"ГОСТ ISO 10130-2016. Межгосударственный стандарт. Продукция косметическая. Обнаружение и определение содержания N-нитрозодиэтаноламина (NDELA) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), пост-колоночным фотолизом и получением производных"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 27.12.2023 N 1681-ст)

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Госстандартом Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протокол от 25 мая 2016 г. N 88-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2023 г. N 1681-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10130-2016 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2025 г. с правом досрочного применения

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 10130:2009 "Косметические средства. Аналитические методы. Нитрозамины. Обнаружение и определение N-нитрозодиэтаноламина (NDELA) в косметике методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC), пост-колоночным фотолизом и получением производных" ["Cosmetics - Analytical methods - Nitrosamines. Detection and determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) in cosmetics by HPLC, post-column photolysis and derivatization", IDT].

Международный стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации ISO/TC 217 "Косметика" Международной организации по стандартизации (ISO).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (подраздел 3.6)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Окружающая среда, продукты питания, средства личной гигиены могут выступать в качестве источников N-нитрозаминов, с которыми непосредственно взаимодействует человек. В ходе исследований было выявлено, что N-нитрозамины проявляют потенциальную канцерогенную активность в отношении некоторых видов животных, в связи с чем минимизация воздействия N-нитрозаминов на организм человека признана одной из важнейших целей сохранения здоровья людей. Среди N-нитрозаминов N-нитрозодиэтаноламин (NDELA) признан в качестве потенциального загрязнителя косметической продукции.

В связи с этим было разработано несколько аналитических методов обнаружения и определения присутствия NDELA в косметической продукции. Примерами таких методов являются метод газовой хроматографии/термоэнергетический анализ, жидкостная хроматография высокого разрешения в сочетании либо с масс-спектрометрическим определением, либо с фотолизом и колориметрическим количественным определением. В последнем методе применяются новейшие технологии, обеспечивающие максимальную точность определения NDELA, позволяющие минимизировать риск искусственного образования NDELA в анализируемой продукции и провести точное количественное определение.

Метод, приведенный в данном стандарте, включает в себя разделение и определения содержания следовых количеств N-нитрозодиэтаноламина (NDELA) в ингредиентах косметической продукции и матрицах косметической продукции при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с пост-колоночным фотолизом и получением производных.

В основу настоящего стандарта положены результаты совместных исследований [2] семи лабораторий, опубликованные в 2006 году. Критерии достоверности приведены в [2].

Настоящий стандарт устанавливает метод обнаружения и определения содержания N-нитрозодиэтаноламина (NDELA) в косметической продукции и сырье для ее изготовления, с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) с пост-колоночным фотолизом и получением производных.

Данный метод не применяют для обнаружения и/или определения содержания других нитрозаминов, а также для обнаружения и/или определения содержания NDELA в продукции, не являющейся косметической продукцией или сырьем для ее изготовления.

Данный метод применяют для анализа косметической продукции в том случае, если загрязнение продукции NDELA возможно посредством ингредиентов, либо образование NDELA возможно в результате смешения ингредиентов, метод является альтернативой методу, изложенному в [1].

Данный метод не применяется к матрицам, содержащим окислительные красители.

Проводят экстрагирование NDELA из проб косметической продукции, используя воду. Если пробы не диспергируются в воде, извлечение выполняют посредством твердофазной экстракции (ТФЭ, см. 5.3.3) с использованием картриджа C18, либо жидкостной экстракции, используя дихлорметан в качестве растворителя (извлечение ДХМ, см. 6.3.2). Полученные экстракты анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) с пост-колоночным фотолизом и получением производных. NDELA отделяют от косметической матрицы с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии. В результате фотолиза под воздействием ультрафиолетового излучения N-нитрозная связь разрывается с образованием нитрит-иона. Согласно реакции Грисса нитритная функциональная группа диазотируется сульфаниламидом в кислой среде, а затем соединяется с N-(1-нафтил) этилендиамин дигидрохлоридом (NED), образуя азокраситель пурпурного цвета, который количественно определяют спектрофотометрическим методом при максимальной длине волны, , равной 540 нм (см. приложение B).

