"ГОСТ ISO 16000-20-2017. Межгосударственный стандарт. Воздух замкнутых помещений. Часть 20. Обнаружение и подсчет плесневых грибков. Определение общего количества спор"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 15.05.2018 N 246-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом "Научно-исследовательский центр контроля и диагностики технических систем" (АО "НИЦ КД") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии международного стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 ноября 2017 г. N 52)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 мая 2018 г. N 246-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 16000-20-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 16000-20:2014 "Воздух замкнутых помещений. Часть 20. Обнаружение и подсчет плесневых грибков. Определение общего количества спор" ("Indoor air - Part 20: Detection and enumeration of moulds - Determination of total spore count", IDT).

Международный стандарт разработан подкомитетом ISO/TC 146/SC 6 "Воздух замкнутых помещений" технического комитета по стандартизации ISO/TC 146 "Качество воздуха" Международной организации по стандартизации (ISO).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Плесень - общее название нитевидных грибков, принадлежащих к различным таксономическим группам (аскомицеты, зигомицеты и их анаморфные состояния, ранее известные как дейтеромицеты или несовершенные грибы). Они образуют мицелий и споры, по которым их можно визуально обнаружить с помощью микроскопа. Диаметр большинства спор составляет от 2 до 10 мкм, некоторые имеют размер до 30 мкм, и совсем небольшое число достигает в диаметре 100 мкм. Споры грибков некоторых видов малы и очень легко попадают в воздух (Aspergillus, Penicillium), а других - имеют большие размеры и/или покрыты слизью (Stachybotrys, Fusarium) и не так подвижны.

Споры грибков широко распространены в окружающей среде, и поэтому в разном количестве они также встречаются в замкнутых помещениях. Рост плесени в замкнутых помещениях следует рассматривать как проблему, касающуюся здоровья граждан, поскольку результаты эпидемиологических исследований подтвердили тесную взаимосвязь между сыростью и/или ростом плесени в домах и ухудшением здоровья их обитателей.

Согласованные методы отбора проб, обнаружения и подсчета числа плесневых грибков, в том числе стандарты, устанавливающие методы отбора проб, важны для сравнительной оценки проблемы грибков в закрытом помещении. Перед проведением любых измерений должен быть разработан план для методики измерения.

Настоящий стандарт описывает методы отбора проб воздуха, содержащего споры плесневых грибков, для дальнейшего микроскопического анализа.

Методика, установленная в настоящем стандарте, основана на [6].

В настоящем стандарте установлены требования к отбору проб плесневых грибков из воздуха. В соответствии с приведенными ниже рекомендациями получают пробу для микроскопии для определения общего содержания плесневых грибков.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1

2.2 пороговое значение размера частиц (cut-off value): Размер частиц (аэродинамический диаметр), для которого эффективность отбора проб составляет 50%.

2.3

Примечание - Термин "нитевидные грибки" необходим для различения грибков с гифальным ростом и дрожжевых грибков.

2.4 осаждение (impaction): Отбор проб частиц, взвешенных в воздухе, путем их отделения на твердую поверхность под действием инерционных сил.

2.5

2.6

Примечание - Плесневые грибки образуют споры различного вида в зависимости от того, к какой таксономической группе они принадлежат, а именно конидиоспоры (конидиа), спорангиоспоры и аскоспоры.

2.7

2.8 физическая эффективность отбора проб (physical sampling efficiency): Способность пробоотборника улавливать взвешенные в воздухе частицы определенных размеров.

Примечание - См. [7].

Определенное количество воздуха прокачивается через импактор, где находится твердая липкая поверхность, которая впоследствии подвергается микроскопическому анализу. При обходе препятствия и искривления потока воздуха, под действием инерции частицы, находящиеся в потоке воздуха, оседают на липкой поверхности.

Таким образом, взвешенные в воздухе плесневые грибки собираются непосредственно на липкой поверхности.

На физическую эффективность отбора проб влияют геометрия щели, скорость воздуха и способность поверхности к адгезии.

