"ГОСТ ISO 23275-2-2020. Межгосударственный стандарт. Жиры и масла животные и растительные. Эквиваленты масла какао в масле какао и шоколаде. Часть 2. Количественное определение эквивалентов масла какао"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 20.06.2024 N 862-ст)

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2020 г. N 131-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 20 июня 2024 г. N 862-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 23275-2-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2025 г. с правом досрочного применения

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 23275-2:2006 "Жиры и масла животные и растительные. Эквиваленты масла какао в масле какао и шоколаде. Часть 2. Количественное определение эквивалентов масла какао" ("Animal and vegetable fats and oils - Cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate - Part 2: Quantification of cocoa butter equivalents", IDT).

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 11 "Животные и растительные жиры и масла" Технического комитета ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

"Эквиваленты масла какао" - это общий термин для жиров, используемых для замены масла какао в шоколаде. Они очень близко напоминают масло какао по своему химическому составу и физическим свойствам, в результате чего их количественное определение (в некоторых случаях и качественное определение) является очень сложным. Эквиваленты масла какао по определению должны быть жирами с низким содержанием лауриновой кислоты, высоким содержанием симметричных мононенасыщенных триацилглицеролов (триглицеридов) типа 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерола, 1-пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерола и 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерола, способными смешиваться с маслом какао и получаемыми только путем очистки и фракционирования.

В соответствии с [1] в Европейском союзе по отдельности или в смесях могут использоваться следующие растительные жиры, полученные из приведенных ниже растений:

- масло мадуки длиннолистной (иллипе), борнейский жир или жир тенгкаванг (вид рода Shorea);

- пальмовое масло (Elaeis guineensis, Elaeis olifera);

- сал (шорея кистевая) (Shorea robusta);

- масло плодов масляного дерева (ши) (Butyrospermum parkii);

- масло кокум (Garcinia indica);

- масло косточек манго (Mangifera indica).

В ГОСТ ISO 23275-1 приведен метод качественного определения этих жиров (исключение делается только для образцов чистого масла иллипе) в масле какао и шоколаде. В настоящем стандарте приведен метод, позволяющий провести надежное количественное определение этих жиров при концентрации 5%, соответствующей законодательно установленному пределу, утвержденному в [1].

Для более удобного пользования серией стандартов ISO 23275 был разработан набор инструментальных средств под названием CoCal-1. CoCal-1 состоит из валидированных методов качественного и количественного определения эквивалентов масла какао в шоколаде, сертифицированного стандартного образца масла какао (IRMM-801) для калибровки аналитических инструментов и электронной оценочной таблицы в Microsoft Excel для вычисления окончательного результата. При проведении качественного и количественного определения эквивалентов масла какао требуется откалибровать газохроматографическую систему с использованием IRMM-801, разделить триглицериды анализируемого образца и применить электронную оценочную таблицу для последующей обработки данных.

Настоящий стандарт устанавливает метод количественного определения эквивалентов масла какао (ЭМК) в масле какао (МК) и шоколаде путем разделения триацилглицеролов капиллярной газожидкостной хроматографией высокого разрешения с последующей оценкой данных при помощи регрессионного анализа методом частных наименьших квадратов.

Примечание - Наличие ЭМК в МК и шоколаде ниже уровня 0,6% (при условии, что содержание жиров в шоколаде составляет 30%) может быть определено по методу, приведенному в ISO 23275-1. Различие методов состоит в количестве триацилглицеролов, используемых для обработки данных, и в математической оценке данных. Наличие ЭМК устанавливают при помощи линейного регрессионного анализа, применяемого к соотношениям трех основных триацилглицеролов анализируемого жира. Количественное содержание ЭМК оценивают при помощи регрессионного анализа методом частных наименьших квадратов, применяемого к соотношениям пяти основных триацилглицеролов.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 эквиваленты масла какао (cocoa butter equivalents): Жиры, определяемые в масле какао и шоколаде в соответствии с методом, описанным в настоящем стандарте.

