"ГОСТ ISO 6558-2-2019. Межгосударственный стандарт. Фрукты, овощи и продукты их переработки. Определение содержания каротина спектрофотометрическим методом"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 24.09.2019 N 742-ст)

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Всероссийским научно-исследовательским институтом технологии консервирования - филиалом Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН (ВНИИТеК - филиал ФГБНУ "ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН) на основе официального перевода на русский язык англоязычной версии указанного в пункте 5 стандарта, который выполнен ФГУП "СТАНДАРТИНФОРМ"

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июля 2019 г. N 120-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 сентября 2019 г. N 742-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 6558-2-2019 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2020 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 6558-2:1992 "Фрукты, овощи и продукты их переработки. Определение содержания каротина. Часть 2. Общепринятые методы" ("Fruits, vegetables and derived products - Determination of carotene content - Part 2: Routine methods", IDT).

Международный стандарт разработан Техническим комитетом ISO/TC 34 "Пищевые продукты", Подкомитетом SC 3 "Плодоовощные продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6)

6 ВЗАМЕН ГОСТ 8756.22-80

Настоящий стандарт устанавливает два метода определения каротина (C₄₀H₅₆) во фруктах, овощах и продуктах их переработки в зависимости от содержания в них жира.

Метод A - для продуктов с содержанием жира до 5% по массе включительно <1>.

--------------------------------

<1> Предел 5% по массе установлен как арбитражный.

Метод B - для продуктов с содержанием жира свыше 5% по массе.

Метод основан на экстракции каротина из продукта смесью петролейного эфира и ацетона, последующем испарении растворителей, отделении каротина от других каротиноидов в полученном экстракте с применением колоночной хроматографии и спектрофотометрическом определении содержания каротина.

Используют реактивы только признанного аналитического качества и дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты.

2.2.1 Петролейный эфир с пределами температуры кипения от 50 °C до 70 °C.

2.2.2 Экстракционная смесь, готовят следующим образом.

Растворяют 0,2 г гидрохинона в 40 см³ ацетона, а затем добавляют 160 см³ петролейного эфира (2.2.1).

2.2.3 Натрия сульфат, безводный.

Высушивают при 120 °C в течение 2 - 3 ч и хранят в герметичном контейнере.

2.2.4 Кварцевый песок, промытый кислотой и прокаленный в муфельной печи.

2.2.5 Сорбент для заполнения колонки: используют один из вариантов, описанных в 2.2.5.1 - 2.2.5.4.

2.2.5.1 Алюминия оксид, деактивированный суспендированием в воде, готовят следующим образом.

Прокаливают оксид алюминия в течение 3 ч в муфельной печи при 500 °C и охлаждают в эксикаторе. Перед использованием помещают 50 г прокаленного оксида алюминия в колбу со шлифом, добавляют 5,5 см³ воды и перемешивают до образования однородной суспензии. pH суспензии должно быть в пределах от 9 до 10. Суспензию можно хранить в закрытой колбе не более 24 ч.

2.2.5.2 Магния оксид/стеклянная пыль, смесь 1:2 по массе.

2.2.5.3 Алюминия оксид/натрия сульфат безводный, смесь 3:1 по массе.

2.2.5.4 Алюминий оксид/кальций гидроксид, смесь 1:1 по массе.

2.2.6 Натрия хлорид, раствор 300 г/дм³.

Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.

2.3.1 Спектрофотометр, подходящий для измерений при длине волны 450 нм, оборудованный кюветным отделением с длиной оптического пути 10 мм.

2.3.2 Установка для фильтрования типа Витта, со стеклянной воронкой и колбой для фильтрования под уменьшенным давлением.

2.3.3 Водяной насос.

2.3.4 Водяная баня, обеспечивающая поддержание температуры в диапазоне от 30 °C до 35 °C.

2.3.5 Вакуумный роторный испаритель.

2.3.6 Хроматографическая колонка диаметром 10 - 15 мм.

2.3.7 Сетчатый фильтр класса P40.

2.3.8 Вата, обезжиренная петролейным эфиром.

2.3.9 Лабораторная ступка с пестиком.

2.3.10 Эксикатор, содержащий эффективный осушитель.

2.3.11 Коническая колба вместимостью 500 см³.

2.3.12 Круглодонные колбы вместимостью 100 и 500 см³, с коническими шлифами.

2.3.13 Делительная воронка вместимостью 1000 см³.

2.3.14 Мерные колбы с одной отметкой вместимостью 50 и 100 см³.

Тщательно перемешивают лабораторную пробу до однородного состояния.

Удаляют семена и кожуру, при необходимости, а затем тщательно перемешивают лабораторную пробу до однородного состояния.

Взвешивают удаленные семена и кожуру для внесения поправки на полученный результат.

Размораживают лабораторную пробу в закрытом контейнере. При необходимости повторяют операции по 2.4.2. Присоединяют жидкость, образовавшуюся при размораживании, к продукту и тщательно перемешивают до однородного состояния.

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ - Определение проводят в темном месте, без доступа прямого солнечного света.

