловым спиртом.

A.3.1.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

A.3.1.5 Реактивы

A.3.1.5.1 (при необходимости) типа IIa, из видов Bacillus, 1500 - 3000 ед./мг белка.

A.3.1.5.2 Хлороформ, CHCl₃.

A.3.1.5.3 Этиловый спирт, C₂H₅OH, 96%-ный.

A.3.1.5.4 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Na₂ЭДТА), C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂.

A.3.1.5.5 Гексадецилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ), C₁₉H₄₂BrN.

A.3.1.5.6 Соляная кислота, HCl, 37%-ная.

A.3.1.5.7 Изопропанол [CH₃CH(OH)CH₃].

A.3.1.5.8 Протеиназа-K (при необходимости), приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

A.3.1.5.9 Рибонуклеаза-A, выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная от дезоксирибонуклеазы (при необходимости), приблизительно 50 ед./мг лиофилизата.

A.3.1.5.10 Хлорид натрия, NaCl.

A.3.1.5.11 Гидроксид натрия, NaOH.

A.3.1.5.12 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), C₄H₁₁NO₃.

A.3.1.5.13 Раствор (при необходимости), массовой концентрации 10 мг/см³.

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегая многократного замораживания и оттаивания.

A.3.1.5.14 Буфер ЦТАБ для экстрагирования, (ЦТАБ) = 20 г/дм³, (NaCl) = 1,4 моль/дм³, (Трис) = 0,1 моль/дм³, (Na₂ЭДТА) = 0,02 моль/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.3.1.5.15 Буфер ЦТАБ для осаждения, (ЦТАБ) = 5 г/дм³, (NaCl) = 0,04 моль/дм³.

A.3.1.5.16 Раствор хлорида натрия, (NaCl) молярной концентрации 1,2 моль/дм³.

A.3.1.5.17 Раствор этилового спирта, C₂H₅OH, 70%-ный.

A.3.1.5.18 Раствор протеиназы-K в стерильной воде (при необходимости), концентрации 20 мг/см³.

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегая многократного замораживания и оттаивания.

A.3.1.5.19 Раствор рибонуклеазы-A (при необходимости), массовой концентрации 10 мг/см³.

Следует хранить в виде аликвот при температуре минус 20 °C.

A.3.1.5.20 Буфер TE, (Трис) = 0,01 моль/дм³, c (Na₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.3.1.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

A.3.1.6.1 Инкубатор, желательно с устройством для встряхивания (шейкер-инкубатор).

A.3.1.6.2 Центрифуга, например микроцентрифуга, обеспечивающая ускорение 12000g.

На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

A.3.1.6.3 Смеситель, например .

A.3.1.6.4 Вакуумная сушилка (при необходимости).

A.3.1.7 Методика

A.3.1.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления навески образца из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.

При изменении размера навески анализируемой пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

A.3.1.7.2 Экстракция ДНК из анализируемой пробы

Взвешивают 200 - 300 мг соответствующим образом приготовленного материала в пробирке.

Добавляют 1,5 см³ предварительно нагретого до 65 °C буфера ЦТАБ для экстрагирования (A.3.1.5.14) и перемешивают (в некоторых случаях может потребоваться большее количество буфера для растворения продукта). Добавляют 10 мм³ раствора (A.3.1.5.13, при необходимости), 10 мм³ раствора рибонуклеазы-A (A.3.1.5.19, при необходимости) и осторожно перемешивают. Инкубируют в течение 30 мин при температуре 65 °C при перемешивании. Добавляют 10 мм³ раствора протеиназы-K (A.3.1.5.18, при необходимости), аккуратно перемешивают содержимое пробирки и инкубируют в течение 30 мин при температуре 65 °C при перемешивании (при необходимости). Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят надосадочную жидкость в новую пробирку, добавляют от 0,7 до одного объема хлороформа (A.3.1.5.2) и тщательно перемешивают. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят верхнюю (водную) фазу в новую пробирку.

A.3.1.7.3 ЦТАБ-осаждение

Добавляют два объема буфера ЦТАБ для осаждения (A.3.1.5.15). Инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре без перемешивания. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают. Растворяют осажденную ДНК 350 мм³ раствора NaCl (A.3.1.5.16). Добавляют 350 мм³ хлороформа (A.3.1.5.2) и тщательно перемешивают. Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 12000g. Переносят водную фазу в новую пробирку.

Примечание - ЦТАБ-осаждение является необходимым не для всех продуктов, а только для тех, которые обогащены белками и полисахаридами. При обеспечении получения эквивалентных результатов возможна очистка ДНК альтернативным методом в твердой фазе (например, при использовании вращающихся колонок).

A.3.1.7.4 Осаждение ДНК

Добавляют 0,6 объема изопропанола (A.3.1.5.7), осторожно перемешивают путем переворачивания пробирки и выдерживают ее при комнатной температуре в течение 20 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают. Добавляют 500 мм³ раствора этилового спирта (A.3.1.5.17) в пробирку и ее содержимое перемешивают, переворачивая несколько раз. Эта стадия является важной для обеспечения полного удаления ЦТАБ. Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок ДНК в пробирке после центрифугирования высушивают и повторно растворяют его в 100 мм³ воды или соответствующего буфера, например буфера TE (A.3.1.5.20). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