2.2 содержание эквивалентов масла какао в масле какао (cocoa butter equivalents content of cocoa butter): Массовая доля веществ в масле какао, определяемых по методу, установленному в настоящем стандарте.

Примечание - Выражается в г/100 г масла какао.

2.3 содержание эквивалентов масла какао в шоколаде (cocoa butter equivalents content of chocolate): Массовая доля веществ в шоколаде, определяемых по методу, установленному в настоящем стандарте.

Примечание - Выражается в г/100 г шоколада.

Масло какао или жир, выделенные из шоколада, разделяются при помощи газовой хроматографии высокого разрешения на триацилглицеролы в соответствии с их молекулярной массой и степенью ненасыщенности. Количественное содержание ЭМК оценивают при помощи регрессионного анализа методом частных наименьших квадратов, применяемого к отдельным триацилглицеролам анализируемого жира.

Используются только реактивы признанного аналитического класса, если не указано иное.

4.1 Сертифицированный референсный материал (СРМ) масла какао IRMM-801 [2] для калибровки и проверки пригодности системы.

4.2 Растворитель жиров, не содержащий хлора (например, диэтиловый эфир, н-гептан, изооктан).

4.3 Соляная кислота концентрацией 8 моль/л.

4.4 Гофрированный бумажный фильтр <1> диаметром 15 см.

--------------------------------

<1> Средний бумажный фильтр S&S 589 - пример коммерчески доступного изделия.

5.1 Аналитические весы с ценой деления 0,1 мг.

5.2 Сушильный шкаф, способный поддерживать температуру 55 °C. Может использоваться сухой нагревательный блок.

5.3 Пищевой измельчитель <2> (т.е. кухонный блендер с расположением двигателя выше принимающего контейнера для предотвращения плавления образцов).

--------------------------------

<2> Philips HR2833 - пример коммерчески доступного изделия.

Данная информация приведена для удобства применения настоящего стандарта, не является рекламной поддержкой ISO данных изделий и не исключает возможности использования других изделий с аналогичными свойствами.

5.4 Мерные колбы вместимостью 20 см³.

5.5 Пипетки вместимостью 1 см³.

5.6 Микрошприц с максимальным объемом 10 мм³, ценой деления 0,1 мм³ или автоматический пробоотборник.

5.7 Газовый хроматограф (ГХ), оборудованный системой холодного ввода в колонку и пламенно-ионизационным детектором (ПИД).

Могут использоваться альтернативные системы ввода (например, инжектор с делением потока, температурно-программируемый испаритель (ТПИ) или инжектор с подвижной иглой) при условии, что получаемые результаты идентичны указанным в 10.2.

Удовлетворительные разделение и детектирование достигаются при соблюдении следующих экспериментальных условий:

- кварцевая хроматографическая колонка: длина - от 25 до 30 м, внутренний диаметр - 0,25 мм, толщина пленки термостабильного 50%-ного фенилметилполисилоксана - от 0,1 до 0,15 мкм;

- температурная программа: начальная температура - 100 °C, скорость нагрева - 30 °C/мин, конечная температура - 340 °C;

- газ-носитель: гелий или водород (чистота >= 99,999%).

Примечание - Подходящие колонки и альтернативные экспериментальные условия, использованные в международном совместном исследовании, приведены в приложении А. Рабочие условия могут быть изменены для получения оптимального разделения триацилглицеролов масла какао.

5.8 Хроматографическая система сбора и обработки данных.

5.9 Аппарат Сокслета со стандартными конусными соединениями и вместимостью сифона примерно 100 см³ (экстракционная гильза 33 x 88 мм), колбой Эрленмейера на 250 см³ и температурно-регулируемым кожухом.

Репрезентативную пробу направляют в лабораторию без повреждения или изменения в ходе транспортирования и хранения.

Отбор образцов не является частью метода, описанного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора образцов приведен в [3].