Взвешивают от 1 до 10 г подготовленной пробы (2.4), содержащей от 5 до 150 мкг каротина.

2.5.2.1 Количественно переносят навеску пробы в ступку (2.3.9) и добавляют около 20 см³ экстракционной смеси (2.2.2). Добавляют 20 г безводного сульфата натрия (2.2.3) и 30 г кварцевого песка (2.2.4), тщательно растирают. Декантируют полученный экстракт на фильтр (2.3.7) в коническую колбу вместимостью 500 см³ (2.3.11). Экстракцию повторяют до тех пор, пока не будет получен прозрачный раствор. Переносят количественно остаток на фильтр и промывают его смесью, собирая фильтрат в коническую колбу.

2.5.2.2 Экстракты объединяют, переносят в делительную воронку вместимостью 1000 см³ (2.3.13) и промывают несколько раз порциями воды, общим объемом от 300 до 400 см³ с целью удаления остатков ацетона. Экстракт встряхивают аккуратно, избегая образования эмульсии. Экстракцию повторяют с другой пробой, повторяя указанные операции, но используя вместо воды раствор хлорида натрия массовой концентрации 300 г/дм³ (2.2.6).

2.5.2.3 К промытому экстракту добавляют 15 г безводного сульфата натрия (2.2.3), перемешивают и оставляют на 15 мин. Раствор фильтруют через фильтр (2.3.7), наполовину заполненный безводным сульфатом натрия, в круглодонную колбу вместимостью 500 см³ (2.3.12). Промывают слой сульфата натрия тремя порциями по 10 см³ петролейного эфира (2.2.1), собирая промывные воды вместе с фильтратом.

2.5.2.4 Полученный фильтрат упаривают на вакуумном испарителе (2.3.5) на водяной бане (2.3.4) при температуре от 30 °C до 35 °C и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 или 100 см³ (2.3.14), доводят объем до метки петролейным эфиром (V₁).

Примечание 1 - В случае образования эмульсии допускается добавление 10 см³ этилового спирта.

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ - На протяжении всей процедуры разделения колонка всегда должна быть заполненной петролейным эфиром выше уровня поверхностного слоя адсорбента.

2.5.3.1 Помещают ватную пробку (2.3.8) в широкую, нижнюю часть хроматографической колонки (2.3.6). Присоединяют колонку к установке Витта (2.3.2) и, аккуратно встряхивая, загружают в нее суспензию деактивированного оксида алюминия (2.2.5.1) или смеси оксида магния со стеклянной пылью (2.2.5.2), или смеси оксида алюминия с безводным сульфатом натрия (2.2.5.3) на высоту 15 - 20 см. Оксид алюминия не является подходящим сорбентом для случая разделения ликопинов. Для продуктов, содержащих в составе ликопиновые каротиноиды (например, томатов и продуктов из них), используют смесь оксида алюминия с гидроксидом кальция (2.2.5.4) в качестве адсорбента.

Для сбора элюата из колонки используют круглодонную колбу вместимостью 100 см³ (2.3.12). Установку для фильтрования Витта соединяют с водяным насосом (2.3.3).

2.5.3.2 Заполняют колонку петролейным эфиром. Когда уровень петролейного эфира будет находиться на 1 см выше поверхности адсорбента, приливают 5 - 20 см³ (точно измеренного) раствора пробы (V₂), в зависимости от интенсивности окраски. Когда уровень раствора пробы опустится около 1 см над поверхностью адсорбента, добавляют 30 см³ петролейного эфира.

Примечание 2 - При проведении процедуры промывки движутся вниз по колонке в виде желтоватой зоны и элюируются количественно, в то время как каротиноиды (ксантофил, криптоксантин и др.) задерживаются в верхних слоях адсорбента.

2.5.3.3 Повторяют добавление до тех пор, пока не будет получен прозрачный элюат (обычно после добавления 20 см³ петролейного эфира).

2.5.3.4 В зависимости от интенсивности окраски полученного элюата корректируют его объем (концентрируя или разбавляя петролейным эфиром, при необходимости) таким образом, чтобы в 1 см³ содержалось 0,4 - 3,0 мкг каротина. Регистрируют конечный объем элюата (V₃).

Измерения оптической плотности элюата проводят при длине волны 450 нм, в кюветах с длиной оптического пути 10 мм, используя в качестве раствора сравнения петролейный эфир.

Коэффициент молярной абсорбции для чистого раствора в петролейном эфире при 450 нм равен 2530.

Содержание каротина (выраженное через ) в продукте вычисляют по формуле

где W(C₄₀H₅₆) - содержание каротина, мкг/г продукта;

A - величина оптической плотности полученного элюата;

V₁ - объем раствора пробы, см³ (например, 50 или 100 см³);

V₂ - объем раствора пробы, взятый для хроматографического разделения, см³;

V₃ - конечный объем элюата, см³;

0,25 - корректирующий коэффициент для ;

m - масса пробы продукта, г.