A.3.1.8 Перечень примеров

Метод был успешно применен для выделения ДНК из следующих продуктов: порошкообразные продукты детского питания, продукты детского питания, смеси для хлебопекарного производства, сухое печенье, бульонные кубики <1>, сладкие и кислые конфеты, консервированная кукуруза, крем-брюле <1>, кормовой жмых, зерно хлебных злаков (рис, пшеница, овес, рожь, гречиха, просо), плиточный шоколад <1>, шоколадный крем <1>, шоколадные конфеты <1>, печенье, глазированное шоколадом <1>, печенье, кукурузное пиво <1>, кукурузные хлопья <1>, десертный крем, декстроза <1>, начинка массы пралине, мелкие мучные кондитерские изделия, рыба <1>, рыбные палочки <1>, хлопья из цельной сои, замороженный картофель, жаренный кусочками, подливка из сока жареного мяса <1>, вареный окорок, мед <1>, кормовая мука быстрого приготовления, кукурузные початки, кукурузная мука, зародыши кукурузы <1>, кукурузный глютеновый корм, листья кукурузы, кукурузный нативный крахмал <1>, кукурузное масло (нативное) <1>, белки из кукурузы <1>, семена/зерна кукурузы, крупка из кукурузы, маргарин <1>, свежее мясо, сухое молоко, молоко, комбикорм для домашних животных, мюсли <1>, семена золотистой фасоли (маш), листья горчицы, воздушная кукуруза (необработанная), хрустящий картофель, картофельный крахмал (нативный), клубни картофеля, листья рапса, рапсовый жмых, рапсовое масло (нерафинированное/нативное) <1>, семена рапса, необработанный соевый лецитин <1>, кормовая мука, готовая к употреблению, салями (с высоким содержанием жира), соленый сухой завтрак (из зерен кукурузы), колбасы, приправы <1>, модифицированные крахмалы (некоторые типы) <1>, сквашенные сливки с луком <1>, соевая мука, зародыши сои (консервированные, замороженные), соевый белок <1>, соевые напитки <1>, семена/зерна сои, соевый творог, соя (подкисленная) <1>, листья сахарной свеклы, семена сахарной свеклы, семена подсолнечника, рыбный фарш с соей <1>, сахарная кукуруза, оболочка тако (мексиканский пирожок), тарамас (паста из икры рыб), табак, томатный кетчуп <1>, томатный концентрат <1>, томаты (плоды), кукурузные чипсы <1>, вегетарианский рубленый шницель, вафли <1>, пшеничный крахмал (нативный), йогурт <1>.

--------------------------------

<1> Повторяемость может зависеть от партии продукта и/или технологии его получения. В некоторых случаях ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказываются ниже предела обнаружения метода независимо от используемых праймеров и/или протоколов ПЦР. Это может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.

A.3.1.9 Эффективность применения метода

Данные по эффективности применения метода, приведенные в таблице A.5, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии" Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах (см. [25] - [27]). В качестве испытуемых матриц использовались картофель, соя и томаты.

При проведении межлабораторных испытаний масса образца составляла 100 мг. Стадия ЦТАБ-осаждения была необходима для анализа сои и соевой муки. Стадии с использованием ферментов в этих межлабораторных испытаниях не проводились.

При проведении совместных исследований сои две из участвующих лабораторий использовали сильно измененные методики, а в одной лаборатории испытание пяти образцов было прервано. Таким образом, 22 из 25 участников правильно идентифицировали все 110 проб.

При проведении межлабораторных испытаний картофеля три образца дали ложноотрицательные результаты, а один образец дал ложноположительный результат. Три образца не были оценены из-за получения неоднозначных результатов двух повторных анализов.

A.4. Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе диоксида кремния

A.4.1. Основной метод на основе диоксида кремния

A.4.1.1 Общие положения

Настоящий метод пригоден для экстракции ДНК из большой группы продуктов (см. примеры в A.4.1.8). Этот метод также может применяться как метод дополнительной очистки растворов ДНК, полученных после выделения ДНК другими методами.

Метод адаптирован к опубликованной процедуре [28]. В случае пригодности метода к ДНК какого-либо продукта он имеет определенные преимущества, состоящие в том, что позволяет избегать использования очень токсичных реактивов. Кроме того, по причине отсутствия неустойчивых поверхностей раздела фаз (например, вода - хлороформ) и необходимости центрифугирования с низкой скоростью метод может быть легко адаптирован для выполнения ручных анализов высокой производительности и их автоматизации.

Настоящий метод не рекомендуется для выделения ДНК из продуктов с высоким содержанием жира.

A.4.1.2 Статус валидации

Этот метод прошел внутрилабораторную проверку и используется для систематических анализов во многих лабораториях. Метод не подвергался оценке путем официальных межлабораторных исследований. Принцип этого метода положен в основу множества созданных наборов и тест-систем для экстракции ДНК (см. [29] - [31]).

A.4.1.3 Принцип

Метод состоит из стадии лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия в буферном растворе) и последующей стадии очистки с помощью смол из диоксида кремния в присутствии разобщающего агента, вызывающего диссоциацию комплексов, гуанидина гидрохлорида. Принцип метода состоит в связывании нуклеиновых кислот диоксидом кремния при низкой водной активности в результате энтропийного эффекта [32]. Загрязняющие примеси вымывают из смолы изопропанолом, в то время как ДНК остается прикрепленной к адсорбенту. Во время заключительной стадии элюирования буферным раствором с низким содержанием соли извлекается ДНК.

A.4.1.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

A.4.1.5 Реактивы

A.4.1.5.1 Хлорид натрия, NaCl.

A.4.1.5.2 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), C₄H₁₁NO₃.

A.4.1.5.3 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Na₂ЭДТА), C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂.

A.4.1.5.4 Соляная кислота, HCl, 37%-ная.

A.4.1.5.5 Гидроксид натрия, NaOH.

A.4.1.5.6 Додецилсульфат натрия (SDS), C₁₂H₂₅O₄SNa.

A.4.1.5.7 Протеиназа-K, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

A.4.1.5.8 Гуанидин гидрохлорид, CH₅N_3-HCl.

A.4.1.5.9 Хлорид калия, KCl.

A.4.1.5.10 Гидроортофосфат натрия, Na₂HPO₄.

A.4.1.5.11 Дигидроортофосфат калия, KH₂PO₄.

A.4.1.5.12 Изопропанол [CH₃CH(OH)CH₃].

A.4.1.5.13 Диоксид кремния (SiO₂), диоксид кремния с гранулометрическим составом от 0,5 до 10 мкм (80% частиц от 1 до 5 мкм) <1>.

--------------------------------

<1> SIGMA S-5631 - пример подходящего коммерческого реактива. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное использование только этого реактива. Могут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.

A.4.1.5.14 Рибонуклеаза-A, свободная от дезоксирибонуклеазы, приблизительно 100 ед./мг лиофилизата.

A.4.1.5.15 Раствор протеиназы-K, концентрацией 20 мг/см³

Растворяют фермент в стерильной воде или буфере, как описано в [34]. Автоклавирование раствора не допускается. Хранить в виде аликвот при температуре минус 20 °C, избегать многократного замораживания и оттаивания.

