"ГОСТ EN 14152-2020. Межгосударственный стандарт. Продукция пищевая. Определение содержания витамина B2 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 24.04.2024 N 535-ст)

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2020 г. N 131-П)

За принятие стандарта проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 апреля 2024 г. N 535-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14152-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 ноября 2024 г. с правом досрочного применения

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14152:2014 "Продукты пищевые. Определение витамина B₂ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" ("Foodstuffs - Determination of vitamin B₂ by high performance liquid chromatography", IDT).

Европейский стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочного европейского стандарта соответствующий ему межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВЗАМЕН ГОСТ EN 14152-2013 <*>

--------------------------------

<*> Отменяется ГОСТ 25999-83 "Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витаминов B1 и B2" (в части раздела 3) с момента введения в действие настоящего стандарта.

Предупреждение - Применение настоящего стандарта может быть связано с проведением опасных операций, использованием вредных веществ, опасного оборудования. В задачи настоящего стандарта не входит решение всех вопросов безопасности, связанных с его применением. Ответственность за соблюдение техники безопасности и установление необходимых ограничений при применении настоящего стандарта несет его пользователь.

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания витамина B₂ в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и флуоресцентного детектирования. Данный метод был валидирован в двух межлабораторных исследованиях. В первом исследовании проводился анализ проб сухого молока и свиной печени в пределах от 1,45 до 10,68 мг/100 г. Во втором исследовании анализировали пробы раствора для энтерального питания, пищевой продукции для детского питания, сухого молока, цельнозерновой муки с фруктами, дрожжей, продуктов переработки зерна, шоколадного порошка в диапазоне от 0,21 до 87,10 мг/100 г. Содержание витамина B₂ представляет собой массовую долю общего рибофлавина, включая его фосфорилированные производные.

Для получения более подробной информации о валидации см. раздел 8 и приложение B.

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

Рибофлавин извлекают из пищевой продукции путем кислотного гидролиза с последующим дефосфорилированием, используя ферментативную обработку, и определяют его количество методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием. Для количественной оценки используют метод внешнего стандарта. Для получения дополнительной информации см. [1] - [11].

Для проведения анализа, если не указано иное, используют только реактивы признанной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696 или бидистиллированную воду.

4.1 Метанол для ВЭЖХ, массовая доля w(CH₃OH) >= 99,8%.

4.2 Натрия ацетат тригидрат, w(CH₃COONa·3H₂O) = 99%.

4.3 Раствор ацетата натрия, молярная концентрация c(CH₃COONa·3H₂O) = 0,1 моль/дм³.

4.4 Раствор ацетата натрия, c(CH₃COONa·3H₂O) = 2,5 моль/дм³.

4.5 Ледяная уксусная кислота, w(CH₃COOH) = 99,8%.

4.6 Раствор уксусной кислоты, c(CH₃COOH) = 0,02 моль/дм³.

4.7 Раствор соляной кислоты, w(HCl) = 36%.

4.8 Раствор соляной кислоты, c(HCl) = 0,1 моль/дм³.

4.9 Раствор соляной кислоты, c(HCl) = 0,01 моль/дм³.

4.10 Раствор серной кислоты, c(H₂SO₄) = 0,05 моль/дм³.

4.11 Раствор гидроксида натрия, w(NaOH) >= 99%.

4.12 Раствор гидроксида натрия, c(NaOH) = 0,5 моль/дм³.

4.13 Оксид фосфора, w(P₂O₅) = 98%.

4.14 Фермент или смесь ферментов, способные высвобождать витамин B₂ из пищевой продукции в виде свободного рибофлавина.

Примечание 1 - Для получения прецизионных данных, указанных в таблице B.1, была использована така-диастаза, произведенная компанией Pfaltz and Bauer <1>. Для получения прецизионных данных, указанных в таблицах B.2 и B.3, была использована смесь из ячменя и така-диастазы, произведенной Serva <1>.