До вскрытия и использования СРМ масла какао (см. 4.1) ампулу нагревают в сушильном шкафу (см. 5.2) до плавления содержимого. После получения прозрачного раствора перемешивают содержимое путем переворачивания ампулы в течение не менее 20 с. Затем ампулу вскрывают и переносят содержимое в чистую виалу, которую плотно закрывают и хранят в прохладном месте для последующего использования в токе азота.

Охлаждают примерно 200 г шоколада до затвердевания и натирают на мелкие гранулы при помощи механического устройства (см. 5.3). Тщательно перемешивают и хранят в плотно закрытой емкости в холодильнике.

8.1.1 Выделяют жир и определяют его содержание в образце шоколада (приготовленного по 7.2) путем экстрагирования при помощи аппарата Сокслета [4], как указано ниже. В мензурку вместимостью от 300 до 500 см³ взвешивают от 4 до 5 г шоколада. Медленно, при помешивании, прибавляют 45 см³ кипящей воды для получения гомогенной суспензии. Добавляют 55 см³ HCl (см. 4.3) и обезжиренные центры кипения, затем перемешивают. Накрывают часовым стеклом, медленно доводят раствор до кипения и кипятят в течение 15 мин. Часовое стекло промывают 100 см³ воды. Фильтруют раствор через бумажный фильтр средней плотности (см. 4.4) или аналогичный, три раза промывают мензурку водой. Продолжают промывку до тех пор, пока последняя порция фильтрата не будет содержать ионы хлора. Помещают фильтр с образцом в обезжиренную экстракционную гильзу и сушат в течение 2 ч в маленькой мензурке при температуре 100 °C. Мензурку закрывают стекловатой.

В колбу Эрленмейера вместимостью 250 см³ помещают несколько обезжиренных центров кипения и сушат в течение 1 ч при температуре 100 °C. Охлаждают колбу до комнатной температуры в эксикаторе, затем взвешивают ее. Помещают экстракционную гильзу с высушенным образцом в аппарат Сокслета (см. 5.9), закрепив ее при помощи спиральных или стеклянных держателей. Промывают мензурки, использованные для гидролиза и сушки, а также часовое стекло тремя порциями растворителя по 50 см³, добавляют смыв в экстракционную гильзу. Гидролизованный образец подвергают экстракции в течение 4 ч, корректируя температуру таким образом, чтобы проводилось более 30 экстракционных циклов. Снимают колбу и выпаривают растворитель. Сушат колбу при температуре 102 °C до постоянной массы (1,5 ч). Охлаждают колбу в эксикаторе до комнатной температуры, затем взвешивают ее. Массу считают постоянной, если в последовательных периодах сушки ее потеря составляет менее 0,05%. Расхождения между параллельными определениями жира должны быть в пределах 0,1%.

Общее содержание жира в шоколаде c_fat, г/100 г, вычисляют по формуле

где m_fat - общее количество жира, полученное при экстракции, г;

m - масса анализируемой порции шоколада, г.

Могут использоваться альтернативные процедуры экстрагирования (например, ускоренное экстрагирование растворителем, сверхкритическим углекислым газом или микроволновая экстракция) при условии, что получаются идентичные результаты.

Содержание жира округляют до двух десятичных знаков.

Анализируемые образцы [масло какао; жир, экстрагированный из шоколада; СРМ масла какао (см. 4.1)] подогревают в сушильном шкафу (см. 5.2) до полного плавления. Если расплавленный образец содержит осадок, то образец фильтруют внутри шкафа для получения чистого фильтрата. Пипетки или аналогичное оборудование, используемые для переноса образца в процессе взвешивания, нагревают примерно до температуры 55 °C в сушильном шкафу (см. 5.2), чтобы избежать частичного фракционирования жиров.