A.4.1.5.16 Раствор I гуанидина гидрохлорида, (CH₅N_3-HCl) = 5 моль/дм³

Автоклавируют не более 15 мин при температуре 121 °C.

A.4.1.5.17 Раствор II гуанидина гидрохлорида, (CH₅N_3-HCl) = 6 моль/дм³.

Автоклавируют не более 15 мин при температуре 121 °C.

A.4.1.5.18 Буферный раствор PBS, (NaCl) = 0,157 моль/дм³, (KCl) = 0,0027 моль/дм³, (Na₂HPO₄) = 0,010 моль/дм³, (KH₂PO₄) = 0,0018 моль/дм³

Доводят значение pH до 7,5 ед. pH, используя HCl.

A.4.1.5.19 Суспензия диоксида кремния

Взвешивают 5 г диоксида кремния (A.4.1.5.13) в пробирке вместимостью 50 см³ и добавляют 50 см³ буфера PBS (A.4.1.5.18). Хорошо перемешивают и оставляют для осаждения на 2 ч. Надосадочную жидкость удаляют путем отсасывания с помощью пипетки. Добавляют еще 50 см³ буфера PBS, хорошо перемешивают и оставляют для осаждения на 2 ч. Образовавшуюся надосадочную жидкость удаляют. Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении 2000 g. Надосадочную жидкость отбрасывают. После центрифугирования повторно растворяют осадок в пробирке 50 см³ раствора II гуанидина гидрохлорида (A.4.1.5.17). Используют в течение 2 - 5 мес. Хорошо перемешивают перед использованием.

A.4.1.5.20 Буфер для экстрагирования TNE-SDS, (NaCl) = 0,150 моль/дм³, (Трис) = 0,002 моль/дм³, (Na₂ЭДТА) = 0,002 моль/дм³, (SDS) = 10 г/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH, и автоклавируют перед добавлением SDS.

A.4.1.5.21 Раствор изопропанола [CH₃CH(OH)CH₃], 80%-ный.

A.4.1.5.22 Буферный раствор TE, (Трис) = 0,010 моль/дм³, (Na₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.4.1.5.23 Раствор рибонуклеазы-A массовой концентрации 10 мг/см³

Следует хранить в виде аликвот при температуре минус 20 °C, избегая многократного замораживания и оттаивания.

A.4.1.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

A.4.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 2000g.

На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

A.4.1.6.2 Инкубатор с рабочей температурой 60 °C.

A.4.1.6.3 Встряхиватель, который должен помещаться внутри инкубатора (шейкер-инкубатор).

A.4.1.6.4 Смеситель, например, .

A.4.1.6.5 Пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см³ для приготовления суспензии диоксида кремния.

A.4.1.7 Методика

A.4.1.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.

При изменении размера навески пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

A.4.1.7.2 Методика выделения ДНК

Взвешивают 200 - 300 мг размолотого или измельченного материала в пробирке. Добавляют 2 см³ буфера для экстрагирования (A.4.1.5.20) и 20 мм³ раствора протеиназы-K (A.4.1.5.15). Инкубируют в течение 1 - 5 ч при температуре 60 °C. Во время инкубирования образцы необходимо интенсивно встряхивать (приблизительно 250 встряхиваний в мин). Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 2000g. Переносят 550 мм³ образовавшегося верхнего слоя в новую пробирку.

Надосадочную жидкость обрабатывают 2 мм³ раствора рибонуклеазы (A.4.1.5.23) в течение 5 мин при температуре 37 °C (стадию гидролиза РНК рекомендуется проводить перед стадией связывания диоксидом кремния, в противном случае гидролизованная РНК и полученные в результате нуклеотиды могут оказывать влияние на последующие измерения на ультрафиолетовом спектрометре). Добавляют 55 мм³ раствора I гуанидина гидрохлорида (A.4.1.5.16) и 100 мм³ суспензии диоксида кремния (A.4.1.5.19). Осторожно перемешивают несколько раз. Пробирки оставляют на лабораторном столе приблизительно на 1 мин.

Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении приблизительно 800g. Надосадочную жидкость отбрасывают и добавляют 500 мм³ раствора изопропанола (A.4.1.21). Пробирки закрывают и перемешивают, желательно с помощью смесителя (A.4.1.6.4), для повторного полного растворения осадка после центрифугирования.

Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении приблизительно 1500g. Надосадочную жидкость отбрасывают и осадок после центрифугирования высушивают. Добавляют 100 мм³ буферного раствора TE (A.4.1.5.22). Осторожно перемешивают для повторного растворения осадка после центрифугирования. Инкубируют при температуре 60 °C в течение 5 мин. Центрифугируют в течение 5 мин при ускорении 2000g. Переносят 80% образовавшегося верхнего слоя в новую пробирку. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не перенести частицы диоксида кремния, которые оказывают ингибирующее воздействие на ферменты (например, ДНК-полимеразы, эндонуклеазы).

Перенесенный слой обрабатывают 2 мм³ раствора рибонуклеазы (A.4.1.5.23) в течение 1 ч при температуре 37 °C или в течение всей ночи при комнатной температуре. Этот раствор является основным раствором ДНК.

A.4.1.8 Перечень примеров

Метод был успешно применен для экстрагирования ДНК <1> из следующих продуктов: зародыши кукурузы <1>, кукурузная мука, кукурузный глютеновый корм <1>, листья кукурузы, модифицированный кукурузный крахмал <1>, нативный кукурузный крахмал <1>, семена кукурузы, кукурузная крупка, белок из сои <1>, соя, листья сои, сахарная свекла (свежие корнеплоды), сахарная свекла (замороженный жом), листья сахарной свеклы.

--------------------------------

<1> Повторяемость может зависеть от партии продукта и/или технологии его получения. В некоторых случаях ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказываются ниже предела обнаружения метода независимо от используемых праймеров и/или протоколов ПЦР. Это может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.

A.5. Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе гуанидина-хлороформа

A.5.1. Основной метод на основе гуанидина-хлороформа

A.5.1.1 Общие положения

Данный метод пригоден для экстрагирования ДНК из большой группы пищевых продуктов и кормов (см. A.5.1.8). В зависимости от состава пробы в некоторых случаях может потребоваться стадия дополнительной очистки.

A.5.1.2 Статус валидации

Этот метод был проверен с применением процедуры внутрилабораторной проверки.

