"ГОСТ 32536-2020. Межгосударственный стандарт. Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Определение острой токсичности для дафний"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.10.2020 N 908-ст)

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием "Российский научно-технический центр информации по стандартизации, метрологии и оценке соответствия" (ФГУП "СТАНДАРТИНФОРМ") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2020 г. N 131-П)

За принятие проголосовали

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 октября 2020 г. N 908-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32536-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2021 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу OECD Test N 202:2004 "Руководство по испытанию химических веществ. Daphnia sp. тест по оценке острой токсичности" ("Guideline for Testing of chemicals - Daphnia sp. Acute Immobilisation Test", MOD) путем:

- включения раздела 1, библиографической ссылки, дополнительных фраз, которые выделены в тексте курсивом;

- изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного документа приведено в дополнительном приложении ДА.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

6 ВЗАМЕН ГОСТ 32536-2013

1. Руководства Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) по испытаниям химических веществ периодически пересматриваются с учетом научно-технического прогресса. Руководство OECD Test N 202 "Daphnia sp. Тест на острую иммобилизацию и тест на репродукцию", принятое в апреле 1984 г., состояло из двух частей, часть I - 24-часовой тест на острую иммобилизацию EC50 и часть II - тест на репродукцию (не менее 14 дней). В результате пересмотра теста на репродукцию в сентябре 1998 г. было принято и опубликовано Руководство по испытанию OECD Test N 211 "Тест на размножение Daphnia magna". Поэтому данная версия руководства OECD Test N 202:2004 ограничена испытанием на острую иммобилизацию.

2 В настоящем руководстве приведено испытание на острую токсичность для оценки воздействия химических веществ на дафний. Были использованы данные, приведенные в [1] - [3]. Основными отличиями по сравнению с более ранней версией являются увеличение продолжительности испытания до 48 ч, представление дополнительной информации о рекомендуемых культурах и средах для испытания и проведение анализа на предельно допустимую концентрацию исследуемого вещества 100 мг/л.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 средняя эффективная концентрация EC₅₀: Концентрация исследуемого вещества, которая приводит к угнетению подвижности 50% дафний в течение установленного периода воздействия.

Примечание - При использовании другого определения необходимо привести его в отчете о проведении испытания со ссылкой на источник информации.

2.2 иммобилизация (угнетение подвижности) (immobilisation): Отсутствие способности у дафний плавать в течение 15 с после легкого взбалтывания содержимого испытательного сосуда (даже если они еще могут двигать сяжками).

Молодых дафний в возрасте менее 24 ч в начале испытания подвергают воздействию исследуемого вещества определенного диапазона концентрации в течение 48 ч. Иммобилизацию регистрируют через 24 и 48 ч и сравнивают с контрольными значениями. Проводят анализ результатов для вычисления EC₅₀ через 48 ч после воздействия. Определение EC₅₀ через 24 ч является факультативным.

Должны быть известны растворимость в воде и давление паров исследуемого вещества и должен быть доступен надежный аналитический метод количественного определения вещества в исследуемых растворах с заявленной эффективностью извлечения и пределом определения. Полезная информация включает структурную формулу, чистоту вещества, стабильность в воде и на свету, распределение и результаты испытаний на способность к биоразлагаемости <1>.

--------------------------------

<1> См. [4].

Для подтверждения надежности условий испытания может быть определено значение EC₅₀ для стандартного (эталонного) вещества. Для этого рекомендуется использовать токсические вещества, используемые в международных круговых испытаниях <1>. Было установлено, что результаты этих межлабораторных испытаний для калия дихромата (K₂Cr₂O₇) дают через 24 ч значения EC₅₀ в диапазоне от 0,6 до 2,1 мг/дм³.

--------------------------------

<1> См. [1], [6].

Испытания со стандартным веществом желательно проводить каждый месяц, но не менее двух раз в год.

Для признания достоверности результатов испытания применяют следующие критерии качества:

- в контрольном испытании, включая контрольное испытание с растворителем, должно быть иммобилизовано не более 10% дафний;

- концентрация растворенного кислорода в конце испытания должна составлять не менее 3 мг/дм³ в контрольных и испытательных сосудах.

Примечание - Для первого критерия не более 10% контрольных особей дафний должны демонстрировать иммобилизацию или другие признаки поражения или стресса, например обесцвечивание или аномальное поведение, такое как нахождение на поверхности воды.