Для отбора проб необходимо устройство, способное улавливать частицы размером, близким к размеру спор плесневых грибков (от более 1 мкм до приблизительно 30 мкм). Пороговое значение размера частиц для подобного устройства отбора проб должно составлять 1 мкм или менее, но не более 2,6 мкм.

Примечание - Широко применяют и серийно выпускают импакторы трех основных типов: пробоотборники со сменными предметными стеклами и скоростью потока воздуха приблизительно 30 дм³/мин, например PS 30 <1> и MBASS30 <2>; пробоотборники со сменными предметными стеклами и скоростью потока воздуха приблизительно 15 дм³/мин, например Allergenco MK3 <3> и пробоотборники с одноразовыми кассетами и скоростью потока воздуха приблизительно 15 дм³/мин (см. приложение A).

--------------------------------

<1> PS 30 являются примером подходящей серийно выпускаемой продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO данной продукции.

<2> MBASS30 являются примером подходящей серийно выпускаемой продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO данной продукции.

<3> Allergenco MK3 является примером подходящей серийно выпускаемой продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO данной продукции.

После отбора проб споры плесневых грибков подсчитывают под микроскопом. Культивирование при этом не проводят. Таким методом определяют общее содержание спор, включающее культивируемые и некультивируемые споры.

Используют стандартное лабораторное оборудование для микробиологического анализа, в том числе следующее:

4.1 Стойка для размещения импактора на требуемой высоте.

4.2 Импактор со сменными предметными стеклами или кассетами.

4.3 Вакуумный насос, обеспечивающий постоянный расход воздуха во время непрерывной работы.

4.4 Газовый счетчик для определения в кубических метрах объема воздуха, прокачиваемого через пробоотборный зонд.

4.5 Таймер для предварительной настройки времени и продолжительности отбора проб.

4.6 Экран для защиты импактора от неблагоприятных погодных условий (необязательно только на открытом воздухе).

4.7 Микроскоп, оборудованный объективами 40^x и 100^x для достижения приблизительно 400- и 1000-кратного увеличения.

Все реактивы и химические препараты должны быть известной степени чистоты "для микробиологических исследований" или чище. Следует использовать дистиллированную воду или воду эквивалентной чистоты.

Состав раствора красителя приведен в таблице 1.

Все ингредиенты добавляют в 100 см³ воды и растворяют.

Отбор проб обычно проводят на высоте от 0,75 до 1,5 м от пола. В особых случаях допустимо проводить отбор проб на другой высоте. Следят за тем, чтобы пыль, осевшая на пол в доме, не попала в устройство отбора проб при его размещении на небольшой высоте от пола.

В соответствии с задачей и методикой измерения подготавливают необходимое количество импакторов и подложек или кассет.

Примечание - Если невозможно предсказать содержание спор, то может быть отобрано несколько проб (например, 50 дм³, 100 дм³ и 200 дм³) и для подсчета может быть использована наиболее подходящая проба (содержащая достаточное количество спор и не перегруженная).

Проверяют оборудование на комплектность и функциональность с поверочным листом. Через регулярные интервалы проводят оперативный контроль. Оперативный контроль подразумевает, в первую очередь, контроль объемного расхода.

Для каждой точки измерения используют стерильные устройства, содержащие предметные стекла или кассеты. В качестве альтернативы очищают щель этанолом или изопропанолом (70 об. %) и затем высушивают (например, сжатым воздухом).

Помещают предметные стекла или кассеты в импакторы. Избегают загрязнения устройства отбора проб.

Включают пробоотборник в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Рекомендуется проводить несколько измерений, отбирая пробы разного объема. Это особенно важно, если ожидаемый уровень содержания плесневых грибков неизвестен.

По завершении отбора проб удаляют предметные стекла или кассеты из устройства отбора проб и запаковывают их в стерильные контейнеры и/или пластиковые пакеты для предотвращения какого-либо вторичного загрязнения. В дальнейшем на новой точке измерения перед проведением отбора проб с импактором, содержащим предметное стекло, воздух в течение нескольких минут прокачивают через импактор без предметного стекла.