Взвешивают примерно 0,2 г анализируемого образца, помещают в мерную колбу на 20 см³ (см. 5.4), доводят до отметки подходящим растворителем для жиров (см. 4.2). 1 см³ полученного раствора переносят пипеткой (см. 5.5) в другую мерную колбу вместимостью 20 см³ и доводят до метки тем же растворителем.

Инжектируют от 0,5 до 1,0 мкл конечного анализируемого раствора (концентрация анализируемого образца 0,5 мг/см³) в хроматографическую систему высокого разрешения, используя систему холодного ввода на колонку.

Могут использоваться альтернативные значения объема и концентрации пробы, а также инжекторы при условии, что система детектирования дает линейную зависимость и выполняются требования пригодности системы (см. 10.2).

Идентификацию пяти основных триацилглицеролов [1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерол (POP), 1-пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерол (POS), 1-пальмитоил-2,3-диолеоилглицерол (POO), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерол (SOS) и 1-стеароил-2,3-диолеоилглицерол (SOO)] анализируемого образца осуществляют путем сравнения их времени удерживания со временем удерживания триацилглицеридов СРМ масла какао (см. 4.1). В целом триацилглицеролы выходят в порядке увеличения количества атомов углерода и увеличения числа двойных связей при одинаковом числе атомов углерода. Порядок выхода триацилглицеролов масла какао приведен на рисунке А.1 (приложение А).

Определяют факторы отклика триацилглицеролов POP, POS, POO, SOS и SOO инжекцией раствора СРМ масла какао при экспериментальных условиях, идентичных тем, которые используют при анализе образцов. Вычисляют процентное содержание каждого из пяти триацилглицеролов по формулам:

где P_ref,i - процент i-го триацилглицерола в СРМ масла какао (по площадям пиков);

A_ref,i - площадь пика i-го триацилглицерола в СРМ масла какао;

- сумма площадей пиков POP, POS, POO, SOS и SOO в СРМ масла какао;

F_i - фактор отклика i-го триацилглицерола в СРМ масла какао;

w_ref,i - значение массовой доли i-го триацилглицерола в СРМ масла какао, %, указанное в сертификате [2].

Результаты округляют до двух десятичных знаков.

Вычисляют процентное содержание триацилглицеролов POP, POS, POO, SOS и SOO в тестируемом образце по формуле

где w_test,i - массовая доля i-го триацилглицерола в тестируемом образце, %;

A_test,i - площадь пика соответствующего i-го триацилглицерола в тестируемом образце;

F_i - фактор отклика i-го триацилглицерола, определенный по 9.1.

Результаты округляют до двух десятичных знаков.

Содержание ЭМК в масле какао c_CBE,CB, г/100 г, рассчитывают с использованием регрессионного анализа методом частных наименьших квадратов [формула (5)] по нормализированному содержанию пяти основных триацилглицеролов, т.е. содержание POP + содержание POS + содержание POO + содержание SOS + содержание SOO = 100%, определенному по формуле (4)

Результаты округляют до двух десятичных знаков, г/100 г.

Формула (5) была выведена с использованием калибровочного набора из 798 смесей МК/ЭМК, содержащих 10%, 15% и 20% ЭМК. Обязательное использование СРМ масла какао для калибровочных целей и проверки пригодности системы обеспечивает высокую сопоставимость результатов между отдельными испытательными лабораториями и стандартизирует разработанный метод [5].

В 99% случаев при использовании имеющихся в продаже жиров для формирования смеси ошибка определения не превышает +/- 2,60% относительно масла какао.

Содержание ЭМК в шоколаде c_CBE,choc, г/100 г, рассчитывают по формуле

где c_fat - общее содержание жира в шоколаде, г/100 г, определенное по 8.1;

c_CBE,CB - содержание ЭМК в масле какао, г/100 г, определенное по 9.3.

Результаты округляют до двух десятичных знаков.

В 99% случаев при использовании имеющихся в продаже жиров для формирования смеси ошибка определения не превышает +/- 0,78% относительно шоколада (при допущении, что содержание жиров в шоколаде составляет 30%).

