"ГОСТ 33407-2015. Межгосударственный стандарт. Коньяки, дистилляты коньячные, бренди. Определение содержания фенольных и фурановых соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 01.09.2016 N 1023-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 РАЗРАБОТАН Республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт метрологии" (БелГИМ)

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 22 июля 2015 г. N 78-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 1 сентября 2016 г. N 1023-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33407-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт разработан на основе методики выполнения измерений МВИ.МН 2665-2007 "Определение содержания фенольных и фурановых соединений в коньячных спиртах, коньяках и коньячной продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методика выполнения измерений", аттестованной БелГИМ. Свидетельство об аттестации N 431/2007 от 28.03.2007 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт распространяется на коньяки, коньячные дистилляты и бренди и устанавливает метод определения массовой концентрации фенольных и фурановых соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с использованием для регистрации диодно-матричного детектора.

Перечень соединений, определяемых в соответствии с настоящим стандартом: галловая кислота, 5-гидроксиметилфурфурол, фурфурол, 4-гидроксибензальдегид, ванилиновая кислота, 5-метилфурфурол, сиреневая кислота, ванилин, сиреневый альдегид, п-кумаровая кислота, синаповая кислота, конифериловый альдегид, синаповый альдегид, эллаговая кислота.

Диапазоны измерений для каждого соединения приведены в таблице 1.

Предел измерений (LOQ) составляет 0,10 мг/дм³ для всех определяемых соединений, для эллаговой кислоты - 0,20 мг/дм³.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.2.003-91 Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3639-79 Растворы водно-спиртовые. Методы определения концентрации этилового спирта

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <*> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

--------------------------------

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 предел измерений (LOQ): Наименьшее значение массовой концентрации определяемого соединения, которое может быть измерено с установленной точностью в соответствии с настоящим стандартом.

3.2 диапазон измерений: Область значений массовой концентрации соединения в пробе, определяемая по настоящему стандарту.

Метод основан на разделении смеси фенольных и фурановых соединений на хроматографической колонке с использованием градиентной системы элюирования. Идентификацию и количественное определение осуществляют с помощью диодно-матричного детектора по величине сигнала абсорбции, интегрированного по времени. Дополнительную идентификацию о соединении проводят спектральным методом.

При выполнении работ персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования:

- электробезопасности - по ГОСТ 12.2.003;

- пожарной безопасности - по ГОСТ 12.1.004;

- техники безопасности при работе в химической лаборатории;

- техники безопасности, изложенные в эксплуатационных документах на средства измерений и оборудование, применяемые при проведении измерений.

К проведению измерений и обработке результатов хроматографического анализа могут быть допущены лица, имеющие специальное образование, опыт работы в области жидкостной хроматографии, изучившие руководство по эксплуатации жидкостного хроматографа, инструкцию по использованию системы обработки хроматографических данных и методов спектрального анализа.

При проведении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

Помещения для проведения измерений должны быть оснащены приточно-вытяжной вентиляцией и подводкой воды.

Баня ультразвуковая.

Весы лабораторные электронные, диапазон взвешивания 0,0100 - 220,0000 г, погрешность взвешивания 0,0003 г.

Хроматограф высокоэффективный жидкостной, включающий:

- насос бинарный с вакуумным дегазатором;

- термостат колонок;

- детектор диодно-матричный (диапазон длин волн 190 - 950 нм);

- автосамплер;

- систему управления и обработки данных;

- колонку аналитическую обращенно-фазную хроматографическую длиной 250 мм, внутренний диаметр 4 мм, размер зерна 5 мкм <*>.

--------------------------------

<*> Примером подходящего продукта является хроматографическая колонка LichroCART 250-4 Superspher 100 P-18. Данная информация приведена для удобства и не означает признания названного продукта пользователями настоящего стандарта.

Иономер универсальный в комплекте с электродами, диапазон измерений от 1 до 19 ед. pH, погрешность 0,05 ед. pH.

Устройство для фильтрации элюирующих растворов.

