"ГОСТ EN 12014-3-2015. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение содержания нитрата и/или нитрита. Часть 3. Спектрофотометрический метод определения содержания нитрата и нитрита в мясных продуктах с применением ферментативного восстановления нитрата до нитрита"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 29.07.2015 N 1010-ст)

Цели, основные принципы и порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" на основе аутентичного перевода на русский язык европейского регионального стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 29 мая 2015 г. N 77-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 июля 2015 г. N 1010-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 12014-3-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому региональному стандарту EN 12014-3:2005 Foodstuffs - Determination of nitrate and/or nitrite content - Part 3: Spectrometric determination of nitrate and nitrite content of meat products after enzymatic reduction of nitrate to nitrite (Продукты пищевые. Определение содержания нитрата и/или нитрита. Часть 3. Спектрофотометрический метод определения содержания нитрата и нитрита в мясных продуктах с применением ферментативного восстановления нитрата до нитрита)

Международный стандарт разработан техническим комитетом CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы", секретариатом которого считается DIN (Германия).

Перевод с немецкого языка (de).

Официальные экземпляры европейского регионального стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и европейского регионального стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным европейским региональным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия - идентичная (IDT)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1. Область применения

Настоящий стандарт устанавливает спектрофотометрический метод определения содержания нитрата и нитрита в мясных продуктах. Метод прошел валидацию путем межлабораторных испытаний различных мясных продуктов с содержанием (массовой долей) нитрита от 9 до 22 мг/кг (млн^-1) в пересчете на нитрит натрия и с содержанием (массовой долей) нитрата от 23 до 48 мг/кг (млн^-1) в пересчете на нитрат натрия.

Примечание - Дополнительно экспериментально установлена применимость метода при суммарном содержании (массовой доле) в пробе нитрата и нитрита от 5 мг/кг (млн^-1) до 125 мг/кг (млн^-1) в пересчете на нитрит натрия. Подробная информация о применимости метода содержится в [1].

2. Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходим следующий ссылочный документ. Для недатированной ссылки применяют последнее издание ссылочного документа (включая все его изменения).

EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

3. Сущность метода

Определение нитрита основано на реакции нитрита в водном экстракте из пробы с сульфаниламидом и N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлоридом с образованием соединения красного цвета и спектрофотометрическом измерении интенсивности окраски раствора при длине волны 540 нм [2].

Определение нитрата основано на восстановлении нитрата в водном экстракте из пробы до нитрита ферментом нитратредуктазой с последующим проведением таким же образом реакции с сульфаниламидом и N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлоридом, в которой участвуют как нитрит, образовавшийся при восстановлении нитрата, так и нативный нитрит пробы. Интенсивность окраски раствора образовавшегося красного соединения измеряют спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Содержание нитрата в пробе находят по разнице результатов спектрофотометрических измерений.

4. Реактивы

4.1 Общие положения

Для проведения испытания при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и воду не ниже третьей степени чистоты по EN ISO 3696. При приготовлении растворов следует принимать во внимание массовую долю основного вещества в реактиве.

4.2 Натрия гидроксид, раствор молярной концентрации c(NaOH) = 1 моль/дм³.

4.3 Раствор Карреза I

Для приготовления раствора 150 г гексацианоферрата (II) калия [K₄[Fe(CN)₆·3H₂O] растворяют в некотором количестве воды, объем раствора доводят до 1000 см³ водой, раствор тщательно перемешивают. Полученный раствор хранят в сосуде из темного стекла. Срок годности раствора - 2 мес.

4.4 Раствор Карреза II

Для приготовления раствора 230 г уксуснокислого цинка (Zn(CH₃COO)₂·2H₂O) растворяют в некотором количестве воды, объем раствора доводят до 1000 см³ водой.

4.5 Реактивы для ферментативного определения нитрата <1>

--------------------------------

<1> Комплект для ферментативного определения нитрата и нитрита изготовляет компания Boehringer Mannheim/Roche Diagnostics, Mannheim, дистрибьютором которой является компания R-Biopharm, Дармштадт, Германия. Данная информация приведена исключительно для удобства применения настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой МГС указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия при условии, что они обеспечивают сопоставимость результатов.