A.5.1.3 Принцип

Метод заключается в термическом и ферментативном лизисе в присутствии додецилсульфата натрия в денатурирующем буферном растворе гуанидина. В некоторых случаях в зависимости от продукта необходим дополнительный этап очистки.

Загрязняющие примеси, например липиды и белки, удаляются на стадии экстрагирования хлороформом после лизиса. Следующим этапом является осаждение ДНК изопропанолом.

A.5.1.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

A.5.1.5 Реактивы

A.5.1.5.1 типа IIa, из видов Bacillus, 1500 - 5000 ед./мг лиофилизата.

A.5.1.5.2 Ледяная уксусная кислота, CH₃COOH.

A.5.1.5.3 Хлороформ, CHCl₃.

A.5.1.5.4 Этиловый спирт (C₂H₅OH), 96%-ный.

A.5.1.5.5 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Na₂ЭДТА), C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂.

A.5.1.5.6 Гуанидин гидрохлорид, (CH₅N_3-HCl).

A.5.1.5.7 Соляная кислота, HCl, 37%-ная.

A.5.1.5.8 Изопропанол [CH₃CH(OH)CH₃].

A.5.1.5.9 Протеиназа-K, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

A.5.1.5.10 Рибонуклеаза-A, выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная от дезоксирибонуклеазы, приблизительно 50000 ед./мг лиофилизата.

A.5.1.5.11 Хлорид натрия, NaCl.

A.5.1.5.12 Додецилсульфат натрия (SDS), C₁₂H₂₅O₄SNa.

A.5.1.5.13 Гидроксид натрия, NaOH.

A.5.1.5.14 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), C₄H₁₁NO₃.

A.5.1.5.15 Раствор в стерильной воде, концентрацией 10 мг/см³

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегать многократного замораживания и оттаивания.

A.5.1.5.16 Раствор этилового спирта, C₂H₅OH, 70%-ный.

A.5.1.5.17 Буфер для экстрагирования, (Трис) = 0,1 моль/дм³, (NaCl) = 0,15 моль/дм³, (Na₂ЭДТА) = 0,05 моль/дм³, (SDS) = 10 г/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.5.1.5.18 Раствор гуанидина гидрохлорида (CH₅N_3-HCl) молярной концентрации 5 моль/дм³

После приготовления раствор автоклавируют (не более 15 мин при температуре 121 °C).

A.5.1.5.19 Раствор протеиназы-K в стерильной воде, массовой концентрации 20 мг/см³

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °C, избегая многократного замораживания и оттаивания.

A.5.1.5.20 Раствор рибонуклеазы-A массовой концентрации 10 мг/см³

Следует хранить в виде аликвот при температуре минус 20 °C.

A.5.1.5.21 Буфер TE, (Трис) = 0,01 моль/дм³, (Na₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH.

A.5.1.6 Оборудование

A.5.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение 8000g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

A.5.1.6.2 Инкубатор, желательно с устройством для встряхивания (шейкер-инкубатор).

A.5.1.6.3 Смеситель, например, .

A.5.1.7 Методика

A.5.1.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления навески анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.

При изменении размера навески образца требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

A.5.1.7.2 Методика экстракции ДНК

Взвешивают 200 - 500 мг измельченного материала в микропробирке. Добавляют 1,6 см³ предварительно нагретого до температуры 60 °C буфера для экстрагирования (A.5.1.5.17).

Добавляют 10 мм³ раствора рибонуклеазы-A (A.5.1.5.20) и 10 мм³ раствора (A.5.1.5.15) и осторожно перемешивают, переворачивая пробирку вручную. Инкубировать в течение 50 мин при температуре 60 °C при умеренном перемешивании. Добавляют 1/10 объема раствора гуанидина гидрохлорида (A.5.1.5.18), тщательно перемешивают с помощью смесителя (A.5.1.6.3).

Добавляют 20 мм³ раствора протеиназы-K (A.5.1.5.19), плавно перемешивают, переворачивая пробирку вручную, и инкубируют не менее 2 ч при температуре 60 °C при умеренном перемешивании. Пробирки оставляют на лабораторном столе на 15 мин, затем центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 8000g.

Переносят надосадочную жидкость в новую пробирку. Добавляют один объем хлороформа (A.5.1.5.3) и перемешивают с помощью смесителя (A.5.1.6.3). Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 8000g. Переносят надосадочную жидкость в новую пробирку. Добавляют 0,6 объема изопропанола (A.5.1.5.8), перемешивают путем переворачивания. Пробирки оставляют на льду на 50 мин.

Центрифугируют в течение 20 мин при ускорении 8000g. Осадок после центрифугирования промывают не менее чем 2 см³ раствора этилового спирта (A.5.1.5.16) и центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 8000g. Эта стадия является важной для удаления любых солей, которые могут оказывать влияние на последующий анализ (например, ПЦР). Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после центрифугирования высушивают и повторно растворяют в 100 мм³ воды или соответствующего буфера, например буфера TE (A.5.1.5.21). Этот раствор является основным раствором ДНК. Если потребуется дополнительная стадия очистки, то ее необходимо выполнять на основном растворе ДНК.

A.5.1.8 Перечень примеров

Метод был успешно применен для экстрагирования ДНК <1> из следующих продуктов: подкисленная соя, консервированная кукуруза, кормовой жмых, плиточный шоколад <1>, десертный крем <1>, хлопья из цельной сои, початки кукурузы, кукурузная мука, зародыши кукурузы <1>, кукурузный глютеновый корм <1>, модифицированный кукурузный крахмал <1>, белки из кукурузы <1>, семена/зерна кукурузы, кукурузная крупка, нативный кукурузный крахмал <1>, семена/зерна рапса, соусы <1>, мука из сои, соевый творог, соевый лецитин (необработанный коричневый <1> и рафинированный желтый <1>, белок из сои, семена/зерна сои, кукурузные чипсы <1>.

--------------------------------

<1> Повторяемость может зависеть от партии продукта и/или технологии его получения. В некоторых случаях ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказываются ниже предела обнаружения метода независимо от используемых праймеров и/или протоколов ПЦР. Это может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.

Данный метод непригоден для анализа проб масел, мальтодекстрина, D-глюкозы, мальтита, маннита или ксилита массой 1 г.