--------------------------------

<1> Информация о поставщиках така-диастазы Pfaltz & Bauer, Уотербери, CT 06708, США (N T00040), и Serva приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой CEN указанной продукции. Допускается использовать аналогичную продукцию при условии обеспечения идентичных результатов.

Примеры соответствующих смесей с объемными долями метанола (см. 4.1) от 10% до 50% в воде или использования фосфатного или ацетатного буфера представлены в приложениях A, C. Также представлен вариант подвижной фазы с использованием ион-парного реагента.

4.16 Фосфатный буфер (pH 3,5), c(KH₂PO₄) = 9,0 ммоль/дм³.

4.17 Тетраэтиламмоний хлорид, w(C₈H₂₀NCl) >= 98%.

4.18 Натрия гептансульфонат, w(C₇H₁₅NaO₃S) >= 98%.

4.19 Стандартные вещества

4.19.1 Рибофлавин, w(C₁₇H₂₀N₄O₆) = 98%.

Витамин B₂ в виде рибофлавина может быть получен от различных поставщиков, поэтому степень его чистоты может различаться. В связи с этим необходимо определять концентрацию градуировочного раствора методом УФ-спектрометрии (см. проверку концентрации 4.20.3).

4.19.2 Рибофлавин-5'-фосфат натрия, w(C₁₇H₂₀N₄NaO₉P) = 95%.

Соль рибофлавин-5'-фосфат натрия (для проверки фермента и времени удерживания на хроматограмме).

Витамин B₂ является очень чувствительным к свету. Поэтому необходимо защитить витамин B₂ и соответствующие растворы в течение всей процедуры подготовки проб, например, посредством использования посуды из темного стекла.

4.20.2 Основной раствор рибофлавина, M = 376,36, .

Взвешивают около 50 мг стандартного вещества рибофлавина (см. 4.19.1) с точностью до 1 мг, которое было предварительно высушено и хранилось в темноте в эксикаторе под вакуумом и/или заполненном оксидом фосфора (см. 4.13), помещают в мерную колбу из темного стекла вместимостью 500 см³ и растворяют в растворе уксусной кислоты (см. 4.6). Полученный раствор хранят в темноте при температуре 4 °C в течение двух месяцев.

Рибофлавин труднорастворим. Для облегчения его растворения в мерную колбу со стандартным веществом рибофлавина вносят около 300 см³ раствора уксусной кислоты (см. 4.6) и выдерживают колбу на водяной бане при постоянном перемешивании до полного растворения рибофлавина, затем раствор охлаждают и объем содержимого колбы доводят до метки раствором уксусной кислоты (см. 4.6). В качестве альтернативы в мерную колбу вместимостью 500 см³ со стандартным веществом рибофлавина вносят 5 см³ раствора гидроксида натрия (см. 4.12). Поскольку рибофлавин нестабилен в щелочной среде, сразу же после его растворения в колбу вносят 1,5 см³ ледяной уксусной кислоты (см. 4.5), после чего объем содержимого колбы доводят до метки раствором уксусной кислоты (см. 4.6) или другой соответствующей кислотой. Точную концентрацию свежеприготовленного основного раствора рибофлавина и при необходимости хранившегося следует определять (см. 4.20.3).

В мерной колбе вместимостью 200 см³ смешивают 20 см³ основного раствора рибофлавина (см. 4.20.2) с 3,5 см³ раствора ацетата натрия (см. 4.3) и объем содержимого колбы доводят до метки водой. Для подготовки холостого раствора в мерной колбе вместимостью 200 см³ смешивают 20 см³ раствора уксусной кислоты (см. 4.6) с 3,5 см³ ацетата натрия (см. 4.3) и объем содержимого колбы доводят до метки водой. Данные растворы используют для спектрометрического измерения.