4.5.1 Буферный раствор на основе имидазола с pH 7,8

В мерной колбе вместимостью 100 см³ растворяют 0,68 г имидазола (C₃H₄N₂) в 80 см³ воды. Значение pH раствора доводят до 7,8 добавлением раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 2 моль/дм³, после чего объем раствора доводят до 100 см³ водой.

4.5.2 Раствор тетранатриевой соли бета-никотинамидадениндинуклеотидфосфата в восстановленной форме (, массовая доля основного вещества - не менее 98%)

Растворяют 125 мг восстановленного и 2,5 мг динатриевой соли флавинадининдинуклеотида с массовой долей основного вещества не менее 88% в 50 см³ буферного раствора имидазола по 4.5.1. Раствор используют свежеприготовленным.

4.5.3 Буферный раствор нитратредуктазы

Для приготовления раствора 11 мг лиофилизата нитратредуктазы из грибов рода Aspergillus (номер Комиссии по ферментам (ЕС) 1.6.6.2) активностью примерно 0,4 Е/мг <2> растворяют в 10 см³ буферного раствора на основе имидазола по 4.5.1. В раствор добавляют 50 мг динатриевой соли дигидрата этилендиаминтетрауксусной кислоты.

--------------------------------

<2> Обозначение международной (стандартной) единицы активности, определяемой как количество фермента, катализирующее преобразование 1 мкмоль субстрата за минуту в заданных условиях.

Срок годности раствора - 14 сут при температуре хранения 4 °C.

4.6 Реактивы для проведения цветной реакции

4.6.1 Реактив 1

Реактив готовят растворением 8 г сульфаниламида в 500 см³ воды при нагревании на водяной бане по 5.3. Раствор охлаждают до комнатной температуры и при необходимости фильтруют, после чего в него добавляют 330 см³ соляной кислоты по 4.9 при постоянном перемешивании. Объем раствора доводят до 1000 см³ водой. Раствор стабилен в течение нескольких недель при хранении при комнатной температуре.

4.6.2 Реактив 2

0,330 г N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида растворяют в 250 см³ воды. Срок годности раствора - 1 неделя при хранении в сосуде из темного стекла.

4.6.3 Смешанный реактив для цветной реакции

Смешанный реактив для цветной реакции готовят в день проведения испытаний в необходимом количестве путем смешивания равных объемов реактива 1 по 4.6.1 и реактива 2 по 4.6.2.

4.7 Растворы нитрита натрия

4.7.1 Общие положения

Рекомендуется готовить растворы нитрита натрия в день их использования.

4.7.2 Основной раствор нитрита натрия массовой концентрации 

Порцию нитрита натрия массой 200 мг, взвешенной с погрешностью +/- 0,1 мг, растворяют в некотором количестве воды в мерной колбе вместимостью 500 см³, объем содержимого в колбе доводят водой до метки.

Срок годности основного раствора при температуре хранения 4 °C - 2 недели.

4.7.3 Разбавленный основной раствор нитрита натрия массовой концентрации 

В мерную колбу вместимостью 500 см³ пипеткой вносят 25 см³ основного раствора нитрита калия по 4.7.2, объем содержимого в колбе доводят водой до метки.

4.7.4 Градуировочные растворы нитрита натрия

В мерные колбы вместимостью 200 см³ пипеткой вносят 10, 20, 30 и 40 см³ разбавленного основного раствора нитрита натрия по 4.7.3, что соответствует 0,13; 0,27; 0,40 и 0,53 мг нитрит-иона. К растворам добавляют раствор гидроксида натрия по 4.2 до получения значения pH в интервале от 8,0 до 8,5 (значение pH измеряют с использованием pH-метра по 5.5). Далее в колбы последовательно вносят по 4 см³ растворов Карреза 1 по 4.3 и Карреза 2 по 4.4, перемешивая содержимое колб после каждого внесения, после чего объем содержимого в колбах доводят водой до метки, содержимое колб перемешивают и фильтруют через складчатый бумажный фильтр по 5.4, отбрасывая первые 20 см³ фильтрата.