Виалы для автосамплера вместимостью 2 см³.

Колбы 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 1-2-1-1, 1-2-1-5 по ГОСТ 29227.

Фильтры мембранные из регенерированной целлюлозы d = 47 мм, d_пор = 0,45 мкм.

Фильтры мембранные из регенерированной целлюлозы d = 25 мм, d_пор = 0,25 мкм.

Шприц медицинский вместимостью 5 см³.

4-гидроксибензальдегид, содержание основного вещества не менее 96,0%.

5-гидроксиметилфурфурол, содержание основного вещества не менее 96,0%.

5-метилфурфурол, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Ванилин, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Кислота ванилиновая, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Кислота калловая, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.

Альдегид конифериловый, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Метанол для ВЭЖХ.

Кислота п-кумаровая, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Кислота синаповая, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Альдегид синаповый, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Кислота сиреневая, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Альдегид сиреневый, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья высшей очистки.

Фурфурол, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Кислота эллаговая, содержание основного вещества не менее 96,0%.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже указанных.

Отбор проб продукции для определения фенольных и фурановых соединений проводят в соответствии с действующими нормативными документами на отбор проб соответствующего вида продукции.

Отбор проб должен обеспечивать однородность и репрезентативность представленной пробы.

Проба, доставленная в лабораторию на испытание, не должна быть повреждена или изменена во время транспортирования и хранения.

Пипеткой отбирают 5 см³ ледяной уксусной кислоты (плотностью 1,055 г/см³), переносят в мерную колбу вместимостью 1 дм³, содержащую 400 - 500 см³ дистиллированной воды, хорошо перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой. pH приготовленного элюирующего раствора B должен находится в диапазоне 2,95 - 3,05 ед. pH.

В качестве элюирующего раствора A используют метанол для ВЭЖХ.

Перед применением все растворы фильтруют через фильтр из регенерированной целлюлозы с диаметром 47 мм, диаметром пор 0,45 мкм.

Готовят 1 дм³ 50%-ного (объемная доля) раствора этилового спирта путем разбавления этилового ректификованного спирта из пищевого сырья высшей очистки. Объем этилового спирта, необходимый для разбавления, V₂, см³, вычисляют по формуле

где C₂ - объемная доля этилового спирта, полученная после разбавления, %;

V₁ - объем приготавливаемого 50%-ного раствора этилового спирта, см³;

C₁ - объемная доля этилового спирта, измеренная в соответствии с ГОСТ 3639, %.

8.3.1 Приготовление многокомпонентного основного раствора "A" с массовой концентрацией определяемых соединений приблизительно 100 мг/дм³ для каждого соединения

Навеску каждого соединения массой 0,0230 - 0,0270 г взвешивают непосредственно в мерную колбу вместимостью 250 см³. Результат взвешивания фиксируют с точностью до 0,0001 г. В колбу с навесками добавляют 100 - 120 см³ раствора этилового спирта (см. 8.2.3). Раствор помещают в ультразвуковую баню на 15 - 20 мин при температуре 25 °C - 30 °C до полного растворения, доводят до метки раствором этилового спирта (см. 8.2.3) при температуре (20 +/- 2) °C. Точную массовую концентрацию каждого соединения в растворе вычисляют с учетом содержания основного вещества по формуле

где - массовая концентрация i-го соединения в растворе A, мг/дм³;

m_i - масса навески i-го соединения, мг;

P_i - содержание основного вещества i-го соединения, %;

V_A - объем мерной колбы, см³.

Основной раствор хранят в холодильнике при температуре от 3 °C до 8 °C в течение 3 мес.

Готовят шесть градуировочных растворов путем разбавления основного раствора "A" согласно таблице 2.

Для проведения градуировки используют свежеприготовленные растворы.

Жидкостной хроматограф подготавливают к работе в соответствии с инструкциями фирмы-производителя оборудования.