Присутствие NDELA может быть подтверждено повторением анализа без стадии фотолиза (при этом не образуется нитрит-ион, поскольку не происходит разрыв N-нитрозной связи). Отсутствие хроматографического пика при времени удерживания, соответствующем NDELA на хроматограмме, подтверждает, что пик, наблюдаемый при первом анализе, соответствует NDELA.

3.1 Метанол, пригодный для HPLC анализа.

3.2 Вода, пригодная для HPLC анализа.

3.3 Дихлорметан, пригодный для HPLC анализа.

3.4 N-Нитрозодиэтаноламин, известной степени чистоты, превышающей 95%. CAS No [116-57-7].

3.5 Ортофосфорная кислота, 85%, аналитической степени чистоты.

3.6 Ацетат аммония, аналитической степени чистоты.

3.7 Раствор ацетата аммония, 1 моль/дм³.

Растворяют 77,08 г ацетата аммония (3.6) в 1,0 дм³ воды (3.2).

3.8 Раствор ацетата аммония, 0,02 моль/дм³.

Берут 20 см³ раствора ацетата аммония с концентрацией 1 моль/дм³ (3.7) и доводят объем водой (3.2) до 1 дм³.

3.9 N-(1-Нафтил) этилендиамин дигидрохлорид, известной степени чистоты, превышающей 98%. CAS No. [1465-25-4].

Данный реактив должен храниться в герметично укупоренной упаковке в защищенном от света месте.

3.10 Сульфаниламид, известной степени чистоты, превышающей 99%. CAS No. [63-74-1].

Растворяют в мерной колбе 0,25 г N-(1-нафтил) этилендиамин дигидрохлорида (3.9) в воде (3.2), доводят объем до 250 см³. Растворяют 4,0 г сульфаниламида (3.10) в 250 см³ 5%-ного (масса/объем) водного раствора ортофосфорной кислоты, приготовленного из ортофосфорной кислоты со степенью чистоты 85% (3.5). Смешивают реагенты в склянке из стекла янтарного цвета. Смесь хранят в защищенном от света месте.

Смесь пригодна к использованию в течение пяти дней после приготовления и должна оставаться бесцветной при хранении при температуре от 2 °C до 8 °C.

Используются стандартные лабораторные стеклянная посуда и оборудование, а также:

4.1 Механический смеситель или смеситель <1>.

--------------------------------

<1> Аппаратура компаний , , , , Waters или , Sep , и Beam является примером продукции, имеющейся в продаже. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанной продукции со стороны ISO.

4.2 Стеклянные виалы для HPLC вместимостью 20 см³ с навинчивающейся крышкой .

4.3 Полипропиленовая микропробирка вместимостью 1,5 см³ для центрифугирования.

4.4 Смесительный тройник с малым мертвым объемом.

4.5 Система для проведения твердофазной экстракции, применяемая для проведения твердофазной экстракции (ТФЭ) проб (например, <1> или <1>).

4.6 Центрифуга, способная развивать ускорение не менее 20000 g с программируемым температурным режимом.

4.7 Колонка для твердофазной экстракции, например Sep <1> с картриджами C18 Waters или <1> C18-6 см³, с 500 мг обращенно-фазного октадецилсилана, привитого к силикагелю, со средним диаметром частиц (APD), равным 40 мкм, .

4.8 Аппаратура для жидкостной хроматографии высокого разрешения, включающая: демпфер пульсирующий, емкость для элюента, насос, систему ввода пробы, систему обработки данных, т.е. интегратор, соединенный с детектором излучения УФ/видимого диапазона, оснащенным вольфрамовой лампой с чувствительностью 0,001 AUFS или 0,0005 AUFS (absorbance units full scan - оптических единиц полного сканирования).

4.9 Насос для подачи реактива Грисса: насос низкого давления без пульсации, также допускается использовать второй насос жидкостного хроматографа (LC) с такими же характеристиками, как у указанного ранее.

4.10 Модуль фотолиза: фотохимический реактор, включающий тефлоновую реакционную спираль "высокого давления", длиной 5 м (или 6 м) и внутренним диаметром 0,3 мм, располагающуюся вокруг УФ-лампы низкого давления, испускающей излучение при длине волны 254 нм (например, фотореакторы Beam <1>).