4.8 Растворы нитрата калия

4.8.1 Общие положения

Рекомендуется готовить градуировочные растворы нитрата калия в день их использования.

4.8.2 Основной раствор нитрата калия массовой концентрации 

Порцию нитрата калия массой 300 мг, взвешенной с погрешностью +/- 0,1 мг, растворяют в некотором количестве воды в мерной колбе вместимостью 500 см³, объем содержимого в колбе доводят водой до метки.

4.8.3 Разбавленный основной раствор нитрата калия массовой концентрации 

В мерную колбу вместимостью 500 см³ пипеткой вносят 25 см³ основного раствора нитрата калия по 4.8.2, объем содержимого в колбе доводят водой до метки.

4.8.4 Градуировочные растворы нитрата калия

В мерные колбы вместимостью 200 см³ пипеткой вносят 10, 20, 30 и 40 см³ разбавленного основного раствора нитрата калия по 4.8.3, что соответствует 0,14; 0,27; 0,41 и 0,55 мг нитрит-иона. К растворам добавляют раствор гидроксида натрия по 4.2 до получения значения pH в интервале от 8,0 до 8,5 (значение pH измеряют с использованием pH-метра). Далее в колбы последовательно вносят по 4 см³ растворов Карреза 1 по 4.3 и Карреза 2 по 4.4, перемешивая содержимое колб после каждого внесения, после чего объем содержимого в колбах доводят водой до метки, содержимое колб перемешивают и фильтруют через складчатый фильтр по 5.4, отбрасывая первые 20 см³ фильтрата.

4.9 Кислота соляная концентрированная массовой долей 37%, не содержащая нитрит-ионов.

5. Приборы и оборудование

5.1 Общие положения

При проведении испытания используют обычные лабораторные приборы и оборудование, в частности, перечисленные ниже.

5.2 Оборудование для гомогенизации проб, такое как измельчитель механический или электрический, обеспечивающий получение гомогенных проб, высокоскоростной гомогенизатор или мясорубка с решеткой с отверстиями диаметром не более 4,5 мм.

5.3 Баня водяная, пригодная для поддержания рабочей температуры 100 °C.

5.4 Фильтры бумажные складчатые, не содержащие нитрата и нитрита.

5.5 pH-метр в комплекте с измерительным электродом и электродом сравнения.

5.6 Спектрофотометр, пригодный для проведения измерений при длине волны 540 нм в комплекте с кварцевыми или полимерными кюветами, не обладающими значимой оптической плотностью при 540 нм.

6. Процедура проведения испытания

6.1 Приготовление раствора пробы для анализа

Пробу гомогенизируют с использованием подходящего оборудования по 5.2. При этом следует обращать внимание на то, чтобы температура пробы при гомогенизации не превышала 25 °C. При использовании мясорубки пробу пропускают через нее не менее двух раз.

Из гомогенизированной пробы отбирают пробу для анализа массой примерно 10 г, взвешенной с погрешностью +/- 0,01 г, и помещают ее в широкогорлую коническую колбу. В колбу добавляют 50 см³ воды, содержимое колбы гомогенизируют в течение 30 - 60 с. Диспергирующий элемент гомогенизатора ополаскивают примерно 50 см³ горячей воды, смыв добавляют в колбу с пробой для анализа. Значение pH полученной смеси доводят до 8,0 - 8,5 по pH-метру добавлением раствора гидроксида натрия по 4.2, после чего полученную смесь выдерживают 15 мин на кипящей водяной бане при периодическом перемешивании.

Примечание - При испытании сырокопченых колбас следует обращать внимание, чтобы значение pH экстракта не превышало 8,5. В противном случае, после добавления растворов Карреза будет затруднительно получить прозрачный фильтрат. При испытании вареных колбас вероятность такого эффекта мала, поэтому допускается, чтобы значение pH смеси достигало 9,5.