7.1.1 Испытательные сосуды и другие устройства, контактирующие с исследуемыми растворами, должны быть изготовлены из стекла или другого химически инертного материала. Испытательные сосуды обычно представляют собой стеклянные пробирки или стаканы, которые должны быть очищены перед каждым использованием путем стандартных лабораторных процедур. Испытательные сосуды должны быть неплотно закрыты для уменьшения потерь воды из-за испарения и предотвращения попадания пыли в растворы. Испытания летучих веществ проводят в достаточно больших, полностью заполненных закрытых сосудах для предотвращения ограничения или слишком низкого уровня кислорода (см. раздел 6 и 8.3.1).

7.1.2 Кроме того, используют следующее оборудование:

- прибор для измерения содержания кислорода - оксиметр (с микроэлектродом или другого типа для измерения растворенного кислорода в небольших объемах);

- pH-метр;

- соответствующее устройство для регулирования температуры (термостатирования);

- оборудование для определения общей концентрации органического углерода (TOC);

- оборудование для определения химической потребности в кислороде (COD);

- оборудование для определения жесткости воды.

Наиболее предпочтительным видом является Daphnia magna Straus, но могут использоваться и другие виды дафний (например, Daphnia pulex). В начале испытания возраст дафнии не должен быть более 24 ч, и для снижения изменчивости следует использовать дафний не из первого потомства. Дафнии должны быть получены из здоровой популяции (без симптомов стресса, таких как высокая смертность, присутствие мужских особей и эфиппий, задержки воспроизводства первого поколения, бесцветных особей и т.д.). Организмы, используемые для конкретного испытания, должны быть получены из культур одной и той же популяции дафний. Дафнии должны содержаться в условиях культивирования (свет, температура, среда), аналогичных тем, которые будут использованы при испытании. Если среда культивирования при испытании отличается от среды, используемой для обычного культивирования, то целесообразно предусмотреть период предварительной акклиматизации перед испытанием. Для этого дафний содержат в воде, используемой для проведения исследования, при температуре исследования в течение не менее 48 ч до начала испытания.

7.3.1 Природная вода (поверхностные или грунтовые воды), модифицированная вода или дехлорированная водопроводная вода считаются приемлемыми для содержания дафний и растворения, если дафнии выживают в ней во время культивирования, акклиматизации и проведения испытаний без признаков стресса. Вода, химические характеристики которой соответствуют требованиям, приведенным в приложении A, подходит для испытаний. Качество воды должно быть постоянным в течение всего периода испытаний. Модифицированная вода может быть приготовлена путем растворения определенного количества реагентов известной аналитической чистоты в дистиллированной или деионизированной воде. Примеры состава модифицированной воды приведены в документах <1> и в приложении B. Необходимо отметить, что среды, содержащие известные комплексообразующие вещества, такие как M4 и M7 в приложении C, не следует использовать для испытания веществ, содержащих металлы. Значение pH воды должно находиться в диапазоне от 6 до 9.

--------------------------------

<1> См. [1], [7].

Рекомендуемая жесткость воды для Daphnia magna составляет от 140 до 250 мг/дм³ (в пересчете на CaCO₃), для других видов Daphnia можно использовать более низкие значения жесткости. Воду, используемую для разбавления, можно аэрировать перед использованием для испытания, чтобы концентрация растворенного кислорода достигла насыщения.

7.3.2 При использовании природной воды показатели качества следует измерять не менее двух раз в год или каждый раз в случае возможного изменения данных параметров (см. 7.3.1 и приложение A). Также необходимо определять содержание тяжелых металлов (например, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). При использовании дехлорированной водопроводной воды необходимо проводить ежедневный анализ содержания хлора. При использовании поверхностной или грунтовой воды необходимо измерять ее электрическую проводимость и содержание в ней общего органического углерода (TOC) или химического потребления кислорода (COD).

7.4.1 Растворы выбранных концентраций для испытания обычно готовят разбавлением исходного раствора. Исходные растворы готовят путем растворения исследуемых веществ в воде. По возможности следует избегать использования растворителей, эмульгаторов или диспергирующих веществ. Однако в некоторых случаях такие соединения могут потребоваться для получения основного раствора нужной концентрации. Рекомендуемые растворители, эмульгаторы и диспергаторы приведены в нормативном документе <2>. В любом случае содержание исследуемого вещества в растворе не должно превышать предела растворимости в воде, используемой для разбавления.

--------------------------------

<2> См. [5].