A.5.2. Гуанидин хлороформный метод: Протокол для соевого лецитина

--------------------------------

<1> Пример коммерческого продукта. Эта информация приводится исключительно для удобства пользователей настоящего стандарта и не может служить рекомендацией или принуждением к использованию со стороны ИСО. Допускается использование аналогичного продукта, при условии, что он позволяет получать такие же результаты.

<2> Колонка и набор представляют собой пример коммерческих продуктов, подходящих для использования. Эта информация приводится исключительно для удобства пользователей настоящего стандарта и не может служить рекомендацией или принуждением к использованию со стороны ИСО. Допускается использование аналогичного продукта, при условии, что он позволяет получать такие же результаты.

--------------------------------

<1> Eppendorf Thermomixer - пример подходящего коммерческого продукта. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное использование только этого оборудования. Может использоваться эквивалентное оборудование, если его применение приводит к тем же результатам.

--------------------------------

<1> Пример подходящего реактива, имеющегося в продаже. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательность его применения. Могут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.

--------------------------------

<2> Колонки MicroSpin S-300 HR и набор Quant-iT PicoGreen dsDNA Quantitation Kit являются примерами подходящего коммерческого продукта. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное использование только этих приборов и реагентов. Могут использоваться эквивалентные приборы и реагенты, если их применение приводит к тем же результатам.

--------------------------------

<1> Колонки MicroSpin S-300 HR и набор Quant-iT PicoGreen dsDNA Quantitation Kit являются примерами подходящего коммерческого продукта. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное использование только этих приборов и реагентов. Могут использоваться эквивалентные приборы и реагенты, если их применение приводит к тем же результатам.

A.5.2.15.4 Количественная оценка ДНК

Если количество отчищенной ДНК образца достаточно, количественная оценка ДНК может быть проведена с использованием УФ-спектрофотометра, как описано в приложении B (раздел B.1). Концентрация ДНК также может быть оценена флюориметрически по методу PicoGreen dsDNA [17] с использованием комплекта реактивов (5.2.11.24), или эквивалентным методом.

Так как лецитина часто содержит низкое количество ДНК, для получения пригодной для амплификации соевой ДНК предпочтительно использовать ПЦР в реальном времени (см. B.3). Метод количественной оценки гена соевого лектина описан в ИСО 21570:2005 [41].

A.5.2.15.5 Оценка целостности ДНК

Целостность ДНК, полученной при экстракции, в последующем не оценивается, поскольку критерием качества экстрагированной ДНК является ее пригодность для амплификации при последующей ПЦР с использованием специфических для сои методов для последовательностей ДНК не превышающих 100 п.о.

A.5.2.15.6 Подготовка стандартов

Контрольная ДНК для калибровки выделена из соевой муки [ERM BF410a] с использованием протокола с ЦТАБ. Концентрацию ДНК оценивали флюориметрически методом PicoGreen dsDNA [17].

A.5.2.15.7 Критерии принятия или отклонения результатов

Количество амплифицируемой ДНК в пробе (в количестве копий за ПЦР) определяется посредством ПЦР в реальном времени. Достаточным условием принятия данных является, показатель LOD_prac если он не превышает 0,9% для содержащей ГМО ДНК.

A.5.2.15.8 Идентификация

Результат метода экстракции ДНК может быть проверен с помощью специфических для сои, справочных методик как описано в ИСО 21570:2005 [41].

A.5.2.16 Идентификация образцов

Все образцы должны быть идентифицированы.

A.5.2.17 Вычисления

Для вычисления LOD_prac см. 5.2.3.4.

A.5.2.18 Хранение материалов

Хранение материалов должно соответствовать ИСО/МЭК 17025 [39].

A.5.2.19 Отчет

Отчет должен быть выполнен, как определено в ИСО 24276 и других применимых стандартах (ИСО/МЭК 17025 [39]).

A.5.2.20 Меры по обеспечению безопасности

При использовании перчаток следует убедиться, что они не содержат талька. Загрязнение предотвращают при помощи стерильных расходных материалов (носики, пробирки).

A.5.2.21 Предотвращение загрязнения и вывоз отходов

См. ИСО 24276.

B.1. Основной метод ультрафиолетовой спектрометрии

B.1.1 Общие положения

В настоящем приложении описывается систематический метод определения концентрации ДНК в растворах.

B.1.2 Статус валидации

Настоящий метод был проверен путем кольцевого тестирования, результаты были опубликованы в [35]. Например, метод был успешно применен при межлабораторных сличениях по обнаружению ГМО, организованных Федеральным министерством общественного здравоохранения в Берне и кантональными лабораториями Базеля и Цюриха (Швейцария).

B.1.3 Принцип

Нуклеиновые кислоты в растворе поглощают ультрафиолетовый (УФ) свет в диапазоне 210 - 300 нм с максимумом поглощения на длине волны 260 нм. Поскольку ДНК, РНК и нуклеотиды имеют максимум поглощения на длине волны 260 нм, то загрязнение растворов ДНК и РНК нуклеотидами не может быть определено УФ-спектрометрией. По этой причине до определения ДНК необходимо ферментативное удаление РНК во время выделения ДНК. Также необходимо удалить олигонуклеотиды и нуклеотиды, полученные при гидролизе РНК (например, обработкой диоксидом кремния, как указано в A.4.1.7.2). Если не удалить образованные при обработке рибонуклеазой олигонуклеотиды и нуклеотиды (например, обработкой диоксидом кремния), это может привести к завышению содержания ДНК в образце. Кроме того, двухцепочечная ДНК абсорбирует меньше УФ-света по сравнению с одноцепочечной ДНК. Поскольку доля одноцепочечной ДНК в растворе неизвестна, то, чтобы избежать завышения содержания ДНК, вся ДНК в испытуемом образце превращается в одноцепочечную форму путем использования гидроксида натрия в качестве денатурирующего агента. Так как нуклеиновые кислоты не поглощают на длине волны 320 нм, показание на этой длине волны является информативным для определения фонового поглощения в результате рассеяния света и присутствия УФ-активных компонентов.

Построение калибровочного графика не является обязательным при условии, что соответствующий молярный коэффициент экстинкции выбран в зависимости от типа исследуемой нуклеиновой кислоты и/или ее целостности.

Однако необходимо периодически проверять калибровку спектрометра путем измерения концентрации эталонных растворов ДНК.