После охлаждения до комнатной температуры содержимое колбы количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 см³. В колбу последовательно вносят по 4 см³ растворов Карреза 1 по 4.3 и Карреза 2 по 4.4, перемешивая содержимое колбы после каждого внесения. Объем содержимого в мерной колбе доводят до метки водой, содержимое колбы перемешивают и фильтруют через складчатый бумажный фильтр по 5.4, отбрасывая первые 20 см³ фильтрата. Полученный затем прозрачный фильтрат используют в качестве раствора пробы для дальнейшего испытания.

6.2 Проведение градуировки

6.2.1 Построение градуировочного графика для определения нитрита

В пробирки вносят по 2,0 см³ каждого градуировочного раствора нитрита натрия по 4.7.4, 1,0 см³ воды и 3,0 см³ смешанного реактива для цветной реакции по 4.6.3. Содержимое пробирок перемешивают и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30 мин. По истечении указанного времени измеряют оптическую плотность каждого раствора на спектрофотометре по 5.6 при длине волны 540 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Градуировочный график строят, откладывая в системе координат измеренные значения оптической плотности четырех растворов нитрита натрия по 4.7.4 против соответствующих им масс нитрит-иона в миллиграммах на 200 см³ раствора.

6.2.2 Построение градуировочного графика для определения нитрата (определения нитрита после восстановления нитрата)

В пробирки вносят по 0,2 см³ раствора по 4.5.2, 2,0 см³ каждого градуировочного раствора нитрата калия по 4.8.4 и 0,8 см³ буферного раствора нитратредуктазы по 4.5.3. Содержимое пробирок перемешивают и выдерживают 1 ч при комнатной температуре. Затем в пробирки вносят по 3,0 см³ смешанного реактива для цветной реакции по 4.6.3, содержимое пробирок перемешивают и выдерживают в темноте в течение 30 мин. По истечении указанного времени измеряют оптическую плотность каждого раствора на спектрофотометре по 5.6 при длине волны 540 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Градуировочный график строят, откладывая в системе координат измеренные значения оптической плотности четырех растворов нитрата калия по 4.8.4 после восстановления нитрата до нитрита против соответствующих им масс нитрит-иона в миллиграммах на 200 см³ раствора.

6.3 Количественное определение нитрита

В кювету спектрофотометра вносят 2,0 см³ раствора пробы по 6.1, 1,0 см³ воды и 3,0 см³ смешанного реактива для цветной реакции по 4.6.3. Содержимое кюветы перемешивают и выдерживают в темноте в течение 30 мин. По истечении указанного времени измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре по 5.6 при длине волны 540 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

6.4 Определение общего содержания нитрита после восстановления нитрата до нитрита

В кювету спектрофотометра вносят 0,2 см³ раствора по 4.5.2, 2,0 см³ раствора пробы по 6.1 и 0,8 см³ раствора нитратредуктазы по 4.5.3. Содержимое кюветы перемешивают и выдерживают 1 ч при комнатной температуре. Затем в кювету добавляют 3,0 см³ смешанного реактива для цветной реакции по 4.6.3, содержимое кюветы перемешивают и выдерживают в темноте в течение 30 мин. По истечении указанного времени измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре по 5.6 при длине волны 540 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

7. Обработка результатов

7.1 Расчет содержания нитрита

Абсолютное количество нитрита , соответствующее измеренному по 6.3 значению оптической плотности раствора пробы при проведении испытания без этапа ферментативного восстановления, определяют по градуировочному графику, построенному по 6.2.1.

Содержание (массовую долю) нитрита в пробе в расчете на нитрит натрия , мг/кг (млн^-1), рассчитывают по формуле

где - масса нитрит-иона в 200 см³ раствора пробы при проведении испытания без восстановления нитрата до нитрита, определенная по градуировочному графику по 6.2.1, мг;

m - масса пробы для анализа, использованной для приготовления раствора пробы объемом 200 см³, г;

1,50 - коэффициент k пересчета содержания нитрит-иона в содержание нитрита натрия (k = 68,995/46,005).