7.4.2 Испытание проводят без регулирования pH. Если значение pH не сохраняется в диапазоне от 6 до 9, то может быть проведено второе испытание с приведением pH основного раствора к pH используемой воды перед добавлением исследуемого вещества. Регулирование значения pH проводят таким образом, чтобы концентрация основного раствора не изменялась в значительной степени и не происходило химической реакции или осаждения исследуемого вещества. Наиболее приемлемыми реагентами для регулирования pH основного раствора исследуемого вещества являются соляная кислота (HCl) и едкий натр (NaOH).

Тест следует проводить без корректировки pH. Если pH не остается в диапазоне от 6 до 9, то можно провести второй тест, доводя значение pH исходного раствора до уровня pH разбавляющей воды перед добавлением исследуемого вещества. Регулировку значения pH следует проводить таким образом, чтобы концентрация исходного раствора не изменялась в какой-либо значительной степени и чтобы не возникала химическая реакция или осаждение исследуемого вещества. Предпочтительно использовать HCl и NaOH.

8.1.1.1 Испытательные сосуды заполняют соответствующими объемами воды и растворами исследуемых веществ. Соотношение объемов воздуха и воды в сосуде должно быть идентичным для подопытных и контрольных групп. Затем в сосуды помещают дафний. Не менее 20 особей, разделенных на четыре группы (по пять особей в каждой), используют для каждой испытуемой концентрации и для контрольной группы. Для каждой особи дафний необходимо обеспечить не менее 2 см³ исследуемого раствора (т.е. 10 см³ для 5 дафний в одном испытательном сосуде). Испытание проводят с полустатическим обновлением или в проточной системе, когда концентрация исследуемого вещества нестабильна.

8.1.1.2 В дополнение к серии испытаний воздействия исследуемого вещества следует провести одну серию испытаний с водой-разбавителем, а также, при необходимости, с водой, содержащей солюбилизирующий агент (контроль растворителей) при уровнях, используемых при воздействии.

8.1.2.1 При отсутствии информации о токсичности исследуемого вещества для определения диапазона концентраций для окончательного испытания может быть проведено испытание по определению диапазона концентраций. Для этого дафний подвергают воздействию разных концентраций исследуемого вещества. Пять дафний подвергают воздействию каждой исследуемой концентрации в течение 48 ч, параллельные испытания не проводят. Период воздействия можно сократить (например, до 24 ч), если данные, необходимые для определения диапазона значимых концентраций могут быть получены за меньшее время.

8.1.2.2 Для испытания следует использовать не менее пяти концентраций. Они должны быть расположены в геометрической прогрессии с коэффициентом разделения, не превышающим 2,2. При использовании менее пяти концентраций в отчете о проведении испытания необходимо привести обоснование. Самая высокая концентрация должна приводить к 100%-ной иммобилизации, а самая низкая - не оказывать никакого заметного воздействия.

8.1.3.1 Температуру поддерживают в диапазоне от 18 °C до 22 °C, и для каждого отдельного испытания она должна быть постоянной с точностью +/- 1 °C. Рекомендуемая периодичность освещения: 16 ч - свет, 8 ч - темнота. Допускается проведение испытаний в полной темноте, особенно для исследуемых веществ, не стабильных на свету.

8.1.3.2 Во время испытания не проводят аэрацию испытательных сосудов. Испытания проводят без регулирования значения pH. Во время испытания дафний не следует кормить.

Продолжительность испытания составляет 48 ч.

Каждый испытательный сосуд проверяют на наличие иммобилизованных дафний через 24 и 48 ч после начала испытания. В дополнение к иммобилизации в отчет необходимо включать информацию о любых признаках аномального поведения или изменения внешнего вида.

8.3.1 Измеряют содержание растворенного кислорода и значение pH в начале и в конце испытания в контрольной группе и в подопытной группе с максимальной концентрацией исследуемого вещества. Концентрация растворенного кислорода в контрольных группах должна соответствовать критериям, приведенным в разделе 6. Значение pH не должно изменяться более чем на 1,5 единицы в любом испытании. Температуру обычно измеряют в контрольных сосудах или в окружающем воздухе и регистрируют непрерывно во время испытания или как минимум в начале и в конце испытания.

8.3.2 Концентрацию исследуемого вещества определяют как минимум для наибольшей и наименьшей концентрации в начале и в конце испытания <1>. Вычисление результатов рекомендуется проводить на основании измеренных концентраций. При наличии подтверждающих данных о том, что на протяжении всего испытания концентрация исследуемого вещества удовлетворительно поддерживается в пределах +/- 20% от номинального значения или измеренной начальной концентрации, результаты могут быть основаны на номинальных или измеренных начальных значениях.

--------------------------------

<1> См. [5].

