"ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа. (Контрольный метод)"
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 30.11.2010 N 686-ст)

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") на основе собственного аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4.

2. Внесен Техническим комитетом стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2010 г. N 686-ст.

4. Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 13366-1:2008 "Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (Контрольный метод)" [ISO 13366-1:2008 "Milk - Enumeration of somatic cells - Part 1: Microscopic method (Reference method)"].

В настоящем стандарте исключен пункт "Протокол испытания" в связи с различиями форм записи результатов испытаний в различных лабораториях.

5. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета соматических клеток с применением микроскопа в сыром и химически консервированном молоке.

Стандарт допускается применять для подготовки стандартных проб при калибровке механизированных и автоматизированных способов подсчета клеток.

Предупреждение. Использование настоящего стандарта может быть сопряжено с применением опасных материалов, операций и оборудования. Настоящий стандарт не имеет целью решение всех вопросов безопасности, обусловленных его применением. На пользователя настоящего стандарта возлагается вся ответственность по установлению надлежащих правил безопасности и охраны здоровья и определения применимости регулятивных ограничений, разработанных до использования.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1. Соматические клетки (somatic cells): клетки с ядрами, то есть все лейкоциты и эпителиальные клетки, определяемые в соответствии с процедурой, приведенной в настоящем стандарте.

Анализируемую пробу молока распределяют на предметном стекле и получают мазок, который высушивают. После высушивания мазок окрашивают. Далее окрашенные клетки подсчитывают с использованием микроскопа. Количество подсчитанных клеток на четко установленной площади умножают на рабочий коэффициент с целью определения количества клеток на миллилитр.

Используют только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет других указаний, и дистиллированную или деминерализованную воду или воду аналогичной чистоты.

4.1. Растворы красителей

Предупреждение. Тетрахлорэтан является ядовитым веществом. Бромистый этидий является мутагенным веществом. В случае проливания следует предпринять надлежащие действия по обезвреживанию. Подготовка и применение растворов красителей должны осуществляться под вытяжным шкафом с использованием защитного оборудования.

4.1.1. Модифицированный окрашивающий раствор

4.1.1.1. Состав

4.1.1.2. Приготовление модифицированного окрашивающего раствора

Смешивают этанол и тетрахлорэтан и закрывают сосуд. Смесь нагревают на водяной бане (5.1) при температуре 65 °C. Добавляют метиленовый синий под вытяжным шкафом и тщательно перемешивают. Смесь охлаждают до температуры 4 °C.

Затем добавляют безводную уксусную кислоту и вновь тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтр (5.2) и помещают в герметичный сосуд на хранение.

Перед использованием окрашивающий раствор снова фильтруют.

4.1.2. Окрашивающий раствор бромистого этидия

4.1.2.1. Основной окрашивающий раствор

4.1.2.1.1. Состав

4.1.2.1.2. Приготовление основного окрашивающего раствора

Бромистый этидий растворяют в деминерализованной воде, предварительно нагретой до 40 °C. Раствор охлаждают до комнатной температуры. Доводят объем до 100 см3 деминерализованной водой.

Основной окрашивающий раствор бромистого этидия хранят в темном месте при температуре (2 +/- 2) °C не более 2 мес.

4.1.2.2. Буферный раствор

4.1.2.2.1. Состав

4.1.2.2.2. Приготовление буферного раствора

Растворяют по отдельности калия гидрофталат и калия гидроксид в деминерализованной воде.

Буферный раствор хранят в темном месте при температуре (2 +/- 2) °C не более 2 мес.

4.1.2.3. Рабочий окрашивающий раствор бромистого этидия

4.1.2.3.1. Компоненты

4.1.2.3.2. Приготовление рабочего окрашивающего раствора бромистого этидия

Последовательно добавляют основной окрашивающий раствор бромистого этидия, буферный раствор и Тритон X-100 к деминерализованной воде и тщательно перемешивают.

Свежий рабочий окрашивающий раствор бромистого этидия готовят непосредственно перед использованием.

4.2. Фосфатный буферный раствор (PBS)

4.2.1. Компоненты

4.2.2. Приготовление фосфатного буферного раствора (PBS)

Соли растворяют в деминерализованной воде. Доводят объем до 1000 см3 оставшимся количеством деминерализованной воды.

