"ГОСТ EN 12822-2020. Межгосударственный стандарт. Продукция пищевая. Определение содержания витамина E методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Измерение альфа-, бета-, гамма- и дельта-токоферолов"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 30.09.2022 N 1032-ст)

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2020 г. N 131-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2022 г. N 1032-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 12822-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 марта 2023 г.

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 12822:2014 "Продукты пищевые. Определение содержания витамина E методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Измерение , , и " ("Foodstuffs - Determination of vitamin E by high performance liquid chromatography - Measurement of , , and ", IDT).

Европейский стандарт разработан Техническим комитетом CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN).

В стандарт внесены следующие редакционные изменения: единица измерения микролитр (мкл) заменена на кубический миллиметр (мм³); единица измерения миллилитр (мл) заменена на кубический сантиметр (см³); единица измерения литр (л) заменена на кубический дециметр (дм³).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочного европейского стандарта соответствующий ему межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВЗАМЕН ГОСТ EN 12822-2014

6 Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации не несет ответственности за патентную чистоту настоящего стандарта. Патентообладатель может заявить о своих правах и направить в национальный орган по стандартизации своего государства аргументированное предложение о внесении в настоящий стандарт поправки для указания информации о наличии в стандарте объектов патентного права и патентообладателе

Настоящий стандарт устанавливает методику измерения массовой доли , , и в пищевых продуктах, соответственно, приводятся ссылки на литературу по расчету и выражению содержания витамина E в единицах биологической активности. Дополнительную информацию можно получить в документах [1], [2], [3] и [4]. При применении метода, установленного в настоящем стандарте, невозможно дифференцировать RRR-токоферол и все рацемические токоферолы.

Предупреждение - Применение настоящего стандарта может быть связано с проведением опасных операций, использованием вредных веществ, опасного оборудования. Ответственность за соблюдение техники безопасности и установление необходимых ограничений при применении настоящего стандарта несет его пользователь.

Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина E в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение содержания витамина E осуществляется путем определения , , и . Метод прошел валидацию в двух межлабораторных испытаниях. В ходе первого межлабораторного испытания было проведено определение в маргарине и сухом молоке в диапазоне от 9,89 до 24,09 мг/100 г. В ходе второго межлабораторного испытания было проведено определение , , и в сухом молоке и и в овсяной муке в диапазоне от 0,057 до 10,2 мг/100 г .

Примечание 1 - Активность витамина E может быть рассчитана исходя из содержания токоферолов с учетом соответствующих условий, установленных в [1], [2], [3] и [4].

В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения)]:

EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

Определение содержания , , и осуществляют в растворе пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с фотометрическим (в ультрафиолетовой области) или, предпочтительнее, флуориметрическим детектированием. Для приготовления раствора пробы в большинстве случаев необходимо омыление материала пробы с последующей экстракцией. Определяемые соединения идентифицируют по значениям времени удерживания и количественно определяют при помощи внешнего стандарта по результатам измерений значений площадей и высот пиков. Допускается использование метода внутреннего стандарта, если соответствующие тесты по полноте обнаружения подтверждают, что поведение внутреннего стандарта и аналитов в процессе анализа тождественно, дополнительную информацию см. в [4] - [14].

Используют реактивы только требуемой аналитической чистоты и воду, соответствующую требованиям ISO 3696 (1 степень чистоты), если не предусмотрено иное.

4.1 Метанол.

4.2 Этанол абсолютный, объемная доля .

4.3 Этанол, .

4.4 Сульфат натрия безводный.

4.5 Раствор гидроксида калия для омыления, в подходящих концентрациях, например или , или спиртовые растворы, например 28 г KOH в 100 см³ с объемным отношением этанола и воды 9:1.

4.6 Антиоксиданты, например аскорбиновая кислота (АК), аскорбат натрия, пирогаллол, сульфид натрия Na₂S, гидрохинон или бутилгидрокситолуол (BHT).

4.7 Растворители и экстрактанты, например диэтиловый эфир (без пероксида), дихлорметан, петролейный эфир (пределы кипения от 40 °C до 60 °C), н-гексан, этилацетат или соответствующие смеси вышеперечисленных веществ.

4.8 Подвижная фаза ВЭЖХ, соответствующие смеси, выраженные в объемных долях, например 3% 1,4-диоксана или 0,5% 2-пропанола, 3% трет-бутилметилового эфира в н-гексане или н-гептане для нормально-фазовой хроматографии (НФ) или 1% - 10% воды в метаноле для обращенно-фазовой (ОФ) хроматографии.

