"ГОСТ EN 15607-2015. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение D-биотина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 21.07.2015 N 949-ст)

Цели, основные принципы и порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" на основе аутентичного перевода на русский язык европейского регионального стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 29 мая 2015 г. N 77)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 21 июля 2015 г. N 949-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 15607-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому региональному стандарту EN 15607:2009 Foodstuffs - Determination of D-biotin by HPLC (Продукты пищевые. Определение D-биотина высокоэффективной жидкостной хроматографией).

Европейский региональный стандарт разработан техническим комитетом CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы", секретариатом которого является DIN (Германия).

Перевод с немецкого языка (de).

Официальные экземпляры европейского регионального стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и европейского регионального стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным европейским региональным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия - идентичная (IDT)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания D-биотина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Метод прошел валидацию при межлабораторных сравнительных испытаниях с использованием как обогащенных проб, так и проб с естественным содержанием D-биотина, а именно концентратов типа сухого завтрака - мюсли, сухого молока для грудных детей, лиофилизированных зеленых овощей с ветчиной, лиофилизированного куриного бульона и обогащенного апельсинового сока в диапазоне значений содержания D-биотина от 16 до 200 мкг/100 г (см. приложение B).

Примечания

1 Настоящим методом может также определяться D-биоцитин, хотя ни в одной из проб, использовавшихся при межлабораторных сравнительных испытаниях, D-биоцитин не содержался. Тем не менее открываемость как D-биотина, так и D-биоцитина превышает 90% (см. [2] и [3]).

2 При анализе проб, содержащих куриные яйца, метод приводит к заниженным значениям содержания D-биотина.

Приведенные ниже ссылочные нормативные документы являются обязательными для применения настоящего стандарта. Для датированных ссылок применимо только цитируемое издание. В случае недатированных ссылок используют последнее издание документа, включая все изменения.

EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

Метод основан на выделении D-биотина из проб пищевых продуктов обработкой ферментами и количественном определении методом ВЭЖХ с послеколоночной дериватизацией ([2], [3]).

Комплексообразование D-биотина с белком авидином является весьма специфическим. Поэтому авидин, ковалентно связанный с флуоресцентной меткой - флуоресцеин-5-изотиоцианитом, используется в качестве реагента для послеколоночной дериватизации D-биотина ([4], [5]).

Если не указано иное, то при анализе используют только реактивы гарантированной чистоты и воды, по крайней мере, степени чистоты 1 по EN ISO 3696 или повторно перегнанную дистиллированную воду.

4.2.1 Метанол для ВЭЖХ, массовая доля основного вещества w(CH₃OH) не менее 99,8%.

4.2.2 Раствор серной кислоты молярной концентрации c(H₂SO₄) = 1 моль/дм³.

4.2.3 Раствор серной кислоты молярной концентрации c(H₂SO₄) = 1,5 моль/дм³.

4.2.4 Лимонная кислота моногидрат, массовая доля основного вещества w(C₆H₈O₇·H₂O) не менее 99,7%.

4.2.5 Гидрофосфат натрия 2-водный, массовая доля основного вещества w(Na₂HPO₄·2H₂O) не менее 99,8%.

4.2.6 Глутатион, массовая доля основного вещества w(C₁₀H₁₇N₃O₆S) не менее 98%.

4.2.7 Этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) 2-водный, массовая доля основного вещества w(C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O) не менее 99%.

4.2.8 Гидрофосфат калия, массовая доля основного вещества w(K₂HPO₄) не менее 96%.

4.2.9 Дигидрофосфат калия, массовая доля основного вещества w(KH₂PO₄) не менее 99,5%.

4.2.10 Приготовление цитратного буферного раствора

0,462 г моногидрата лимонной кислоты (4.2.4) и 1,05 г гидрофосфата натрия 2-водного (4.2.5) растворяют в 450 см³ дистиллированной воды. Устанавливают значение pH раствора, равное 5,7, при помощи раствора серной кислоты (4.2.3) и затем разбавляют раствор до объема 500 см³.

Срок хранения раствора - 1 день.

4.2.11 Приготовление раствора глутатиона массовой концентрации 

30 мг глутатиона (4.2.6) растворяют в 3 см³ дистиллированной воды.

Срок хранения раствора - 1 день.

4.2.12 Приготовление раствора ЭДТА массовой концентрации 

0,1 г ЭДТА (4.2.7) растворяют в 10 см³ дистиллированной воды.

Срок хранения раствора - 1 день.

4.2.13 Приготовление раствора гидрофосфата калия молярной концентрации c(K₂HPO₄) = 0,1 моль/дм³

17,4 г гидрофосфата калия (4.2.8) растворяют в 1000 см³ воды.

Срок хранения раствора - 2 дня.

4.2.14 Приготовление раствора дигидрофосфата калия молярной концентрации c(KH₂PO₄) = 0,1 моль/дм³

13,6 г дигидрофосфата калия (4.2.9) растворяют в 1000 см³ воды.

Срок хранения раствора - 2 дня.