Для одноразовых пробоотборников следуют инструкции по эксплуатации.

Заполняют протокол отбора проб (см. раздел 11 и приложение B).

Транспортируют пробы в лабораторию (см. 6.4) и проводят анализ методом прямой микроскопии (см. 6.2).

Споры на липкой поверхности окрашивают раствором лактофенола синего (см. 5.2) или хлопкового голубого в молочной кислоте и оценивают под микроскопом при 400- или 1000-кратном увеличении.

Примечание - Для того, чтобы получить представление о спорах в пробе, первоначально можно провести осмотр при 100- или 200-кратном увеличении.

Если были отобраны пробы разных размеров, то для подсчета выбирают наиболее подходящую пробу (содержащую достаточное количество спор и не перегруженную).

Примечания

1 Подсчет спор различных типов под микроскопом является сложным процессом, который проводится только квалифицированным и хорошо обученным персоналом.

2 Раствор лактофенола синего является токсичным и, по возможности, следует избегать работы с ним. Также следует предусмотреть окрашивание спор подходящим альтернативным красителем. Следует обратить внимание, что хлопковый голубой в молочной кислоте не работает с PS 30 и MBASS30, которые используются для определения рабочих характеристик (см. раздел 10).

При использовании метода отбора проб с применением щелевых импакторов на предметном стекле образуется след (трек) пробы длиной приблизительно 1,6 см и шириной приблизительно 1 мм, который также оценивают с помощью микроскопии.

Как правило, предметное стекло оценивают на наличие следующих типов спор: базидиоспоры, аскоспоры, Cladosporium, споры типа Aspergillus/Penicillium, Stachybotrys, Chaetomium, споры типа Alternaria/Ulocladium, споры типа Helminthosporium, Epicoccum, других спор и фрагментов мицелия. Дополнительные типы спор, которые встречаются в нетипичных концентрациях и могут быть отнесены к какому-либо морфологическому типу, также протоколируют.

Базидиоспоры, аскоспоры, споры типа Alternaria/Ulocladium, Helminthosporium, Epicoccum обычно образуются в источниках внутри помещения и, следовательно, их наличие дает представление о том, в какой степени проба находилась под воздействием наружного воздуха (например, из-за утечек вокруг оконного пространства, механического воздействия или занесения спор снаружи).

Крупные легко идентифицируемые споры, например споры Stachybotrys или Chaetomium, подсчитывают на всей поверхности в продольном направлении следа пробы при 400-кратном увеличении. Таким образом, полностью загруженная поверхность импактора может быть оценена за короткий промежуток времени, и при этом определено число спор на единицу объема пробы. Теоретический предел обнаружения составляет одну спору на отобранный объем пробы.

Для небольших спор, например типа Aspergillus/Penicillium, проводят дополнительную более детальную оценку при 1000-кратном увеличении в направлении, перпендикулярном направлению следа пробы. Детальная оценка требует больших затрат времени, и поэтому может быть исследована только небольшая часть пробы (обычно от 10 до 30% общей поверхности импактора, см. раздел 10). Следовательно, предел обнаружения для небольших спор выше, чем для крупных спор. Для пробы объемом 200 дм³ и при оценке 10 поперечных пересечений теоретический предел обнаружения составляет приблизительно 50 спор/м³ (1 спора присутствует в 10 пересечениях).

Для количественной оценки предпочтительно, чтобы в оцениваемом обзорном поле микроскопа присутствовало 10 или более спор.

Примечание - Такие частицы, как чешуйки кожи и другие (минеральные и органические) частицы, не учитывают, но они могут быть указаны в других категориях и определено их содержание, чтобы иметь представление о влиянии соответствующих видов деятельности в помещении.

Количественные результаты записывают как содержание приведенных типов спор и фрагментов мицелия на 1 м³ воздуха. Общее содержание спор получают путем суммирования содержания отдельных типов спор.