Измеряют оптическую плотность раствора рибофлавина на спектрометре (см. 5.1) при длине волны 444 нм (A₄₄₄) в кювете с длиной оптического пути 1 см, используя холостой раствор в качестве раствора сравнения. Рассчитывают массовую концентрацию основного раствора рибофлавина (см. 4.20.2) , мкг/см³, по формуле

где - молярный коэффициент поглощения рибофлавина при максимальной длине волны приблизительно 444 нм, . Данное значение рассчитывается исходя из коэффициента экстинкции в ацетатном буфере (pH = 3,8) при 444 нм [9] и молярной массы M = 376,36. Значение округляют до четырех значащих цифр;

M - молярная масса, г/моль. Значение равно 376,36;

A₄₄₄ - значение оптической плотности раствора рибофлавина.

4.21.1 Стандартный раствор рибофлавина, .

Готовят разведение 1 : 10 основного раствора рибофлавина (см. 4.20.2). Переносят пипеткой 10 см³ основного раствора рибофлавина в мерную колбу из темного стекла вместимостью 100 см³ и объем содержимого колбы доводят до метки раствором уксусной кислоты (см. 4.6) или другим подходящим растворителем. Используют свежеприготовленный раствор.

4.21.2 Стандартный аналитический раствор рибофлавина, .

В мерную колбу из темного стекла вместимостью 100 см³ переносят пипеткой от 1,0 до 10,0 см³ стандартного раствора (см. 4.21.1) и объем содержимого колбы доводят до метки подвижной фазой (см. 4.15). Используют свежеприготовленный раствор.

Используют стандартное лабораторное оборудование, стеклянную посуду, в том числе оборудование, перечисленные ниже:

5.1 УФ-спектрометр, пригодный для измерения оптической плотности при определенной длине волны (444 нм) с соответствующими кюветами с длиной оптического пути 1 см.

5.2 Автоклав или нагревательный прибор, автоклав, предназначенный для экстракции, например электрического типа, работающий под давлением, со считывающим устройством давления или температуры, плитка электрическая или водяная баня.

Система ВЭЖХ состоит из насоса, устройства для ввода проб, флуоресцентного детектора с длиной волны возбуждения и эмиссии, установленных на уровнях 468 и 520 нм соответственно (см. приложение C), а также устройства для обработки данных, например интегратора.

Аналитическая колонка для обращенно-фазовой хроматографии, например диаметром от 4,0 до 4,6 мм, длиной от 100 до 250 мм, размер частиц от 3 до 10 мкм. Также могут использоваться другие системы (см. приложение C) при условии обеспечения приемлемой степени отделения пика рибофлавина от пиков сопутствующих компонентов матрицы пробы.

Допускается использовать колонку других размеров, заполненную сорбентом с размером частиц, отличным от указанных в настоящем стандарте. Условия хроматографического разделения подбирают применительно к используемой колонке для обеспечения сопоставимости результатов анализов.

Фильтрация подвижной фазы, а также раствора анализируемой пробы через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм до использования или ввода проб продлевает срок службы колонок.

Витамин B₂ является очень чувствительным к свету. Необходимо предпринимать меры, чтобы защитить витамин B₂ и соответствующие растворы в течение всей процедуры подготовки проб, например, посредством использования посуды из темного стекла.

Гомогенизируют анализируемую пробу. Твердую продукцию измельчают в соответствующей мельнице и перемешивают. Перед измельчением пробу рекомендуется охладить, чтобы не подвергать ее воздействию высоких температур в течение длительного времени.

В мерном стакане или конической колбе взвешивают от 2 до 10 г анализируемой пробы с точностью до 1 мг. Добавляют определенный объем от 50 до 200 см³ раствора соляной (см. 4.8) или серной кислоты (см. 4.10). Значение pH раствора не должно быть выше 2,0. Накрывают колбу предметным стеклом и автоклавируют пробу для испытания при температуре 121 °C в течение 30 мин или нагревают ее при температуре 100 °C в течение 60 мин.