Относительно подвижных фаз для альтернативных систем для ВЭЖХ - см. приложение C.

Фирма Calbiochem <*> реализует , и , реализуют различные поставщики. Массовая доля основного вещества в образцах сравнения токоферолов может колебаться от 90% до 100%, поэтому необходимо определить массовую концентрацию градуировочного раствора спектрофотометрическим методом в ультрафиолетовой области (см. 4.10.5).

--------------------------------

<*> Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного поставщика со стороны CEN. Допустимо применение аналогичной продукции при подтверждении ее эквивалентной результативности.

4.9.2 , M(C₂₉H₅₀O₂) = 430,7 г/моль, с массовой долей не менее 95%.

, M(C₃₁H₅₂O₃) = 472,7 г/моль можно также использовать в качестве стандартного вещества после омыления.

4.9.3 , M(C₂₈H₄₈O₂) = 416,7 г/моль, с массовой долей не менее 90%.

4.9.4 , M(C₂₈H₄₈O₂) = 416,7 г/моль, с массовой долей не менее 90%.

4.9.5 , M(C₂₇H₄₆O₂) = 402,6 г/моль, с массовой долей не менее 90%.

4.10.1 Основной раствор 

Растворяют 10 мг стандартного вещества (см. 4.9.2), взвешенного с точностью до 1 мг, в 100 см³ подходящего растворителя, например, н-гексана при использовании метода нормально-фазовой ВЭЖХ или метанола при использовании метода обращенно-фазовой ВЭЖХ.

4.10.2 Основной раствор 

Растворяют 10 мг стандартного вещества (см. 4.9.3), взвешенного с точностью до 1 мг, в 100 см³ подходящего растворителя, например, н-гексана при использовании метода нормально-фазовой ВЭЖХ или метанола при использовании метода обращенно-фазовой ВЭЖХ.

4.10.3 Основной раствор 

Растворяют 10 мг стандартного вещества (см. 4.9.4), взвешенного с точностью до 1 мг, в 100 см³ подходящего растворителя, например, н-гексана при использовании метода нормально-фазовой ВЭЖХ или метанола при использовании метода обращенно-фазовой ВЭЖХ.

4.10.4 Основной раствор 

Растворяют 10 мг стандартного вещества (см. 4.9.5), взвешенного с точностью до 1 мг, в 100 см³ подходящего растворителя, например, н-гексана при использовании метода нормально-фазовой ВЭЖХ или метанола при использовании метода обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Измеряют оптическую плотность основных растворов (см. 4.10.1 - 4.10.4) при соответствующей длине волны (см. таблицу 1) на спектрофотометре, пригодном для проведения измерений в ультрафиолетовой области (см. 5.1). Если в качестве растворителя используется н-гексан, то 10 см³ основного раствора помещают пипеткой в круглодонную колбу из темного стекла и отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре не выше 50 °C с использованием ротационного испарителя (см. 5.2). Остаток растворителя в колбе удаляют в токе азота, содержимое растворяют при перемешивании в 10 см³ метанола. Этот раствор используют для спектрофотометрических измерений.

Массовую концентрацию витамина E , мкг/см³, соответствующего , , или , вычисляют по формуле

где A - степень поглощения основного раствора соответствующего токоферола в метаноле;

- молярный коэффициент поглощения в метаноле на конкретной длине волны согласно таблице 1, дм³·моль^-1·см^-1;

M - молярная масса для соответствующего токоферола согласно таблице 1, г·моль^-1

Дополнительно к значению для , полученному при длине волны 292 нм, необходимо также измерить оптическую плотность при длине волны 255 нм (на минимуме). При данной длине волны значения не должны превышать E₂₅₅/E₂₉₂ = 0,18. В противном случае делают вывод о том, что произошло разложение раствора (дополнительную информацию см. в [15]).

4.11.1 Стандартный раствор 

10 см³ основного раствора (см. 4.10.1) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ и разбавляют до метки подходящим растворителем (например, для нормально-фазовой хроматографии - н-гексаном, для обращенно-фазовой - метанолом). Массовая концентрация стандартного раствора должна быть от 1 до 10 мкг/см³. При применении детектора в ультрафиолетовой области следует использовать более концентрированный раствор.