B.1.4 Область применения

Метод применим к концентрациям ДНК в диапазоне от 2 до 50 мкг/см³. Перед количественным анализом необходимо сделать соответствующие разбавления выделенной ДНК, подлежащей количественному определению, чтобы ее концентрация находилась в линейном диапазоне спектрометрического измерения (оптическая плотность - между 0,05 и 1).

Примечание - Следует учитывать, что остаточные соединения (например, ЦТАБ, оставшийся в результате процедуры экстрагирования ДНК) могут оказывать негативное влияние на УФ-спектрометрическое обнаружение на длине волны 260 нм. Это связано с тем, что данные соединения также поглощают на этой длине волны.

B.1.5 Реактивы

B.1.5.1 Трис(оксиметил) аминометан (Трис) (C₄H₁₁NO₃).

B.1.5.2 Гидроксид натрия (NaOH).

B.1.5.3 Соляная кислота, c (HCl) = 37%-ная.

B.1.5.4 ДНК-носитель, например ДНК <1> спермы сельди или вилочковой железы телят.

--------------------------------

<1> Эти продукты имеются в Sigma как D-7290 и D-1501 соответственно. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное применение данных реактивов. Могут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.

B.1.5.5 Эталонный раствор ДНК

Основной раствор ДНК массовой концентрации 10 мг/см³ готовят, растворив 100 мг ДНК-носителя (B.1.5.4) в 10 см³ буфера для разбавления (B.1.5.7). ДНК растворяется при этой концентрации очень медленно, и конечный раствор очень вязкий. Затем разбавляют этот приготовленный основной эталонный раствор ДНК буфером для разбавления до требуемой рабочей концентрации (например, 25 мкг/см³).

B.1.5.6 Раствор гидроксида натрия, c (NaOH) = 2 моль/дм³.

B.1.5.7 Буфер для разбавления, c (Трис) = 0,01 моль/дм³.

Доводят значение pH до 9,0 ед. pH, используя HCl.

B.1.6 Оборудование

B.1.6.1 УФ-спектрометр, допускаются одно-, двулучевые или фотодиодные приборы.

B.1.6.2 Смеситель, например Vortex.

B.1.6.3 Сосуды для измерения, например кварцевые или пластмассовые кюветы или пластиковые ячейки (планшеты), пригодные для УФ-обнаружения на длине волны 260 нм.

Размер используемых сосудов для измерения определяется объемом раствора для измерения: полумикрокюветы - 1000 мм³, микрокюветы - 400 мм³, ультрамикрокюветы - 100 мм³, кварцевые капилляры 3 - 5 мм³. Оптический путь стандартной кюветы составляет обычно 1 см.

B.1.7 Методика

B.1.7.1 Измерение эталонного раствора ДНК

Для обеспечения правильной калибровки спектрометр проверяют путем проведения следующих измерений с использованием эталонного раствора ДНК:

- при измерении фона (контрольного раствора) измерительный сосуд заполняют только буфером для разбавления (B.1.5.7);

- при измерении эталонного раствора измерительный сосуд заполняют эталонным раствором ДНК (B.1.5.5).

Поглощение контрольного раствора и эталонного раствора ДНК измеряют для обоих случаев на длинах волн 260 и 320 нм.

B.1.7.2 Измерение испытуемого раствора ДНК неизвестной концентрации

Для приготовления контрольного раствора смешивают буфер для разбавления (B.1.5.7) с раствором гидроксида натрия (B.1.1.5.13) таким образом, чтобы была достигнута конечная молярная концентрация NaOH 0,2 моль/дм³. Этой смесью заполняют измерительный сосуд.

Смешивают испытуемый раствор ДНК с раствором гидроксида натрия, чтобы получить конечную концентрацию NaOH 0,2 моль/дм³ (в случае необходимости смешивают и с буфером для разбавления). Этой смесью заполняют измерительный сосуд.

Выдерживают как контрольный раствор, так и эталонный раствор ДНК в течение 1 мин и проводят измерения при длинах волн 260 и 320 нм. Показание устойчиво в течение не менее 1 ч.

Пример 2 - Для приготовления испытуемого раствора ДНК смешивают 80 мм³ буфера для разбавления или воды, 10 мм³ раствора гидроксида натрия и 10 мм³ раствора ДНК неизвестной концентрации и переносят в измерительный сосуд вместимостью 100 мм³.

B.1.8 Оценка

Для определения фонового значения поглощения (оптической плотности) OD при длине волны 320 нм вычитают из значения поглощения при длине волны 260 нм, получая исправленное значение поглощения при 260 нм.

Если исправленное значение OD при 260 нм равняется 1,0, то расчетная концентрация ДНК составляет 50 мкг/см³ для двухцепочечной ДНК или 37 мкг/см³ для одноцепочечной ДНК (например, денатурированной гидроксидом натрия) соответственно.

Для получения достоверных измерений значения OD при длине волны 260 нм должны быть более 0,05.

Массовую концентрацию испытуемого раствора двухцепочечной ДНК с учетом денатурации и используемого коэффициента разбавления рассчитывают по формуле

где F - коэффициент разбавления;

OD₂₆₀ - поглощение при длине волны 260 нм;

OD₃₂₀ - поглощение при длине волны 320 нм;

37 - переводной коэффициент, мкг/см³.

Пример - Коэффициент разбавления составляет 10, значение OD₂₆₀ - 0,658 и значение OD₃₂₀ - 0,040:

B.2. Метод электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием

B.2.1 Общие положения

В настоящем приложении описывается систематический метод определения концентрации ДНК в растворах. Электрофорез ДНК в агарозном геле и окрашивание бромистым этидием (EtBr) позволяют оценить количество ДНК и в то же время проанализировать ее физическое состояние (например, степень деградации, присутствие остаточной РНК и некоторых загрязнителей). Метод также применяется в случаях, если имеется недостаточное количество ДНК для спектрометрического обнаружения или если ДНК недостаточно очищена и может содержать вещества, которые поглощают ультрафиолетовое излучение [36]. Электрофорез в геле обычно не рекомендуется применять для количественного определения ДНК в том случае, если она подверглась деградации. В этом случае следует применять другие методы.

B.2.2 Статус валидации

Этот метод на протяжении многих лет широко применялся при различных исследованиях, однако никогда не проверялся при межлабораторных исследованиях по обнаружению ГМО в пищевых продуктах.