Метод основан на экстракции, предварительном гидролизе жира в продукте с помощью щелочного раствора гидроксида калия, последующей экстракции каротиноидов смесью петролейного и диэтилового эфиров, отделении каротина от других каротиноидов в полученном экстракте с применением колоночной хроматографии и спектрофотометрическом определении каротина в элюате при длине волны 450 нм.

Используют реактивы и материалы, указанные в 2.2, за исключением 2.2.2, 2.2.4 и 2.2.6, только признанного аналитического качества, и в дополнение следующие:

3.2.1 Азот газообразный.

3.2.2 Этиловый спирт, с содержанием этанола не менее 96% по объему.

3.2.3 Калия гидроксид, раствор 500 г/дм³.

В мерном цилиндре с пробкой растворяют 5,0 г гидроксида калия в дистиллированной воде, доводят объем до 10 см³ и перемешивают.

Раствор готовят непосредственно перед использованием.

3.2.4 Пирогаллол, основной раствор, готовят следующим образом.

Готовят раствор пирогаллола массовой концентрации 250 г/дм³: растворяют в мерной колбе с одной отметкой вместимостью 25 см³ 6,25 г пирогаллола в воде, доводят раствор до метки водой и перемешивают.

Готовят раствор гидроксида калия массовой концентрации 600 г/дм³: растворяют в мерной колбе с одной отметкой вместимостью 100 см³ 60,0 г гидроксида калия в воде, доводят раствор до метки водой и перемешивают.

Готовят основной раствор, смешивая 15 см³ раствора пирогаллола и 90 см³ раствора гидроксида калия.

3.2.5 Экстракционная смесь, готовят следующим образом.

Смешивают одну часть петролейного эфира с одной частью диэтилового эфира (свободного от пероксидов).

3.2.6 Калия гидроксид, раствор 30 г/дм³.

В мерной колбе с одной отметкой вместимостью 50 см³ растворяют 1,5 г гидроксида калия в воде, доводят раствор до метки водой и перемешивают.

3.2.7 Фенолфталеин, 1%-ный раствор.

Растворяют 1,0 г фенолфталеина в 60%-ном (по объему) растворе этилового спирта и доводят объем раствора до 100 см³ раствором этилового спирта.

3.2.8 Антиоксидант, например, пирогаллол, гидрохинон, аскорбиновая кислота.

Используют оборудование, указанное в 2.3, за исключением 2.3.9, 2.3.11 и 2.3.13, и в дополнение следующее:

3.3.1 Установка для гидролиза, оснащенная обратным холодильником и подключенная к линии инертного газа, включающей поглотительную склянку с основным раствором пирогаллола (3.2.4) для удаления следов кислорода из инертного газа.

3.3.2 Делительная воронка вместимостью 250 см³.

Подготовку проб проводят в соответствии с 2.4.

В круглодонную колбу вместимостью 100 см³ (2.3.12) взвешивают необходимое количество подготовленной пробы (3.4), содержащей от 5 до 150 мкг каротина.

3.5.2.1 К пробе продукта добавляют 30 см³ раствора этилового спирта (3.2.2), 3 см³ раствора гидроксида калия (3.2.3) и небольшое количество антиоксиданта (3.2.8), затем соединяют колбу с обратным холодильником (3.3.1). Включают подачу азота (3.2.1). Проводят процедуру гидролиза с обратным холодильником при нагревании раствора на водяной бане в течение 30 мин.

3.5.2.2 Содержимое колбы охлаждают и количество переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³ (3.3.2), смывая остатки со стенок колбы водой. Проводят экстрагирование негидролизующихся соединений путем последовательного встряхивания: два раза - с 50 см³ экстракционной смеси и два раза - с 20 см³ экстракционной смеси. Полученный объединенный экстракт тщательно промывают 50 см³ раствора гидроксида калия (3.2.6), а затем водой до тех пор, пока реакция экстракта с раствором фенолфталеина (3.2.7) не будет отрицательной (отсутствие щелочи).

3.5.2.3 Удаляют воду из полученного экстракта в соответствии с процедурой, описанной в 2.5.2.3.

3.5.2.4 Проводят концентрирование экстракта в соответствии с процедурой, описанной в 2.5.2.4.

Хроматографическое разделение и спектрофотометрическое измерение проводят в соответствии с процедурами, описанными в 2.5.3 и 2.5.4.

Содержание каротина (выраженное через ) в продукте вычисляют по формуле, указанной в 2.6.

Абсолютное расхождение между результатами двух параллельных определений, полученными за короткий промежуток времени с использованием одного и того же метода на идентичном материале в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором на одинаковом оборудовании, не более чем в 5% случаев будет больше 5% среднего арифметического двух результатов.

В протоколе испытаний должны быть указаны используемый метод (например, обозначение настоящего стандарта, метод A или B) и полученные результаты. В нем также должны быть отражены все детали проведения испытания, не оговоренные в настоящем стандарте или не считающиеся обязательными, а также любые обстоятельства, которые могли бы повлиять на конечный результат.

Протокол испытаний должен содержать все сведения, необходимые для полной идентификации пробы.