Стандартный раствор хранят в условиях защиты от света при температуре ниже 4 °C и проверяют в соответствии с требованиями, установленными в 4.10.5.

4.11.2 Стандартный раствор смеси , , , 

По 10 см³ каждого основного раствора (см. 4.10) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ и разбавляют до метки подходящим растворителем (например, для нормально-фазовой хроматографии - н-гексаном, для обращенно-фазовой - метанолом). Массовая концентрация каждого токоферола в стандартном растворе должна быть от 1 до 10 мкг/см³.

Стандартный раствор хранят в условиях защиты от света при температуре ниже 4 °C и проверяют в соответствии с требованиями, установленными в 4.10.5.

При проведении испытаний используют стандартное лабораторное оборудование, в частности, следующее.

5.1 Спектрофотометр для ультрафиолетовой области, пригодный для измерений оптической плотности при заданных длинах волн, снабженный кварцевыми кюветами, например, с толщиной слоя 1 см.

5.2 Ротационный испаритель в комплекте с водяной баней и устройством для создания вакуума.

Для сброса вакуума рекомендуется использовать азот.

5.3 Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, флуориметрического детектора (длина волны возбуждения 295 нм, длина волны регистрации 330 нм) и интегратора или системы обработки данных.

Допускается использование спектрофотометрического детектора, пригодного для проведения измерений при длине волны 292 нм. В этом случае градуировочные растворы и растворы проб должны быть более концентрированными. При использовании спектрофотометрического детектора вероятность помех со стороны матрицы пробы увеличивается.

5.4 Колонки для ВЭЖХ, для проведения испытаний применяют нормально-фазовые аналитические колонки, например, внутреннего диаметра от 4,0 до 4,6 мм, длиной от 100 до 250 мм, заполненные силикагелем с размером частиц 5 мкм. Допускается использование колонок других типоразмеров с другим размером частиц. При необходимости для достижения требуемой степени разделения пиков проводят корректировку условий хроматографического разделения. Критерием применимости аналитических колонок является разделение определяемых аналитов до базовой линии. Примерами подходящих сорбентов являются Si 60 <*>, Si <*>, Si <*> и 100 DIOL <*>. Могут также применяться аналитические колонки с обращенной фазой, например, C18, с размером частиц 5 мкм, внутренним диаметром от 4,0 до 4,6 мм, длиной от 100 до 250 мм. Примерами подходящих обращенно-фазовых сорбентов являются ODS <*> и ODS <*>. Большинство обращенно-фазовых сорбентов не разделяют и . Эти колонки, однако, могут использоваться для разделения и и получения значения суммы и .

--------------------------------

<*> Si 60, Si, Si и 100 DIOL, ODS и ODS являются примерами подходящих имеющихся в продаже продуктов. Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного поставщика со стороны CEN.

5.5 Устройство для фильтрования, пригодное для установки фильтров большого и малого размеров для фильтрования подвижной фазы и растворов проб, например, с диаметром пор 0,45 мкм.

Примечание 2 - Как правило, фильтрование подвижной фазы и растворов проб через мембранный фильтр перед вводом продлевает срок жизни колонок.

5.6 Фильтр для разделения фаз (применяется по выбору пользователя стандарта).

Испытуемую пробу гомогенизируют. Грубые материалы размалывают в подходящей мельнице и тщательно перемешивают. Чтобы исключить длительное воздействие высоких температур, пробу охлаждают.

Важно, чтобы растворы проб при хранении были защищены от света.

6.2.2.1 Растительные масла и жиры с низким содержанием влаги

Изложенный ниже способ применим только к пробам, содержащим неэтерифицированные токоферолы. В противном случае испытания проводят по 6.2.3.

Подготовленную к испытаниям пробу массой 2 г, взвешенную с точностью до 1 мг, помещают в мерную колбу вместимостью 25 см³. Добавляют н-гексан или иной подходящий растворитель и растворяют в нем пробу. Обработка ультразвуком ускоряет процесс растворения. Доводят содержимое колбы до метки тем же растворителем. Подготовленный раствор пробы может быть использован только при анализе методом нормально-фазовой ВЭЖХ.

При необходимости раствор пробы разбавляют тем же растворителем либо готовят новый раствор с использованием подготовленной к испытаниям пробы меньшей массы.