Используют колонку и хроматографические условия разделения, обеспечивающие удовлетворительное разделение многокомпонентной смеси определяемых соединений [см. рисунок А.1 (приложение А)].

Элюенты:

- A = метанол по 8.2.2;

- B = 0,5%-ный раствор уксусной кислоты, 2,95 - 3,05 ед. pH, приготовленный по 8.2.1.

Градиент:

- 95% B;

- 10 мин 85% B;

- 45 мин 60% B;

- 55 мин 2% B;

- 60 мин 95% B.

Скорость потока: 0,6 см³/мин.

Температура: 35 °C.

"Post time": 10 мин.

Детектирование: UV-DAD, 280 нм.

Для определения рабочего диапазона массовых концентраций и линейности функции градуировки выполняют начальную градуировку хроматографа. Ее выполняют для галловой кислоты, 5-гидроксиметилфурфурола, фурфурола, эллаговой кислоты по шести рабочим градуировочным растворам, для остальных определяемых соединений - по пяти рабочим градуировочным растворам (N 1 - 5). Каждый раствор хроматографируют не менее двух раз. Градуировочная зависимость должна иметь вид y = bx. Параметры градуировочной зависимости рассчитывают путем анализа линейной регрессии скорректированных площадей пиков. Правильность построения градуировочного графика контролируют значением достоверности аппроксимации: R² >= 0,999.

Отобранную и подготовленную в соответствии с 8.1 пробу фильтруют через систему шприц-фильтр (используя мембранный фильтр из регенерированной целлюлозы d = 25 мм, d_пор = 0,25 мкм) в виалу для автосамплера. Подготовленная для измерения проба должна быть прозрачной.

Ежедневно перед началом измерений выполняют оперативный текущий контроль стабильности градуировочного графика. Для этого анализируют рабочий градуировочный раствор, массовая концентрация которого должна быть не менее 20% от массовой концентрации максимального градуировочного раствора, хроматографируя его не менее двух раз. Первое измерение выбранного градуировочного раствора проводят перед началом выполнения анализа серии проб. Если разница между измеренной массовой концентрацией каждого соединения в выбранном градуировочном растворе и его фактической массовой концентрацией, выраженной в процентах, по отношению к фактической массовой концентрации, не превышает норматива стабильности градуировки K_гр, градуировку считают достоверной и переходят к анализу серии проб по 9.3. Если это требование не выполняется, то проводят повторную градуировку прибора.

Норматив стабильности градуировки составляет:

- для диапазона массовых концентраций от 0,2C_макс до 0,4C_макс (включительно) - 7%;

- для диапазона массовых концентраций свыше 0,4C_макс до C_макс (включительно) - 4%, где C_макс - массовая концентрация максимального градуировочного раствора.

После завершения анализа проб проводят второе измерение выбранного градуировочного раствора, сравнивая результат измерений с нормативом стабильности градуировки так, как это описано выше. В случае невыполнения данного условия проводят повторное измерение выбранного градуировочного раствора. Если при этом полученные значения снова не удовлетворяют вышеприведенным требованиям, выявляют и устраняют причины несоответствия, а затем вновь проводят измерения серии проб.

При проведении измерений с ручным вводом проб серия состоит из 6 - 10 проб. При проведении измерений с вводом пробы автосамплером серия состоит из 10 - 15 проб.

Для контроля степени чистоты реактивов и правильности работы хроматографа, а также для предотвращения появления ложноположительных пиков необходимо проводить измерение "холостой" пробы. Измерение "холостой" пробы проводят после измерения градуировочного раствора при проверке стабильности градуировки, а также после выполнения анализа серии проб. В качестве "холостой" пробы используют раствор этилового спирта, приготовленного по 8.2.3, прошедшего процедуру пробоподготовки по 8.6. Если в "холостой" пробе обнаруживают любое из определяемых соединений, выявляют причины и устраняют источники загрязнения.

Проводят измерение подготовленной по 8.6 пробы.