Исследования, проводимые Европейским бюро стандартов (BCR), показали, что можно применять обширный диапазон условий для кислотного гидролиза (температура от 95 °C до 130 °C, продолжительность от 15 до 60 мин), при этом чем выше температура, тем меньше продолжительность гидролиза. Тем не менее длительное нагревание рибофлавина и рибофлавина-5'-фосфата натрия может вызвать потери. Испытания показали, что, в частности, для пищевой продукции, содержащей шоколад, эффективность экстракции снижается, если значение pH раствора выше 2.

После охлаждения до комнатной температуры к экстракту добавляют раствор ацетата натрия (см. 4.4) до достижения значения pH, оптимального для действия предполагаемого к использованию фермента, и подходящее количество дефосфорилирующего фермента (см. 4.14). Инкубируют полученную смесь в течение промежутка времени и при температуре, оптимальных для используемого фермента или смеси ферментов. После охлаждения до комнатной температуры переносят раствор в мерную колбу, используя раствор уксусной кислоты (см. 4.6) или другой соответствующий растворитель, и доводят раствор анализируемой пробы до заданного объема V_E.

Для каждого используемого фермента необходимо установить оптимальное значение pH, оптимальные продолжительность и температуру инкубирования.

Для установления оптимальных условий дефосфорилирования проводят процедуру ферментативной обработки проб с добавленным известным количеством рибофлавин-5'-фосфат натрия (см. 4.19.2), а также проб, аналогичных исследуемой пробе по составу матрицы и являющихся аттестованными образцами сравнения.

Количество рибофлавина, внесенное с ферментом, должно учитываться при расчете результата.

Примечание - Для определения прецизионности результатов испытаний, указанных в таблицах B.1, B.2 и B.3, для дефосфорилирования использовали така-диастазу (см. таблицу B.1) и смесь така-диастазы и из ячменя (см. таблицу B.2 и таблицу B.3) при следующих условиях. Значение pH экстракта довели раствором ацетата натрия (см. 4.4) до 4,0 и 4,5 соответственно и добавили 100 мг така-диастазы и 10 мг на грамм пробы. Смесь инкубировали при температуре от 37 °C до 45 °C в течение от 4 до 24 ч, см. [9], [10], [13].

При необходимости раствор анализируемой пробы (см. 6.3.2) фильтруют через фильтровальную бумагу или мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм или центрифугируют на подходящем g уровне.

При необходимости разбавляют аликвоту V_a определенным объемом V смеси растворителя, совместимого с системой элюирования ВЭЖХ. Например, 1,0 см³ экстракта (см. 6.3.2) разбавляют 1,0 см³ метанола (см. 4.2.1). Полученный раствор является раствором анализируемой пробы для анализа ВЭЖХ.

В систему ВЭЖХ вводят одинаковые соответствующие объемы стандартных растворов, а также растворов анализируемой и холостой проб. Идентифицируют рибофлавин путем сравнения времени удерживания индивидуальных пиков на хроматограммах раствора анализируемой пробы и стандартного раствора. Идентификация пиков также может быть выполнена путем добавления определенного количества стандартного вещества в раствор анализируемой пробы.

Примечание - Ниже приведены условия хроматографического анализа, которые обеспечивают удовлетворительное качество хроматографического разделения и количественного определения (см. рисунок A.1). Для информации об альтернативных системах ВЭЖХ см. таблицу C.1.

--------------------------------

<2> LC-18-DB - пример подходящей продукции, имеющейся в продаже. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой CEN указанной продукции.

В систему ВЭЖХ вводят равные соответствующие объемы (до 100 мм³) раствора рибофлавина (см. 4.21.2) <*>, а также раствора анализируемой пробы (см. 6.3.3). Для выполнения количественного определения методом внешнего стандарта интегрируют площади пиков или определяют высоты пиков пробы, результаты сравнивают с соответствующими значениями стандартного раствора.

--------------------------------

<*> Исправлена ошибка, допущенная в EN 14152:2014: заменена ссылка "4.20.2" на "4.21.2".

Проверяют линейность градуировочной зависимости.