--------------------------------

<1> Аппаратура компаний , , , , Waters или , Sep , и Beam является примером продукции, имеющейся в продаже. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанной продукции со стороны ISO.

4.11 Пост-колоночный модуль или термостат, оборудованный тефлоновой реакционной спиралью объемом 1 см³, и смесительным тройником с малым мертвым объемом. Спираль должна быть скручена определенным образом, с целью предотвращения размывания хроматографических зон [3].

4.12 Хроматографическая аналитическая колонка с обращенной фазой C18, например, <1> ODS II (октадецилсилана), защищенная предколонкой.

Хроматографическая колонка

Предколонка

Соединительные трубки, установленные после клапана ввода пробы, должны быть настолько короткими, насколько это возможно.

Хроматографическую колонку напрямую подсоединяют к системе ввода пробы, снабженной пробоотборной петлей вместимостью 50 мм³ или 100 мм³. Фотохимический реактор (1), снабженный открытой трубчатой реакционной спиралью и ультрафиолетовой лампой (испускающей излучение при длине волны 254 нм), подсоединяют к выходу хроматографической колонки. Выход фотохимического реактора подсоединяют к одному из ответвлений смесительного тройника (2). Второе ответвление тройника подсоединяют к насосу, подающему реагент для получения производных (3). Третье ответвление подсоединяют к трубчатому реактору, включающему тефлоновую трубку, расположенную в пост-колоночном модуле (4). Выход трубчатого реактора подсоединяют к детектору УФ/видимого излучения (спектрофотометр) (5). Пики элюированных веществ контролируют с помощью микрокомпьютера, оснащенного имеющимся в продаже стандартным программным обеспечением.

Готовят основной градуировочный раствор (S₀) NDELA в воде с концентрацией 1 мг/см³. Данный раствор хранят не более 6 мес в защищенном от света месте при температуре от 2 °C до 8 °C.

Из основного градуировочного раствора (S₀) разбавлением в воде (1:100) готовят градуировочный раствор с концентрацией 10 мкг/см³ (S₁). Повторное разбавление S₁ в соотношении 1:100 выполняют для получения градуировочного раствора (S₂) с концентрацией 100 нг/см³. Все приготовленные растворы хранят не более недели в защищенном от света месте при температуре от 2 °C до 8 °C.

Последовательным разбавлением градуировочного раствора (S₂) водой готовят рабочие градуировочные растворы с концентрацией 1 нг/см³, 2 нг/см³, 5 нг/см³, 10 нг/см³ и 20 нг/см³ (см. рисунок A.1.) Данные растворы готовятся каждый день и хранятся в защищенном от света месте (см. таблицу 1).

Линейность калибровочной кривой проверяют в диапазоне концентраций от 1 нг/см³ до 100 нг/см³ (см. рисунок A.2).

Примеры типичных хроматограмм приведены на рисунках A.3 и A.4.

Если косметическая продукция диспергируется (растворяется) в воде, извлечение NDELA необходимо проводить при помощи твердофазной экстракции (ТФЭ) (см. 5.3.2).

Если косметическая продукция не диспергируется в воде, для извлечения используют дихлорметан (ДХМ) (см. 5.3.3).

Способность к диспергированию конкретной косметической продукции должна оцениваться при использовании соответствующего извлекающего агента. Извлечение NDELA из одной и той же продукции не допускается проводить при помощи ТФЭ и ДХМ одновременно; извлекающий агент должен выбираться исходя из его способности обеспечивать диспергирование. Продукция, которая не диспергируется в воде, должна подвергаться извлечению с использованием ДХМ.

Взвешивают приблизительно 2,0 г пробы в стеклянной виале (4.2) и записывают точную массу, диспергируют и доводят объем водой до 20 см³. Перемешивают в течение 15 мин в механическом смесителе или в течение 1 мин в смесителе . Центрифугируют в течение 10 мин (подготовка к ТФЭ).

Кондиционируют колонку твердофазной экстракции C18 сначала 3 см³ метанола, затем 3 см³ воды при расходе приблизительно 3,0 см³/мин. Не позволяют колонке высыхать.