6.2.2.2 Маргарин, сливочное масло

При испытании маргарина и сливочного масла необходимо выделить жир из пробы. Это может быть достигнуто, например, путем смешивания пробы с безводным сульфатом натрия (см. 4.4), добавления н-гексана (см. 4.7) и обработки смеси в ультразвуковой бане. Нерастворившиеся вещества отфильтровывают и не менее двух раз промывают н-гексаном. Растворитель отгоняют на ротационном испарителе при пониженном давлении, остаток растворяют в определенном объеме н-гексана и анализируют методом нормально-фазовой хроматографии.

6.2.3.1 Омыление

Подготовленную к испытаниям пробу массой от 2 до 10 г омыляют с обратным холодильником, предпочтительно в атмосфере азота, добавляя при этом необходимое количество этанола (см. 4.3) или метанола (см. 4.1), воды, антиокислителя (см. 4.6), такого как аскорбиновая кислота (АК), гидрохинон, пирогаллол или BHT, и одного из растворов гидроксида калия (см. 4.5). Спирты и антиокислители добавляют в пробу до добавления раствора гидроксида калия.

В таблице 2 приведены примеры подходящих количеств реактивов.

Обычно время омыления составляет от 15 до 40 мин при температуре от 80 °C до 100 °C. Если по окончании омыления на поверхности охлажденной реакционной смеси присутствует жир или масло, то добавляют дополнительное количество раствора гидроксида калия (см. 4.5) и увеличивают время омыления.

6.2.3.2 Экстракция

Во избежание образования эмульсии, раствор пробы после омыления разбавляют таким количеством воды, чтобы в полученном растворе объемное отношение спирта и воды составляло 1:1. Экстрагируют токоферолы подходящим растворителем (см. 4.7). Для обеспечения надлежащей полноты выделения и при использовании н-гексана в качестве экстрагента, к нему должна быть добавлена определенная доля полярного растворителя. Для количественной экстракции токоферолов также применяют такие смеси растворителей, как, например, петролейный эфир с добавлением 20% диэтилового эфира. Для выявления возможных потерь аналита контролируют полноту обнаружения токоферолов (дополнительную информацию см. в [16] и [17]).

Процедуру экстракции повторяют три-четыре раза, используя порции экстрагента объемом от 50 до 150 см³. Объединенные экстракты промывают водой до нейтральной реакции (два - четыре раза объемом от 50 до 150 см³).

Экстракция может также быть осуществлена методом жидкостно-жидкостной экстракции с использованием картриджей (например, <*>) при условии, что содержание токоферолов не слишком низкое (дополнительную информацию см. в [18], [22]).

--------------------------------

<*> является примером подходящего имеющегося в продаже продукта. Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного поставщика со стороны CEN.

6.2.3.3 Концентрирование экстракта

Из экстракта удаляют растворитель путем дистилляции с применением ротационного испарителя (см. 5.2). Предварительно остающиеся следы воды удаляют путем осушения безводным сульфатом натрия (см. 4.4) или отгонки азеотропа с абсолютным этанолом (см. 4.2) или толуолом. Могут быть использованы другие равноценные способы удаления следов воды, такие как применение фильтра для разделения фаз, при условии, что они не оказывают негативного влияния на результаты испытаний.

6.2.3.4 Разбавление

Остаток растворяют в подвижной фазе (см. 4.8) или в другом, совместимом с подвижной фазой растворителе, причем массовая концентрация отдельных токоферолов в полученном растворе пробы должна составлять от 1 до 10 мкг/см³.

Пики токоферолов на хроматограмме раствора пробы идентифицируют по совпадению значений времени удерживания со значениями времени удерживания пиков токоферолов на хроматограммах градуировочных растворов. В качестве альтернативы пики токоферолов на хроматограмме раствора пробы идентифицируют путем ее сопоставления с хроматограммой раствора пробы с добавкой градуировочных растворов.

Примечание 3 - Установлено, что разделение и количественное определение являются удовлетворительными при следующих хроматографических условиях (см. также приложение A (рисунки A.1 и A.2)). Другие варианты условий хроматографического анализа приведены в приложении C (таблица C.1)).

В ВЭЖХ-систему (см. 5.3) вводят подходящие объемы (до 100 мм³) стандартного раствора и раствора пробы. Количественное определение проводят путем соотнесения площади или высоты пика аналита на хроматограмме раствора пробы с аналогичными параметрами пика на хроматограмме стандартного раствора.