Пробу хроматографируют не менее двух раз. Пики соединений в пробе должны быть правильно проинтегрированы, при необходимости результаты интегрирования площади пика корректируют. Если вычисленная массовая концентрация соединения в определяемой пробе превышает верхнюю границу диапазона градуировки, пробу разбавляют раствором этилового спирта, приготовленного по 8.2.3 и повторяют измерение.

При отсутствии пика определяемого соединения на характеристическом времени удерживания делают вывод, что данное соединение в пробе отсутствует.

Если время удерживания определяемого соединения на хроматограмме определяемой пробы совпадает со временем удерживания определяемого соединения градуировочного раствора, то предполагают, что данное соединение в пробе присутствует.

Для дополнительной идентификации определяемого соединения результат подтверждают сравнением спектра поглощения определяемого соединения в определяемой пробе с данными спектральных библиотек для определяемого соединения.

Одновременно необходимо оценить возможность присутствия загрязняющих примесей в определяемом соединении по чистоте пика с помощью статистического анализа, выполняемого программным обеспечением путем автоматического сопоставления спектрограмм.

Значения показателя качества совпадения спектров "Match factor" в диапазоне 900 - 990 свидетельствуют о некотором спектральном сродстве идентифицируемых соединений. Все значения ниже 900 означают, что рассматриваются две спектрограммы различных веществ.

Заключение о присутствии искомого соединения в пробе можно сделать только в случае, если величина показателя качества совпадения спектров ("Match factor") по результатам анализа спектрограмм находится в интервале 990 - 1000.

Массовую концентрацию i-го соединения в пробе C_i, мг/дм³, вычисляют по формуле

где C_xi - массовая концентрация i-го соединения, полученная по градуировочному графику, мг/дм³;

K - коэффициент разбавления, вычисляемый по формуле

где V_р - объем разбавленного раствора пробы, см³;

V_а - объем исходного раствора пробы, см³.

Если величина C_i меньше предела измерения метода C_LOQ, то вычисления по 10.1 не проводят, а дают одностороннюю оценку массовой концентрации i-го соединения в пробе, мг/дм³, в виде:

где C_LOQ - предел измерения метода.

Предел измерения метода составляет:

C_LOQ = 0,1 мг/дм³ для всех определяемых соединений за исключением эллаговой кислоты;

C_LOQ = 0,2 мг/дм³ для эллаговой кислоты.

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, округленное до первого десятичного знака, при выполнении условия повторяемости по 12.1.

где C_i1, C_i2 - результаты параллельных определений массовой концентрации i-го соединения в пробе, мг/дм³.

Окончательный результат определения массовой концентрации фенольных и фурановых соединений при доверительной вероятности P = 0,95 представляют в следующем виде

где - результат измерений, полученный в соответствии с настоящим методом и вычисленный согласно разделу 10, мг/дм³;

- абсолютное значение показателя точности метода, мг/дм³.

Абсолютное значение показателя точности , мг/дм³, вычисляют, используя относительное значение показателя точности метода , %, указанное в таблице 3, по формуле

где 0,01 - коэффициент для пересчета процентов;

- среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений, мг/дм³.

Настоящий стандарт обеспечивает измерение массовой концентрации фенольных и фурановых соединений в указанном выше диапазоне с приписанными характеристиками погрешности, указанными в таблице 3.

Если содержание определяемого соединения в пробе выходит за верхнюю границу диапазона измерений, допускается разбавление подготовленного к измерению пробы, при этом метрологические характеристики следует использовать для массовой концентрации соединения, полученной в разбавленной пробе.

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, проводят в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6.

Вычисляют абсолютное расхождение между результатами единичных измерений |C₁ - C₂|, значение которого сравнивают с пределом повторяемости, приведенным в таблице 3.

Повторяемость результатов признают удовлетворительной при выполнении условия

При превышении предела повторяемости измерение повторяют. При повторном превышении указанного предела выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, их устраняют и измерение повторяют.

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, проводят в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6 следующим образом.