Устанавливают pH на уровне 7,2 +/- 0,1.

Примечание. Допускается использовать готовый фосфатный буферный раствор с pH = 7,2.

Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, нижеприведенное.

5.1. Бани водяные, работающие при температуре (40 +/- 2) °C, (50 +/- 2) °C и (65 +/- 2) °C.

5.2. Фильтр, устойчивый к используемым растворителям, с диаметром пор 10 - 12 мкм.

5.3. Микроскоп, имеющий увеличение - . Допускается использовать масляно-иммерсионные объективы.

При использовании бромистого этидия микроскоп должен иметь флуоресцентное оборудование.

5.4. Микрошприц, для дозирования установленного объема молока 0,01 см3, с максимальным допуском 2%.

5.5. Микрометр

5.6. Стекла предметные с предварительно нанесенными очерченными контурами (прямоугольным или круговым), площадью 1 см2 +/- 5% (95 - 105 мм2), или стандартное предметное стекло 20 x 5 мм или имеющее диаметр 11,28 мм.

5.6.1. Формы предметных стекол

При использовании предметного стекла прямоугольной формы верхняя и нижняя внутренняя ширина, с одной стороны, и левая и правая внутренняя высота, с другой стороны, не должны отличаться более чем на 0,2 мм.

При использовании предметных стекол круглой формы вертикальный и горизонтальный внутренние диаметры не должны отличаться более чем на 0,2 мм.

В лабораторию доставляют представительную пробу. Проба не должна быть повреждена или модифицирована при транспортировании или хранении.

Отбор проб не является частью метода, устанавливаемого в настоящем стандарте. Отбор проб - по [1].

7.1. Хранение

До проведения определения или химического консервирования анализируемые пробы хранят при температуре (4 +/- 2) °C.

Определение проводят в течение 6 ч после отбора проб.

В случае более длительного хранения в пробы добавляют химические консерванты, такие как борная кислота, бронопол или дихромат калия. Массовая концентрация борной кислоты в анализируемой пробе не должна превышать 0,6 г на 100 см3. Массовая концентрация бронопола в анализируемой пробе не должна превышать 0,05 г на 100 см3. Массовая концентрация дихромата калия в анализируемой пробе не должна превышать 0,1 г на 100 см3.

Консервированные пробы хранят при температуре (4 +/- 2) °C не более 6 дней.

Рекомендуется ограничить использование дихромата калия в случае проб, для которых предусмотрен только длительный срок хранения.

7.2. Приготовление пробы

Анализируемую пробу молока нагревают (см. 7.1) на водяной бане (5.1) при температуре 40 °C, постоянно перемешивая. Охлаждают пробу до температуры 20 °C.

Разбавляют анализируемую пробу фосфатно-буферным раствором (4.2) до получения около 500 000 соматических клеток/см3 для каждой разбавленной анализируемой пробы.

где d - коэффициент разбавления для получения надлежащего количества соматических клеток в анализируемой пробе, примерно 500 000 клеток/см3;

- объем, см3, анализируемой пробы;

- объем, см3, буферного раствора, используемого для разбавления анализируемой пробы.

Записывают надлежащий коэффициент разбавления, d, объем анализируемой пробы , и объем буферного раствора , используемый для получения нужного разбавления.

Для каждой анализируемой пробы приготовляют как минимум два мазка (см. 8.1) и отбирают лучший из них (например, мазок, не поврежденный в процессе окрашивания). Погружают предметные стекла (5.6) в этанол (95% по объему). Стерилизуют пламенем и охлаждают.

8.1. Приготовление мазка и окрашивания

Для приготовления мазка и окрашивания следуют рекомендациям, приведенным в 8.1.1 или 8.1.2.

Примечание. Окрашивание в случае козьего молока описано в Приложении B.

8.1.1. Приготовление мазка и окрашивания с использованием окрашивающего раствора

Используя микрошприц (5.4), отбирают 0,01 см3 анализируемой пробы (при необходимости разбавленной) (см. 7.2). Микрошприц промывают анализируемой пробой. При необходимости тщательно и аккуратно очищают внешнюю сторону микрошприца, которая контактировала с анализируемой пробой.