Используя процедуры, описанные в настоящем стандарте, испытание предельного значения можно выполнить при концентрации исследуемого вещества 100 мг/дм³ или соответствующей пределу его растворимости в испытательной среде (в зависимости от того, что ниже), чтобы продемонстрировать, что значение EC₅₀ больше этой концентрации. Испытание на предельное значение выполняют с использованием 20 дафний (желательно разделенных на четыре группы по пять особей в каждой) с одинаковым числом в контрольной(ых) группе(ах). Если в конце испытания процент иммобилизации превышает 10%, проводят полное испытание. Любое наблюдаемое аномальное поведение должно быть зарегистрировано.

10.1.1 Данные должны быть обобщены в табличной форме, показывающей для каждой подопытной группы и каждой контрольной группы число использованных и иммобилизованных дафний при каждом наблюдении. Строят график зависимости процента иммобилизованных дафний через 24 и 48 ч в зависимости от испытуемых концентраций. Данные анализируют с использованием соответствующих статистических методов (например, пробит-анализ и т.д.) для вычисления наклонов кривых и EC₅₀ с пределом доверительной вероятности 95% (p = 0,95) <1>.

--------------------------------

<1> См. [8], [9].

10.1.2 Если стандартные методы вычисления EC₅₀ не применимы к полученным данным, в качестве приблизительного значения EC₅₀ используют максимальную концентрацию, не вызывающую иммобилизации, и минимальную концентрацию, приводящую к 100%-ной иммобилизации (рассматривают как среднее геометрическое значение этих двух концентраций).

10.2.1 Отчет о проведении испытания должен содержать следующую информацию.

10.2.1.1 Исследуемое вещество:

- агрегатное состояние и соответствующие физико-химические свойства;

- химические идентификационные данные, включая чистоту.

Вид исследуемых дафний:

- источник и вид дафний, поставщик (если известен) и используемые условия культивирования (включая источник, вид и количество пищи, частоту кормления).

10.2.1.2 Условия испытаний:

- описание испытательных сосудов: тип и вместимость сосудов, объем исследуемых растворов, число дафний в испытательном сосуде, число испытательных сосудов (параллельных опытов) на каждую концентрацию;

- методы приготовления основных и испытательных растворов, включая использование любого растворителя или диспергатора, используемые концентрации;

- характеристики воды: источник и параметры качества воды (значение pH, жесткость, отношение Ca/Mg, отношение Na/K, щелочность, проводимость и т.д.); состав модифицированной воды, при использовании;

- условия инкубации: температура, интенсивность и периодичность освещения, содержание растворенного кислорода, значение pH и т.д.

10.2.1.3 Результаты:

- число и процент дафний, для которых наблюдали иммобилизацию или любые негативные проявления (включая аномальное поведение) в контрольных группах и в каждой подопытной группе, для каждого периода наблюдения и описание природы наблюдаемых эффектов;

- результаты и дата проведения испытаний с эталонными веществами при наличии;

- номинальные испытуемые концентрации и результаты всех испытаний при определении концентрации исследуемого вещества в испытательном сосуде. Следует также сообщить об эффективности извлечения и пределе определения;

- все данные о физико-химических измерениях - температуре, значениях pH и растворенного кислорода, - сделанных во время испытания;

- значение EC₅₀ для иммобилизации через 48 ч с доверительными интервалами и графиками подобранной модели, используемыми для их вычисления, наклоны кривых "доза-ответ" и стандартное отклонение; статистические методы, используемые для вычисления EC₅₀ (приводят соответствующие данные об иммобилизации через 24 ч, если определяли);

- обоснование любого отклонения от метода по настоящему стандарту и влияние отклонений на результаты испытания.

--------------------------------

<1> См. также [1].

В некоторых случаях наблюдаются трудности при пересадке дафний в питательные среды M4 и M7. Данные трудности можно преодолеть путем постепенной адаптации, т.е. постепенной пересадкой дафний из собственной среды в 30%-ную, потом в 60%-ную и затем в 100%-ную среды Элендт. Период адаптации может составлять до одного месяца.

Сначала в воде подходящей чистоты, например деионизированной, дистиллированной или обратного осмоса <1> готовят отдельные исходные растворы (I) индивидуальных микропримесей в соответствии с таблицей C.1. Из этих исходных растворов (I) готовят исходные объединенные растворы (II) M4 и M7, содержащие все микропримеси (объединенные растворы).

--------------------------------

<1> См. [1].

Среды M4 и M7 готовят с использованием основных растворов (II), макронутриентов и витаминов в соответствии с таблицей C.2.

--------------------------------

<1> См. [1].

<2> См. [10].