Результат определения вычисляют, используя градуировочный график, или соответствующие программы системы обработки данных, или приведенный ниже упрощенный способ вычисления. Рассчитывают массовую долю витамина B₂ w, мг/100 г пробы, по формуле

где A_S - площадь или высота пика рибофлавина на хроматограмме раствора анализируемой пробы (см. 6.3.3), выраженные в единицах площади или высоты;

A_ST - площадь или высота пика рибофлавина на хроматограмме раствора рибофлавина (см. 4.21.2) <*>, выраженные в единицах площади или высоты;

V - общий объем раствора анализируемой пробы (см. 6.3.3), см³;

V_E - объем экстракта пробы (см. 6.3.2), см³;

V_A - объем аликвоты, используемый для разбавления (см. 6.3.3), см³;

- массовая концентрация рибофлавина в растворе рибофлавина (см. 4.21.2) <*>, мкг/см³;

m_S - масса пробы, г;

1 000 - коэффициент пересчета микрограммов в миллиграммы;

100 - коэффициент пересчета массовой доли на 100 г;

E - массовая доля рибофлавина, присутствующего в ферменте, мг/100 г;

m_E - масса фермента, используемого в анализе, г;

Результат определения содержания витамина B₂, мг/100 г, представляют в пересчете на рибофлавин.

Данные прецизионности для метода частично основываются на данных различных методов ВЭЖХ, применяемых для определения рибофлавина в ходе международного сравнительного исследования, организованного Европейской комиссией в рамках Программы стандартных измерений и испытаний на пробах цельнозерновой муки (CRM 121), сухого молока/сухого молока, полученного методом распылительной сушки (CRM 421), смеси лиофилизированных овощей (CRM 485) и лиофилизированной свиной печени (CRM 487). Статистические данные, полученные в ходе исследования, приведены в таблице B.1 приложения B. Кроме того, данные прецизионности включают результаты совместного французского исследования проб раствора для энтерального питания, пищевой продукции для детского питания с овощами, сухого молока, цельнозерновой муки с фруктами, дрожжей, продуктов переработки зерна, шоколадного порошка и биологически активной добавки к пище. Результаты, полученные в ходе исследования, приведены в таблицах B.2 и B.3.

Абсолютная разность между двумя независимыми результатами испытаний, полученными при исследовании идентичного анализируемого материала одним и тем же оператором, использовавшим одно и то же оборудование в пределах самого короткого промежутка времени, не должна превышать предел повторяемости r более чем в 5% случаев.

Значения для рибофлавина:

Абсолютная разность между двумя независимыми результатами испытаний, полученными при исследовании идентичного анализируемого материала в двух лабораториях, не должна превышать предел воспроизводимости R более чем в 5% случаев.

Значения для рибофлавина:

Протокол испытания должен соответствовать требованиям EN ISO/IEC 17025 [17] и содержать следующие данные:

a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;

b) ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;

c) дату и время отбора проб (если известно);

d) дату получения пробы;

e) дату проведения испытания;

f) результаты и единицы измерения, в которых выражены результаты;

g) любые особенности, которые наблюдались в ходе проведения испытания;

h) любые операции, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые в качестве дополнительных, которые могли повлиять на результаты.

Данные, приведенные в таблице B.1, получены в результате межлабораторных испытаний [9], проведенных в соответствии с Руководством по аттестации образцов сравнения (EU SMT Certification Study Guidelines). Исследование было организовано Институтом исследования пищевой продукции, г. Норвич, Великобритания (Institute of Food Research, Norwich, UK), по заданию Бюро эталонов Европейского сообщества (EU Community Bureau of Reference). Данные, приведенные в таблицах B.2 и B.3, были получены в ходе межлабораторного испытания во Франции [10].

Примечание - В результате рассматриваемого международного сравнительного исследования данные были получены с использованием установленных методов и являются идентичными собственным систематическим процедурам анализа участвующих лабораторий с системами ВЭЖХ, описанными в приложении C.

Удовлетворительное качество хроматографического разделения и количественного определения обеспечивается при соблюдении следующих условий хроматографического анализа [2].

--------------------------------

<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".