Помещают смесь на чистое предметное стекло площадью 1 см2 (5.6). Используя иглу, равномерно распределяют анализируемую пробу на всей указанной поверхности, при этом контролируют, чтобы площадь, прилегающая к внешним границам, была также равномерно покрыта. Мазок подсушивают при комнатной температуре до состояния полной сухости.

Высушенный на предметном стекле мазок погружают в модифицированный окрашивающий раствор (4.1.1) в течение не менее 15 мин. Высушивают мазок при комнатной температуре.

Затем осторожно вносят мазок под водопроводную воду до полного смыва всех излишков красителя. Высушивают вновь и хранят в условиях защиты от пыли.

Срок хранения предметных стекол с мазками - не более 12 мес.

8.1.2. Окрашивание с использованием окрашивающего раствора бромистого этидия и приготовление мазка

Смешивают 1 см3 приготовленной анализируемой пробы (см. 7.2) с 1 см3 рабочего окрашивающего раствора бромистого этидия (4.1.2.3) в пробирке. Смесь хранят в защищенном от света месте. Нагревают пробирку на водяной бане (5.1) при температуре 50 °C в течение 3 мин. Охлаждают до комнатной температуры.

Используя микрошприц (5.4), отбирают 0,01 см3 смеси. Микрошприц промывают смесью. При необходимости тщательно и аккуратно очищают внешнюю сторону микрошприца, которая контактировала со смесью.

Помещают смесь на чистое предметное стекло площадью 1 см2 (5.6). Используя иглу, равномерно распределяют смесь на всей указанной поверхности, при этом контролируют, чтобы площадь, прилегающая к внешним границам, была также равномерно покрыта. Мазок подсушивают при комнатной температуре до состояния полной сухости.

8.2. Определение

8.2.1. Оптимизация считывания

Используя микроскоп (5.3), подсчитывают ядра клеток в полученном мазке (8.1.1 или 8.1.2) в полях микроскопа, целиком заполненных только мазком молока. Выбирают наилучшее увеличение (от до ), чтобы в каждом поле максимальное количество клеток в среднем было 20.

Клетки имеют окрашенное ядро. Размер клетки - не менее 8 мкм. Не следует подсчитывать клетки с размером не более 4 мкм (см. рисунок 1). Фрагменты клеток подсчитывают в окончательном результате, если видно более 50% ядерного материала. Кластеры клеток подсчитывают как одну клетку, если ядра четко не разделены. См. рисунки 2 и 3.

На примере кластера, представленного на рисунке 3, следует подсчитать 5 клеток. L27 опущен из-за своего диаметра, который имеет размеры не более 4 мкм.

Примечание. Подготовка и профессиональное мастерство аналитика являются основными решающими факторами успешного использования метода. Частое использование данного метода и участие в межлабораторных испытаниях играют существенную роль в плане обеспечения надлежащего уровня подсчета.

Клетки в молоке распределяются по закону Пуассона (см. Приложение C). Минимальное количество клеток (N), подсчитываемых с учетом требуемого уровня подсчета клеток, с целью достижения указанного коэффициента вариации, приведено в таблице 1.

Для правильного выполнения метода важно, чтобы указанное минимальное количество клеток было подсчитано. Подсчитываемые поля и полосы выбирают таким образом, чтобы получить представительный подсчет для всего мазка.

8.2.2. Подсчет в последовательных полях микроскопа

Подсчитывают ядра в последовательных полях, в вертикальных полосах на равномерно размещенных полях (см. рисунок 4 и таблицу 1).

a) Начинают приблизительно на расстоянии от левой стороны. В случае круглой формы начинают на достаточном расстоянии от левой стороны горизонтального диаметра таким образом, чтобы обеспечить подсчет минимум 5 полей от верхней части полосы. Расстояние 0,5 мм подходит для прямоугольной и круглой формы.

b) Помещают верхний или нижний край окружности поля тангенциально по отношению к внутренней верхней или нижней границе шаблона (шаблон не должен быть видимым в поле). В случае наличия непокрытой поверхности вблизи границы шаблона корректируют поле по границе мазка.

c) После подсчета первого поля объектив передвигают на установленное расстояние вниз или вверх, до следующей градации в направлении нижнего или верхнего края и подсчитывают новое поле. Расстояние считается пригодным.

d) С последнего подсчитанного поля повторяют операцию c) вплоть до достижения противоположной стороны (верхней или нижней) полосы. Выбирают один из двух приведенных вариантов.