Помещают 5 см³ подготовленной к ТФЭ пробы сверху картриджа C18 колонки твердофазной экстракции, первые 3 см³ раствора отбрасывают. Собирают последующие 2 см³ (при расходе приблизительно 3,0 см³/мин) в стеклянные виалы для HPLC.

Фильтруют собранный раствор через соответствующий фильтр (при необходимости).

Для приготовленных проб обоих типов анализируют полученный экстракт на наличие NDELA методом HPLC с применением УФ-фотолиза и реакции Грисса.

Реакционная система состоит из четырех индивидуальных частей:

a) хроматографическая система;

b) реактор пост-колоночного фотолиза;

c) химический реактор;

d) детектор (см. приложение C).

Строят калибровочную кривую, нанося на график концентрацию градуировочных растворов NDELA (см. 5.2.3) относительно их площади пика.

В случае количественного определения по калибровочной кривой коэффициент корреляции должен составлять не менее 0,990.

См. [2].

Для определения концентрации NDELA в пробе применяют метод внешнего стандарта.

Определяют методом наименьших квадратов линейную регрессионную зависимость площадей пиков от концентрации NDELA в соответствующем стандартном растворе, выраженной в нанограммах на см³ (нг/см³).

Линейная зависимость увеличивающейся концентрации NDELA в стандартных растворах (выраженной в нанограмм на см³) от соответствующей ей площади пика выражается следующим образом:

где a - наклон линии регрессии;

b - отрезок, отсекаемый на оси Y;

y - это площадь пика NDELA на хроматограмме, полученной для анализируемого экстракта пробы.

Массовую долю NDELA в испытуемой косметической продукции, w, выраженную в нг/г, вычисляют следующим образом:

где - концентрация NDELA в экстракте пробы, нг/см³;

S_F - площадь пика NDELA, содержащегося в экстракте пробы;

b - отрезок, отсекаемый на оси Y;

a - наклон калибровочной кривой;

m - масса пробы косметической продукции, г;

V - 20 см³ - для ТФЭ (твердофазной экстракции),

4 см³ - для ДХМ (дихлорметана);

w - массовая доля NDELA в испытуемой косметической продукции, нг/г.

Протокол испытания должен содержать следующую информацию:

a) ссылку на настоящий стандарт;

b) идентификационные данные испытуемой продукции;

c) дату и метод отбора проб (если эта информация известна);

d) дату получения пробы лабораторией;

e) дату проведения испытания;

f) результаты испытания и единицы, в которых выражены эти результаты;

g) метод извлечения;

h) любые особенности, наблюдаемые при испытании;

i) все действия, не предусмотренные методом, или действия, которые могли повлиять на результат.

Ось X - концентрация NDELA нг/см³;

Ось Y - площадь пика NDELA

Ось X - концентрация NDELA нг/см³;

Ось Y - площадь пика NDELA

X - время анализа, мин;

a - хроматограмма стандартного раствора NDELA с концентрацией 1 нг/см³;

b - хроматограмма стандартного раствора NDELA с концентрацией 5 нг/см³

X - время анализа, мин;

a - хроматограмма стандартного раствора NDELA с концентрацией 100 нг/см³;

b - хроматограмма стандартного раствора NDELA с концентрацией 100 нг/см³, не прошедшего стадию фотолиза

X - коэффициент детерминации, R², мин;

a - хроматограмма стандартного раствора NDELA с концентрацией 5 нг/см³;

b - хроматограмма косметической продукции (концентрация 2 г/20 см³);

c - хроматограмма косметической продукции, в которую введен NDELA в концентрации 50 нг/см³ (концентрация - 2 г/20 см³)

1 - фотохимический реактор: 254 нм (см. 4.10);

2 - смесительный тройник с малым мертвым объемом (см. 4.4);

3 - насос подачи реактива Грисса (см. 4.9);

4 - реакционный модуль или термостат при 50 °C (см. 4.11);

5 - детектор (вольфрамовая лампа): 540 нм (см. 4.8);

6 - клапан отбора пробы;

7 - насос (HPLC);

8 - отходы