B.2.3 Принцип

ДНК загружается на молекулярное сито (агарозный гель) и подвергается воздействию электрического поля в присутствии буферного раствора [37]. С помощью электрофореза ДНК разделяется в зависимости от ее заряда и молекулярной массы.

EtBr встраивается (интеркалирует) в ДНК и при возбуждении ультрафиолетовым светом излучает оранжевую флуоресценцию. Поскольку значение флуоресценции пропорционально общей массе ДНК, то количество ДНК в образце можно оценить путем сравнения флуоресценции, излучаемой неизвестным образцом, с флуоресценцией, излучаемой набором эталонных растворов ДНК с известным количеством ДНК. Молекулярная масса таких стандартов должна быть аналогична молекулярной массе ДНК, подлежащей количественному анализу, так как встраивание EtBr в ДНК и возникающее в результате него излучение флуоресценции также зависят от длины фрагментов ДНК. EtBr также окрашивает одноцепочечную ДНК и РНК. Для более точной оценки содержания ДНК необходимо с помощью ферментов удалить одноцепочечную ДНК и РНК.

B.2.4 Область применения

Метод применим к концентрациям ДНК в приблизительном диапазоне от 5 до 500 нг при использовании систем регистрации фотоизображений. Системы видеодокументации с камерой CCD могут обеспечить более высокую чувствительность.

B.2.5 Меры безопасности

Поскольку EtBr является мощным мутагеном и канцерогеном, при обращении с ним следует соблюдать меры предосторожности. Обязательным требованием является использование перчаток. Все растворы и гели, содержащие EtBr, перед выбросом и удалением необходимо подвергать дезактивации (см. [36]).

УФ-излучение особенно опасно для сетчатой оболочки глаза. При работе с УФ-излучением всегда необходимо надевать защитные очки или защитную маску.

B.2.6 Реактивы

Электрофорез в агарозном геле может выполняться с применением как буфера TAE, так и буфера TBE.

Применение этого метода не требует наличия реактивов степени чистоты, применяемой в молекулярной микробиологии. Используемые в данном методе растворы обычно не нуждаются в автоклавировании.

B.2.6.1 Агароза, пригодная для электрофореза ДНК и разделения молекул ДНК предполагаемого размера.

B.2.6.2 Борная кислота (H₃BO₃), только для буферной системы TBE.

B.2.6.3 Бромфеноловый синий (C₁₉H₉Br₄O₅SNa) и/или ксилол цианол FF (C₂₅H₂₇N₂O₆S₂Na).

B.2.6.4 Стандарт количества ДНК соответствующей молекулярной массы (линейная ДНК фага Лямбда для высокомолекулярных масс ДНК и подвергшаяся рестрикции низкомолекулярная ДНК фага Лямбда для низкомолекулярных масс ДНК).

B.2.6.5 Стандарт молекулярной массы ДНК, например коммерческий препарат, содержащий фрагменты ДНК от очень высокой до очень низкой молекулярной массы.

B.2.6.6 Ледяная уксусная кислота (CH₃COOH), только для буферной системы TAE.

B.2.6.7 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Na₂ЭДТА) (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂).

B.2.6.8 Бромистый этидий (EtBr) (C₂₁H₂₀N₃Br).

B.2.6.9 Глицерин (C₃H₈O₃).

B.2.6.10 Ацетат натрия (C₂H₃O₂Na), только для буферной системы TAE.

B.2.6.11 Соляная кислота, c (HCl) = 37%-ная.

B.2.6.12 Гидроксид натрия (NaOH).

B.2.6.13 Трис(оксиметил) аминометан (Трис) (C₄H₁₁NO₃).

B.2.6.14 Буферный раствор TAE (1^x), c (Трис) = 0,050 моль/дм³, c (C₂H₃O₂Na) = 20 моль/дм³, c (Na₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH ледяной уксусной кислотой или NaOH. Целесообразно готовить буферный раствор TAE в виде концентрированного основного раствора (максимум 50-кратной концентрации). Не следует использовать буфер при появлении видимого осадка. Разбавление концентрированных буферных растворов для электрофореза нестерильной, однократно перегнанной или деионизированной водой может выполняться непосредственно перед их использованием.

B.2.6.15 Трис боратный буферный раствор (TBE) (0,5^x), c (Трис) = 0,055 моль/дм³, c (борная кислота) = 0,055 моль/дм³, c (Na₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCl или NaOH. Целесообразно готовить буферный раствор TBE в виде концентрированного основного раствора (максимум 10-кратной концентрации. Не следует использовать буфер при появлении видимого осадка. Разбавление концентрированных буферных растворов для электрофореза нестерильной, однократно перегнанной или деионизированной водой может выполняться непосредственно перед их использованием.

B.2.6.16 Буферный раствор для загрузки пробы (5^x), в буферном растворе для электрофореза (B.2.6.14 или B.2.6.15) c (глицерин) = 50%, c (бромфеноловый синий) = 2,5 г/дм³ и/или c (ксилол цианол) = 2,5 г/дм³.

B.2.6.17 Раствор бромистого этидия, c (EtBr) = 0,5 мг/дм³

Целесообразно хранить раствор бромистого этидия в виде концентрата (например, 10 мг/см³) при температуре 5 °C в темноте (EtBr чувствителен к свету). Также желательно избегать взвешивания EtBr. Основной раствор необходимо готовить путем растворения порошка EtBr, уже находящегося в сосуде, соответствующим количеством воды или применяя предварительно взвешенные таблетки EtBr. Растворение EtBr следует выполнять в месте, защищенном от света, перемешивать при комнатной температуре. Обычно это занимает приблизительно 1 ч.

B.2.7 Оборудование

B.2.7.1 Печь микроволновая или кипящая водяная баня.

B.2.7.2 Оборудование для электрофореза в агарозном геле со вспомогательными принадлежностями и источником питания.

B.2.7.3 Ультрафиолетовый трансоблучатель или лампа, предпочтительно с длиной волны 312 нм.

Альтернативно могут использоваться оборудование для колоночной хроматографии нуклеиновых кислот и соответствующая система обнаружения или другие аналогичные системы.