Процедура хроматографического анализа, помимо других факторов, зависит от оборудования, типа, степени износа, производителя колонки, способа введения анализируемого раствора, объема инжектируемой пробы и детектора. Могут использоваться колонки различной длины и производителей, а также варьироваться объемы инжектируемых проб, если выполняются требования пригодности системы (см. 10.2).

Для проверки пригодности хроматографической системы должен использоваться СРМ масла какао (см. 4.1).

a) Разрешение

Хроматографическая система должна быть способной разделять критические пары POS/POO и SOS/SOO с разрешением не менее 1,0. В противном случае условия хроматографирования (например, объем инжектируемой пробы, температура колонки, скорость потока газа-носителя) должны быть оптимизированы.

b) Определение факторов отклика детектора

Для проверки предположения, что факторы отклика пламенно-ионизационного детектора для триацилглицеролов незначительно отличаются от единицы, необходимо проанализировать СРМ масла какао, применяя стандартные условия хроматографирования. Опыт показывает, что для нормально функционирующей системы факторы отклика пяти основных триацилглицеролов (POP, POS, POO, SOS, SOO) варьируются в диапазоне от 0,80 до 1,20.

Результаты межлабораторных испытаний относительно прецизионности метода приведены в приложении А. Значения, полученные в ходе проведенных межлабораторных испытаний, не могут быть применимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличным от указанных.

Абсолютная разность между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными при использовании одного метода и идентичного анализируемого материала в одной и той же лаборатории тем же оператором на одном и том же оборудовании в течение короткого промежутка времени, не более чем в 5% случаев (при доверительной вероятности P = 0,95) будет больше, чем 0,721 г/100 г относительно масла какао и 0,216 г/100 г относительно шоколада (при допущении, что содержание жиров в шоколаде составляет 30%).

Значения предела повторяемости r, полученные в ходе валидационных исследований, приведены в таблицах А.2 - А.4 (приложение А).

Абсолютная разность между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными при использовании одного метода и идентичного анализируемого материала в разных лабораториях разными операторами с использованием различного оборудования, не более чем в 5% случаев будет больше, чем 1,719 г/100 г относительно масла какао и 0,516 г/100 г относительно шоколада (при допущении, что содержание жиров в шоколаде составляет 30%).

Значения предела воспроизводимости R, полученные в ходе валидационных исследований, приведены в таблицах А.2 - А.4 (приложение А).

Протокол испытаний должен содержать:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

b) метод отбора образцов, если известен;

c) использованный метод тестирования со ссылкой на настоящий стандарт;

d) все подробности работы, не указанные в настоящем стандарте или считающиеся дополнительными, вместе с подробностями любых инцидентов, которые могут повлиять на результаты испытаний;

e) полученные результаты испытаний или конечный полученный результат, если проверялась повторяемость.

Метод был валидирован в 2002 году в ходе европейских межлабораторных испытаний, в которых принимали участие 13 лабораторий [6], [7]. Метод был валидирован для уровней ЭМК примерно 5% ЭМК в шоколаде, т.е. примеси составляли 15, 25 и 30 г ЭМК/100 г масла какао, что соответствовало 4,5, 7,5 и 9,0 г ЭМК/100 г шоколада (при допущении, что содержание жиров в шоколаде составляло 30%).

В таблице А.1 приведены приемлемые газохроматографические условия <1>. Пример профиля триацилглицеролов ЭМК масла какао приведен на рисунке А.1. Данные прецизионности приведены в таблицах А.2 - А.4.

--------------------------------

<1> Указанные типы колонок являются примерами коммерчески доступного изделия. Данная информация приведена для удобства применения настоящего стандарта, не является рекламной поддержкой ISO данных изделий и не исключает возможность использования других изделий с аналогичными свойствами.

Экспериментальные условия

Сокращения

--------------------------------

<1> Официальный перевод этого стандарта находится в национальных фондах стандартов.