- Вариант 1: последнее поле не подлежит подсчету.

- Вариант 2: если появляется верхняя или нижняя граница и она заполняет менее половины поверхности поля, подсчет производится после передвижения объектива до полного исчезновения границы с поля, которое в этом случае только покрывает мазок.

e) Затем объектив передвигают вправо на расстояние (например, или в зависимости от необходимого числа полей) и начинают работать с новой полосой в противоположном направлении (вверх или вниз).

f) Операции b) - e) повторяют до достижения правой стороны шаблона.

g) В случае недостаточного количества подсчитываемых полей (см. таблицу 1) можно подсчитать дополнительные поля. Для выполнения этой операции объектив микроскопа фокусируют на другие зоны (например, посредством изменения исходной позиции и/или адаптации расстояний при поэтапном передвижении) таким образом, чтобы получить надлежащее количество полей, которое является репрезентативным для всего мазка.

h) Результат рассчитывают в соответствии с указаниями 9.1 для прямоугольной формы или 9.3 для круглой формы.

Примечание. В случае прямоугольной формы возможно расположение 5 полей на 1 мм в вертикальных полосах и 10 полос, расположенных на расстоянии 2 мм, что позволяет подсчитать 50 полей. Приблизительно такое же количество полей получается при круглой форме при использовании тех же расстояний. Расстояния между сдвигами (пространства) измеряются от той же зоны полей с использованием прибора корректировки (выравнивание верхнего или нижнего края) таким образом, чтобы они включали в себя диаметр поля.

8.2.3. Подсчет в прямоугольной форме по полосам

Ядра подсчитывают в расположенных с равными интервалами вертикальных полосах (см. рисунок 5 и таблицу 1):

a) Начинают приблизительно на расстоянии от левой стороны. Расстояние 0,5 мм считается пригодным.

b) Начинают подсчитывать от верхней или нижней границы прямоугольной площади. Помещают границу поверхности в центр зрения микроскопа. После подсчета всех клеток объектив передвигают в направлении, противоположном границе, и подсчитывают все клетки, видимые в этой полосе, вплоть до достижения противоположной границы. Записывают число подсчитанных клеток.

c) Затем объектив передвигают вправо на расстояние и начинают подсчет новой полосы (например, в зависимости от необходимого числа полей для репрезентативного подсчета всего мазка).

Операции b) - c) повторяют до достижения правой стороны шаблона.

В случае недостаточного количества подсчитываемых полос (см. таблицу 1) можно подсчитать дополнительные полосы. Для выполнения этой операции объектив микроскопа фокусируют на другие зоны (например, посредством изменения исходной позиции и/или адаптации ) таким образом, чтобы получить надлежащее количество полос, которое является репрезентативным для всего мазка.

Результат подсчитывают, как указано в 9.2.

9.1. Подсчет для прямоугольной формы в последовательных полях

Проверяют контрольные значения 20,0 и 5,0 мм для длины и ширины мазка с использованием градуировки и прибора корректировки микроскопа.

Рассчитывают общую концентрацию c клеток, используя следующее уравнение:

или

с постоянным рабочим коэффициентом 

где c - общая концентрация, выраженная в количестве клеток на миллилитр;

- ширина мазка, мм;

- длина мазка, мм;

- общее количество подсчитанных клеток, шт.;

- диаметр поля микроскопа, мм;

- количество полностью подсчитанных полей, шт.;

- объем, см3, испытуемой пробы мазка (см. 8.1.1 или 8.1.2) [, равный 0,01 см3, в случае использования для окрашивания (8.1.1) модифицированного рабочего окрашивающего раствора; , равный 0,005 см3, в случае использования для окрашивания (8.1.2) окрашивающего раствора бромистого этидия].

d - коэффициент разбавления, используемый в 7.2 (если разбавление не требуется, d = 1; при разбавлении 1:1 d = 0,5).