Примечание - Споры, существующие в агрегатах, подсчитывают отдельно. Однако полезно регистрировать наличие их в протоколе испытаний, чтобы представить информацию о количестве агрегатов спор и отдельных единиц, что может быть необходимо для определенных целей исследования.

В оценке при 400-кратном увеличении (см. 6.2), которую проводят в продольном направлении следа пробы, необходимо оценивать полный объем пробы. Для вычисления содержания спор в 1 м³ воздуха, результат, полученный для всего объема пробы, умножают на соответствующий коэффициент (например, F = 5 для пробы объемом 200 дм³, см. пример 1).

В детальной оценке при 1000-кратном увеличении, которую проводят в направлении, перпендикулярном направлению отбора пробы (см. 6.2), в вычислении участвуют такие параметры, как геометрия щели, размер видимой области объектива и количество оцененных поперечных пересечений. Результаты округляют до двух знаков после запятой.

Содержание может быть вычислено по формуле

где C_L - содержание спор в пробе воздуха, спор/м³;

L - общая длина в направлении следа пробы, мм;

B - длина оцениваемой области в направлении следа пробы, мм;

V_G - объем пробы, м³;

Z - общее количество спор.

Значение B вычисляют по формуле

где D - диаметр видимой области, мм;

Z_Q - количество оцененных поперечных пересечений.

Решение: 20·5 = 100 спор/м³ воздуха = 1,0·10² спор/м³ воздуха.

Решение: 1,4·10³ спор/м³ воздуха.

Предметные стекла или кассеты запаковывают в стерильные контейнеры и/или пластиковые пакеты для предотвращения какого-либо вторичного загрязнения. Защищают их от неблагоприятных воздействий (увлажнения, пересушивания, перегрева, запыления и т.д.) и транспортируют в лабораторию для анализа. Предпочтительно проанализировать пробы в течение 1 недели после их отбора. До последующей обработки пробы хранят в лаборатории при комнатной температуре защищенными от пересушивания.

Лаборатория должна иметь документированное руководство по качеству, находящееся в свободном доступе для сотрудников.

Градуировку устройства отбора проб следует проводить с помощью сертифицированного объемного расходомера, погрешность измерения объема воздуха которого в кубических метрах, приведенного к реальным условиям, находится в пределах +/- 5%. Газовый счетчик должен быть подключен к входному отверстию устройства отбора проб. Следует убедиться в том, что входное отверстие газового счетчика свободно. После регулирования расхода точность дисплея пробоотборника должна быть соотнесена с объемным расходомером утвержденного типа. При прокачивании воздуха через устройство отбора проб в течение 30 мин отклонение показания дисплея устройства отбора проб от показания расходомера утвержденного типа должно быть в пределах +/- 1%.

Периодичность проверки градуировки оборудования по расходу воздуха (оперативный контроль) зависит от стабильности его работы. Полную градуировку выполняют перед началом новой серии измерений или после значительных изменений, например, если было установлено новое или отремонтированное оборудование или после технического обслуживания насоса. Если расход, определенный с помощью эталона сравнения, отклоняется более чем на +/- 2% от значения, требуемого для корректной работы входного отверстия, то объемную скорость потока регулируют в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Убеждаются в том, что во время отбора проб не происходит изменения потока воздуха более чем на +/- 2% и что время, необходимое для достижения требуемой скорости отбора проб в начале процесса отбора проб, остается по возможности наиболее коротким для сведения к минимуму влияния объема пробы.

Для некоторых устройств отбора проб пользователь этого оборудования не может осуществить проверку и настройку номинального потока, в этом случае ее регулярно выполняет производитель. В течение межповерочного интервала производителем должна быть обеспечена постоянная величина потока, а устройство отбора проб должно быть оснащено встроенной системой контроля, предотвращающей отклонения от номинального потока.

Маркируют пробы для однозначной идентификации.

Заполняют протокол отбора проб для каждой пробы перед ее отбором (или сразу после отбора).