Объемы ввода раствора пробы и градуировочного раствора должны быть одинаковыми, в противном случае их учитывают при вычислении результата (см. раздел 7). Проверяют соблюдение требования проведения измерений в линейной области градуировочной характеристики.

Вычисление результатов проводят при помощи градуировочного графика или путем применения соответствующей программы интегратора либо применяют следующий упрощенный способ.

Массовую долю , , и w, мг/100 г пробы, вычисляют по формуле

где A_S - площадь или высота пика , , и в растворе пробы;

A_ST - площадь или высота пика , , и в стандартном растворе;

V - общий объем раствора пробы (см. 6.2.2 и 6.2.3), см³;

- массовая концентрация , , и в стандартном растворе (см. 4.11.1 и 4.11.2) с откорректированной чистотой (см. 4.10.5), мкг/см³;

m - масса пробы, г;

V_ST - объем ввода стандартного раствора, мм³;

V_S - объем ввода раствора пробы, мм³;

1000 - коэффициент пересчета мкг в мг;

100 - коэффициент пересчета для массовой доли на 100 г.

Результаты для , , и выражаются в мг/100 г пробы. При необходимости расчета активности витамина E руководствуются введением и документами [1] - [3].

Данные по прецизионности различных вариантов определения методом ВЭЖХ были исследованы в ходе межлабораторных сравнительных испытаний, организованных в 1994 году Европейской комиссией по нормированию, измерениям и испытаниям на международном уровне [18] на пробах маргарина (сертифицированное эталонное вещество (CRM) 122) и сухого молока CRM 421, испытания привели к получению статистических результатов, представленных в приложении B. Результаты, полученные при этих международных сравнительных испытаниях, не могут быть применимы к другим диапазонам содержаний определяемых соединений и иным матрицам по сравнению с приведенными в приложении B.

Данные по прецизионности для сухого молока и овсяной муки были установлены в соответствии с [19] в ходе межлабораторных сличительных испытаний, организованных на национальном уровне институтом им. Макса фон Петтенкофера Федерального учреждения по здравоохранению (в настоящее время - Федеральный институт защиты здоровья потребителя и ветеринарной медицины) [20]. Результаты, полученные при этих сравнительных испытаниях, не могут быть применимы к другим диапазонам содержаний определяемых соединений и иным матрицам по сравнению с приведенными в приложении B.

Абсолютная разность между двумя единичными результатами испытаний, полученными одним исполнителем на идентичном исследуемом материале на одном и том же оборудовании в течение возможно короткого промежутка времени, может превышать предел повторяемости r не чаще чем в 5% случаев. Предел повторяемости зависит от содержания определяемых соединений в пробе. Значения приведены ниже:

Абсолютная разность между двумя единичными результатами, полученными в двух лабораториях на идентичном исследуемом материале, может превышать предел воспроизводимости R не чаще чем в 5% случаев. Значения приведены ниже:

Протокол испытаний должен соответствовать требованиям [23] и содержать, по меньшей мере, следующие сведения:

a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;

b) ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;

c) дату и способ отбора проб (если он известен);

d) дату поступления пробы;

e) дату проведения испытаний;

f) результаты испытаний с указанием единиц измерений, в которых выражен результат;

g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытаний;

h) любые применявшиеся операции, не оговоренные в методе или рассматриваемые необязательные, которые могли повлиять на результат испытаний.

Приведенные в таблице B.1 данные были получены в межлабораторном сравнительном испытании различных способов определения витамина E , которое было организовано в рамках Программы нормирования, измерения и испытания Европейской комиссией [18]. Данные, приведенные в таблицах B.2 и B.3, получены в результате межлабораторного испытания, проведенного в соответствии с требованиями [19]. Испытание было проведено под руководством отдела пищевой химии Федеральной службы здравоохранения Института имени Макса фон Петтенкофера, Берлин, Германия [20].

Примечание - Данные, установленные в ходе сравнительных испытаний, были получены с использованием различных вариантов метода, которые идентичны применяемым лабораториями рутинным методам, при этом были использованы ВЭЖХ-системы, приведенные в приложении C.

Разделение и количественное определение считаются удовлетворительными, если при проведении хроматографического анализа соблюдены следующие условия [18].

Примечание - При проведении межлабораторных исследований для определения в маргарине и сухом молоке были использованы колонки с обращенной фазой.

--------------------------------

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".