Каждая из двух лабораторий проводит измерения в соответствии с разделом 9 и получает результат измерений, обеспечивая контроль повторяемости по 12.1.

Вычисляют среднеарифметическое значение , мг/дм³, результатов измерений двух лабораторий и соответственно

Вычисляют абсолютное расхождение между результатами измерений полученными в двух лабораториях, значение которого сравнивают с пределом воспроизводимости, приведенным в таблице 3.

Результат признают удовлетворительным при выполнении условия

При превышении указанного предела воспроизводимости контрольное измерение повторяют. При повторном превышении указанного предела выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, их устраняют и измерение повторяют.

Оперативный контроль процедуры измерений предусматривает:

- проведение контрольной процедуры с использованием метода добавок;

- вычисление результата контрольной процедуры K_k;

- вычисление (установление) норматива контроля K;

- реализацию решающего правила контроля (сопоставление результата контрольной процедуры с нормативом контроля);

- принятие решений по результатам контроля.

При проведении оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок средствами контроля являются стабильные рабочие пробы и эти же пробы с известной добавкой определяемого соединения.

Оперативный контроль процедуры измерений выполняют в порядке и с периодичностью, установленными системой менеджмента качества лаборатории.

При использовании процедуры контроля с применением метода добавок необходимо предусмотреть, чтобы погрешности, обусловленные операциями введения добавок и погрешности средств измерений для введения добавок, не вносили статистически значимого вклада в погрешность результатов измерений содержания определяемого соединения в пробах.

Для проведения контрольной процедуры рабочую пробу делят на две части. Одну часть оставляют без изменений, во вторую делают добавку одного или нескольких соединений. Величину добавки выбирают в зависимости от массовой концентрации соединения в пробе без добавки, установленной по результатам предварительного анализа пробы, в размере от 50% до 150%. При этом содержание соединения в пробе с добавкой не должно превышать верхней границы диапазона измерений метода.

Проводят анализ пробы без добавки и пробы с введенной добавкой в условиях повторяемости. В качестве результатов контрольных измерений в пробе и в пробе с добавкой используют среднеарифметические значения двух результатов единичных измерений, расхождения между которыми не превышают предела повторяемости, указанного в таблице 3.

12.3.2 Вычисление результата контрольной процедуры K_k

Результат контрольной процедуры K_k, мг/дм³, вычисляют по формуле

где - результат контрольного измерения массовой концентрации определяемого соединения, мг/дм³;

C_k - контрольное значение массовой концентрации определяемого соединения, мг/дм³.

При проведении контрольной процедуры с использованием метода добавок K_k вычисляют по формуле

где - среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений массовой концентрации определяемого соединения в пробе с добавкой, мг/дм³;

- среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений массовой концентрации определяемого соединения в пробе без добавки, мг/дм³;

- вычисленная величина добавки определяемого соединения, мг/дм³.

12.3.3 Вычисление норматива контроля K

Норматив контроля K, мг/дм³ (мг/кг), вычисляют по формуле

где - характеристика погрешности результатов контрольного измерения, мг/дм³, соответствующая содержанию соединения в пробе без добавки;

- характеристика погрешности результатов контрольного измерения, мг/дм³, соответствующая содержанию соединения в пробе с добавкой, вычисленная по формуле

где 0,01 - коэффициент для пересчета процентов;

- относительное значение характеристики погрешности результатов измерений по методу, %, указанное в таблице 5;

- среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений массовой концентрации соединения в пробе с добавкой, мг/дм³.

Характеристику погрешности результатов контрольного измерения , мг/дм³ (мг/кг), соответствующую содержанию соединения в пробе без добавки, вычисляют по формуле

где 0,01 - коэффициент для пересчета процентов;

- относительное значение характеристики погрешности результатов измерений по методу, %,_ указанное в таблице 3;

- среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений массовой концентрации определяемого соединения в пробе без добавки, мг/дм³.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия

При невыполнении данного условия контрольную процедуру повторяют, начиная с этапа подготовки проб. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.