9.2. Подсчет для прямоугольной формы в полосах

Проверяют контрольные значения 20,0 и 5,0 мм для длины и ширины мазка с использованием градуировки и прибора корректировки микроскопа.

Рассчитывают общую концентрацию c клеток, используя следующее уравнение:

или

с постоянным рабочим коэффициентом 

где - количество полностью подсчитанных полос.

Остальные обозначения приведены в 9.1.

9.3. Подсчет для круглой формы в последовательных полях

Проверяют диаметр мазка, равный 11,28 мм, используя градуировку и прибор корректировки микроскопа.

Рассчитывают общую концентрацию c клеток, используя следующее уравнение:

или

с постоянным рабочим коэффициентом 

где - диаметр мазка, мм.

Остальные обозначения приведены в 9.1.

9.4. Выражение результатов

Результаты испытаний округляют до тысячи клеток (например, 401 586 клеток/см3 выражают как 402 000 клеток/см3).

Точность настоящего метода установлена в соответствии с [2] и [3]. Значения, полученные для повторяемости и воспроизводимости, выражены при уровне вероятности 95%.

10.1. Повторяемость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами определений, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному анализируемому материалу в той же лаборатории, одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение короткого периода времени, должна не более чем в 5% случаев превышать значения, приведенные в таблице 2.

10.2. Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами определений, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному анализируемому материалу в различных лабораториях, различными операторами с использованием различного оборудования, должна не более чем в 5% случаев превышать значения, приведенные в таблице 3.

A.1. Общие положения

В октябре 2005 г. были проведены совместные международные исследования коровьего молока, в которых приняли участие восемнадцать лабораторий и тринадцать стран. Испытание включало 8 проб на четырех уровнях клеток/мл и включало 16 дублирующих проб без указания источника поступления. Среднее значение каждого уровня соответственно составляет:

- уровень 1, пробы A и B: 245 000 клеток/см3;

- уровень 2, пробы C и D: 455 000 клеток/см3;

- уровень 3, пробы E и F: 679 000 клеток/см3;

- уровень 4, пробы G и H: 791 000 клеток/см3.

Испытание было организовано A.I.A. Laboratorio Standard Latte, Maccarese-Roma (Италия), которая также провела статистический анализ согласно [2] и [3] с целью предоставления прецизионных данных, приведенных в таблице A.1.

B.1. Окрашивающие растворы для козьего молока

B.1.1. Фиксатор Карнуа

B.1.1.1. Состав

B.1.1.2. Приготовление

Последовательно добавляют хлороформ и безводную уксусную кислоту в этанол и тщательно перемешивают.

B.1.2. Окрашивающий раствор пиронина-Y и метилового зеленого

B.1.2.1. Состав

B.1.2.2. Приготовление

Последовательно добавляют пиронин-Y и метиловый зеленый в сосуд с деминерализованной водой и тщательно перемешивают. Фильтруют через подходящий фильтр (5.2) и хранят в коричневой емкости. Перед использованием раствор фильтруют снова через подходящий фильтр (5.2).

B.2. Приготовление мазка

Работают с предметным стеклом, выполняя следующие этапы окрашивания:

1. Используют фиксатор Карнуа (B.1.1) в течение 5 мин.

2. Используют этанол в концентрации 50% в течение 1 мин.

3. Используют этанол в концентрации 30% в течение 1 мин.

4. Используют воду в течение 1 мин.

5. Используют окрашивающий раствор пиронина-Y и метилового зеленого (B.1.2) для окрашивания в течение 6 мин.

6. Кратковременно промывают н-бутиловым спиртом, затем ксилолом.

7. Предметные стекла хранят в условиях защиты от пыли не более 12 мес.

Клетки в молоке распределяются по закону Пуассона. Распределение Пуассона по формуле

где M - среднее значение, которое, в случае подсчета количества соматических клеток, представляет собой число подсчитанных частиц (клеток);

V - дисперсия;

s - стандартное отклонение.

Коэффициент вариации (CV) будет равен

или

или

--------------------------------

<*> Действует до введения в действие ГОСТ Р, разработанного на основе соответствующего ИСО.