B.2.7.4 Регистрирующий прибор, например система фотодокументации с пленкой 3000 ASA и УФ-фильтром, соответствующим флуоресценции, излучаемой EtBr.

Альтернативно могут использоваться система видеодокументации с камерой CCD, соответствующий УФ-фильтр и (при необходимости) программное обеспечение количественного анализа.

B.2.8 Методика

B.2.8.1 Общие положения

Электрофорез в агарозном геле может выполняться с применением как буфера TAE, так и буфера TBE. Допускается использовать один и тот же буфер для растворения агарозы и заполнения ячейки для электрофореза.

B.2.8.2 Приготовление агарозного геля

Гель должен быть не толще 1 см.

Концентрация агарозы и ее качество определяют разрешающую способность геля. Для количественного анализа ДНК с высокой молекулярной массой используются массовые концентрации агарозы от 8 до 10 г/дм³. Для количественного анализа ДНК с низкой молекулярной массой (например, деградированной или подвергнутой действию рестриктазы) используются более высокие концентрации агарозы (до 40 г/дм³) [38].

Взвешивают соответствующее количество агарозы (B.2.6.1) и добавляют ее в буферный раствор для электрофореза (B.2.6.14 или B.2.6.15). Кипятят раствор в микроволновой печи или водяной бане (B.2.7.1) до полного растворения агарозы. Дополняют объем, потерянный в результате выпаривания, эквивалентным количеством воды, перемешивают при взбалтывании (следует избегать захвата пузырьков воздуха), охлаждают раствор до температуры приблизительно 60 °C и выдерживают его при этой температуре до использования. Готовят гелевую подложку (лоток для геля) с соответствующей гребенкой для пробы, расположенной в правильном положении. Наливают раствор агарозы на гелевый лоток и дают возможность гелю загустеть при комнатной температуре (обычно рекомендуется в течение 1 ч).

B.2.8.3 Приготовление пробы ДНК

Смешивают растворы пробы ДНК (например, 5 - 10 мм³) с приблизительно 20% (относительно окончательного объема пробы) буфера для загрузки (B.2.6.16) (например, добавляют 2,5 мм³ буфера для загрузки к 10 мм³ пробы ДНК), перемешивают и вносят смесь в лунки (гнезда) для пробы с помощью микропипетки. Если предполагается, что неизвестные образцы будут очень концентрированными, то необходимо разбавить их перед загрузкой в гель.

Для определения размера выделенных фрагментов ДНК добавляют буфер для загрузки пробы (B.2.6.16) (в соотношении 20% относительно объема пробы) к соответствующему количеству стандарта молекулярной массы ДНК (B.2.6.5) и параллельно проводят электрофорез.

Для оценки концентрации неизвестного образца следует анализировать параллельно стандартные образцы количества ДНК. Такие образцы содержат известные количества стандарта ДНК (B.2.6.4) (в пределах динамической области применения метода, т.е. от 5 до 500 нг), разбавленного водой или буфером для электрофореза (B.2.6.14 или B.2.6.15). Рекомендуется использовать стандарты количества, содержащие по меньшей мере пять калибровочных точек (т.е. различные количества ДНК).

B.2.8.4 Проведение электрофореза

Осторожно вынимают гребенку для образцов из геля. Переносят гель (вместе с лотком) в ячейку для электрофореза таким образом, чтобы лунки находились как можно ближе к катоду (отрицательному электроду). Заполняют ячейку буфером для электрофореза (B.2.6.14 или B.2.6.15). Покрывают гель слоем того же буфера толщиной 2 мм и загружают анализируемые пробы с помощью микропипетки.

Выполняют электрофорез при комнатной температуре при соответствующем напряжении и энергоемкости (обычно рекомендуется максимальное неизменное напряжение 5 В/см для расстояния между электродами). В указанных условиях ДНК имеет отрицательный заряд, поэтому она мигрирует от катода к аноду. Время электрофореза зависит от требуемого расстояния миграции, тока, вырабатываемого источником энергии, электроэндоосмоса и концентрации агарозы в геле.

B.2.8.5 Окрашивание

После завершения электрофореза выдерживают гель в течение 15 - 50 мин в растворе бромистого этидия (B.2.6.17) при комнатной температуре, если возможно, в темноте (и/или в сосуде из нержавеющей стали с крышкой), осторожно встряхивая.

При необходимости уменьшения фонового окрашивания необходимо поместить гель в воду на 10 - 30 мин.

Как вариант можно добавлять EtBr к гелю перед его разливом. В этом случае добавляют EtBr к гелю до конечной массовой концентрации 0,01 мг на миллиметр геля, охлажденного до температуры 60 °C.

Если гель разливается вместе с бромистым этидием, загружают неизвестный образец и стандарт количества ДНК (B.2.6.4) в отдельные лунки, образованные той же гребенкой на том же геле. Иначе количество бромистого этидия будет различным для образца и стандарта, что приведет к ошибочным результатам количественного анализа. Чтобы свести к минимуму проблемы, связанные с движением EtBr в геле, некоторое количество EtBr может быть также добавлено к буферу для электрофореза (в ячейку). После электрофореза в геле обычно не требуется проведения стадии удаления окрашивания.

В данном случае после окончания электрофореза удаление окрашивания обычно не проводится.

B.2.8.6 Регистрация геля

Переносят гель на поверхность трансоблучателя, включают УФ-свет и регистрируют флуоресценцию ДНК с помощью фото- или видеозаписи.

B.2.9 Оценка/интерпретация результатов

Содержание ДНК в образце оценивают, сравнивая неизвестные образцы с образцами стандартного количества ДНК, которые подвергаются электрофорезу параллельно. Эта оценка может выполняться визуально или с помощью программного обеспечения количественного анализа, пригодного для расчета адекватной калибровочной кривой.

B.3. Метод ПЦР в реальном времени для количественного анализа выделенной ДНК

При выделении ДНК из продуктов с низким содержанием ДНК количественный анализ не всегда возможно провести обычными физическими методами (например, методами, описанными в настоящем приложении) по причине их недостаточной чувствительности. Если необходим такой количественный анализ, то можно использовать метод ПЦР в реальном времени. Этот метод также дает информацию относительно способности применения выделенных молекул ДНК для ПЦР, которую нельзя получить путем выполнения физических измерений концентраций ДНК. Более подробно метод описан в ИСО 21570.