Протокол должен содержать, по крайней мере, следующую информацию:

a) ссылку на настоящий стандарт;

b) наименование и адрес заказчика;

c) цель измерений;

d) тип использованного пробоотборного устройства;

e) объем отобранного воздуха;

f) дату, время, описание места и продолжительности отбора проб.

Характеристики эффективности были определены с применением PS 30 и MBASS30 лабораторией Umweltmykologie Dr. Dill & Dr. Trautmann GbR в Германии с привлечением субсидий на проведение научно-исследовательской работы, выданной Федеральным агентством по охране окружающей среды.

Физическая эффективность отбора проб была определена при различных скоростях воздуха (15 дм³/мин, 22,5 дм³/мин, 30 дм³/мин и 45 дм³/мин) путем фильтрации воздуха на выходном отверстии импактора для определения неосажденных грибков. Эффективность отбора проб увеличивается при увеличении скорости от 15 дм³/мин до 30 дм³/мин. Для скорости воздуха 45 дм³/мин увеличения эффективности зафиксировано не было. Для крупных спор эффективность отбора проб была выше, чем для небольших спор. Для спор Cladosporium была достигнута эффективность отбора проб порядка 90% (см. рисунок 1), в то время как для спор типа Aspergillus/Penicillium эффективность составила только 30 - 80%. В дальнейших экспериментах была использована скорость потока воздуха 30 дм³/мин. Сопоставимая эффективность отбора проб была опубликована для пробоотборного зонда Air-O-Cell) <1> (см. [7]).

--------------------------------

<1> Air-O-Cell является примером подходящей серийно выпускаемой продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO данной продукции.

При отборе проб щелевым импактором с помощью пробоотборника PM 30 <2> образуется след длиной приблизительно 1,6 см и 1,1 см в диаметре.

--------------------------------

<2> PM 30 является примером подходящей серийно выпускаемой продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO данной продукции.

При 1000-кратном увеличении в пределах области 1,6 см в продольном направлении лежат приблизительно 94 обзорных поля микроскопа. С использованием "чистых" культур при различных содержаниях было определено распределение крупных (Chaetomium или Stachybotrys) и небольших спор (Aspergillus/Penicillium). Большое содержание было обнаружено во всех обзорных полях микроскопа, при этом небольшое количество спор располагались в области начала и конца пробоотборной поверхности (см. рисунки 2 и 3). Отмечалось, что при низких концентрациях спор в пробе воздуха многие обзорные поля микроскопа были пустыми, также эффект отсутствия спор в начале и в конце пробоотборной поверхности был еще более заметным (см. рисунки 4 и 5). Подсчет небольших спор обычно делается при 1000-кратном увеличении в выбранных обзорных полях микроскопа. Области в начале и конце следа пробы не следует включать в подсчет вследствие очень низкого содержания или отсутствия спор в них.

Дальнейшие эксперименты были проведены для определения неопределенности измерения при проверке нескольких (5, 10, 20 или 30 из 94) обзорных полей микроскопа. Неопределенность измерения уменьшается при увеличении содержания спор и увеличении числа обзорных полей для подсчета (см. таблицу 2). Для того чтобы неопределенность измерения составляла менее 10%, должно быть подсчитано не менее 30, 20, 10 или 5 обзорных полей микроскопа с количеством спор около 100, 200, 1000 и 2000 на 200 дм³ воздуха соответственно.

Пригодность метода в рабочих условиях изначально была проверена на основе сравнительных измерений с применением PS 30 и MBASS30 (см. приложение B).

Для проверки пригодности метода отбора проб, установленного в настоящем стандарте, были проведены испытания в трех лабораториях. Параллельно было отобрано четыре пробы с использованием четырех разных пробоотборников (все PS 30 и MBASS30). Каждая проба была последовательно проанализирована двумя участвующими лабораториями. Результаты общего содержания спор, полученные разными пробоотборниками и подсчитанные в разных экспериментальных лабораториях, хорошо согласуются (см. таблицу B.1).