Результат испытания округляют до целого числа.

7.2 Расчет содержания нитрата

Абсолютное количество нитрита после восстановления нитрата до нитрита , соответствующее измеренному по 6.4 значению оптической плотности раствора пробы, определяют по градуировочному графику, построенному по 6.2.2. Содержание нитрата в расчете на нитрат натрия определяют по разнице между общим содержанием нитрита после восстановления нитрата до нитрита, определенным по 6.4, и содержанием нативного нитрита, определенным по 6.3.

Содержание (массовую долю) нитрата в пробе в расчете на нитрат натрия , мг/кг (млн^-1), рассчитывают по формуле

где - масса нитрит-иона в 200 см³ раствора пробы при проведении испытания с восстановлением нитрата до нитрита, определенная по градуировочному графику по 6.2.2, мг;

- масса нитрит-иона в 200 см³ раствора пробы при проведении испытания без восстановления нитрата до нитрита, определенная по градуировочному графику по 6.2.1, мг;

m - масса пробы для анализа, г;

1,85 - коэффициент k пересчета содержания нитрит-иона в содержание нитрата натрия (k = 84,994/46,005).

Результат испытания округляют до целого числа.

7.3 Использование градуировочной характеристики, найденной методом линейной регрессии

В качестве альтернативы допускается использовать в расчетах градуировочную функцию, установленную методом линейной регрессии.

8. Прецизионность

8.1 Общие положения

Подробности межлабораторных испытаний по определению прецизионности методики приведены в приложении A. Значения метрологических характеристик, полученные в результате межлабораторных испытаний, могут быть неприменимы к другим содержаниям аналита и другим типам матриц, чем те, что указаны в приложении A.

8.2 Повторяемость

Абсолютное расхождение между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в одной лаборатории одним оператором с использованием одного оборудования в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости r более чем в 5% случаев.

Пределы повторяемости при определении нитрита натрия равны следующим значениям:

- для вареной колбасы к пиву с добавлением окорока при r = 3,5 мг/кг (млн^-1);

- для венских сосисок при r = 1,7 мг/кг (млн^-1).

Пределы повторяемости при определении нитрата натрия равны следующим значениям:

- для вареной колбасы к пиву с добавлением окорока при r = 8,8 мг/кг (млн^-1);

- для сырокопченого окорока при r = 10,7 мг/кг (млн^-1);

- для венских сосисок при r = 2,8 мг/кг (млн^-1).

8.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования не должно превышать предел воспроизводимости R более чем в 5% случаев.

Пределы воспроизводимости при определении нитрита натрия равны следующим значениям:

- для вареной колбасы к пиву с добавлением окорока при R = 5,9 мг/кг (млн^-1);

- для венских сосисок при R = 3,7 мг/кг (млн^-1).

Пределы повторяемости при определении нитрата натрия равны следующим значениям:

- для вареной колбасы к пиву с добавлением окорока при R = 11,9 мг/кг (млн^-1);

- для сырокопченого окорока при R = 14,0 мг/кг (млн^-1);

- для венских сосисок при R = 7,0 мг/кг (млн^-1).

8.4 Предел количественного определения

При проведении испытания в соответствии с настоящим методом пределы количественного определения нитрита натрия и нитрата натрия составляют соответственно 1,4 и 3,6 мг/кг (млн^-1).

9. Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать:

a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;

b) использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

c) результаты испытания с указанием единиц измерения;

d) дату и способ отбора пробы (если он известен);

e) дату поступления пробы в лабораторию;

f) дату проведения испытания;

g) сведения о том, была ли проведена оценка повторяемости;

h) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытания;

i) все операции, не оговоренные в методике или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат испытания.

Приведенные ниже в таблицах A.1 и A.2 данные по прецизионности методики получены в результате межлабораторных испытаний, проведенных в соответствии с [3]. Испытания проведены под руководством Федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины, Берлин, ФРГ [1], [2].