4.2.15 Приготовление фосфатного буферного раствора с pH 6,0

Растворы гидрофосфата калия (4.2.13) и дигидрофосфата калия (4.2.14) смешивают в такой пропорции, чтобы значение pH приготовленного раствора составляло 6,0 (например, 30 объемных частей раствора по 4.2.13 и 70 объемных частей раствора по 4.2.14).

Срок хранения раствора - 7 дней при комнатной температуре.

4.2.16 Приготовление фосфатного буферного раствора с pH 7,0

Растворы гидрофосфата калия (4.2.13) и дигидрофосфата калия (4.2.14) смешивают в такой пропорции, чтобы значение pH приготовленного раствора составляло 7,0 (например, 40 объемных частей раствора по 4.2.13 и 60 объемных частей раствора по 4.2.14).

Срок хранения раствора - 7 дней при комнатной температуре.

4.2.17 Папаин порошкообразный (CAS 9001-73-4) с удельной каталитической активностью 15 нкат/мг <1> по отношению к этиловому эфиру N-бензоил-L-аргинина (BAEE) при pH 6,2 и 25 °C. Удельная каталитическая активность 15 нкат/мг соответствует 1 МЕ/мг (МЕ - международная единица каталитической активности).

--------------------------------

<1> Катал (кат) является производной единицей системы СИ для каталитической активности. 1 катал - это такая каталитическая активность, при которой скорость реакции при заданных условиях увеличивается на 1 моль/с.

4.2.18 Раствор папаина массовой концентрации 20 г/дм³

4.2.18.1 Приготовление раствора

1 г порошкообразного папаина (4.2.17) растворяют в 50 см³ цитратного буферного раствора (4.2.10). Срок хранения раствора - 5 дней при 4 °C.

4.2.18.2 Проверка активности папаина

Активность папаина может быть проверена путем приготовления второго экстракта (см. 6.2) с удвоенным количеством фермента. Найденное содержание биотина должно соответствовать расчетному значению и ни в коем случае не превышать его.

Примечание - При межлабораторных сравнительных испытаниях был использован порошкообразный папаин, поставщиком которого была компания VWR International GmbH, 20а, 64295 Darmstadt, Ref.-Nr 26.146.180t <1>.

--------------------------------

<1> Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного поставщика. Могут быть использованы аналогичные продукты, если доказано, что их применение приводит к идентичным результатам.

4.2.19 Конъюгат Авидин - флуоресцеинизотиоцианат (Avidin-FITC), содержащий 80% протеина (от 2 до 4 моль флуоресцеинизотиоцианата на каждый моль авидина).

4.2.20 Исходный раствор для послеколоночной дериватизации массовой концентрации 

2,5 мг конъюгата авидин - флуоресцеинизотиоцианат (4.2.19) растворяют в 50 см³ фосфатного буферного раствора с pH 7,0 (4.2.16). Срок хранения раствора - 14 дней при 4 °C.

4.2.21 Рабочий раствор для послеколоночной дериватизации массовой концентрации 

25 см³ исходного раствора для послеколоночной дериватизации (4.2.20) смешивают с 600 см³ фосфатного буферного раствора с pH 7,0 (4.2.16). Полученный раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.5). Раствор устойчив при хранении в темноте в течение 8 ч.

4.2.22 Подвижная фаза для ВЭЖХ

80 объемных частей фосфатного буферного раствора с pH 6,0 (4.2.15) смешивают с 20 объемными частями метанола (4.2.1) и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.5).

4.2.23 Така-диастаза, выделенная из Aspergillus Oryzae, удельная каталитическая активность 1500 нкат/мг (соответствует 100 МЕ/мг), для проб с высоким содержанием крахмала.

4.3.1 Общие положения

D-биотин и D-биоцитин могут быть приобретены у разных поставщиков. Необходимо убедиться в том, что пики D-биотина и D-биоцитина разделяются до базовой линии на хроматограмме раствора их смеси. Массовая доля основного вещества в образце сравнения биотина может быть установлена в соответствии с методом Европейской Фармакопеи [6].

4.3.2 D-Биотин, массовая доля основного вещества w(C₁₀H₁₆N₂O₃S) не менее 99%.

4.3.3 D-Биоцитин, массовая доля основного вещества w(C₁₆H₂₈N₄O₄S) не менее 98%.

4.4.1 Приготовление исходного раствора D-биотина массовой концентрации 

Приблизительно 10 мг образца сравнения D-биотина (4.3.2), взвешенного с погрешностью +/- 0,1 мг, растворяют в 100 см³ дистиллированной воды. Растворение может продолжаться от 4 до 5 ч. Срок хранения раствора - 2 мес при минус 18 °C.

4.4.2 Приготовление исходного раствора D-биоцитина массовой концентрации 

Приблизительно 10 мг образца сравнения D-биоцитина (4.3.3), взвешенного с погрешностью +/- 0,1 мг, растворяют в 100 см³ дистиллированной воды. Срок хранения раствора - 2 мес при минус 18 °C.

4.5.1 Стандартные растворы D-биотина массовой концентрации от 0,05 до 0,30 мкг/см³

Приготавливают промежуточный раствор D-биотина путем разбавления 1 см³ исходного раствора (4.4.1) до 10 см³ дистиллированной водой. Затем готовят шесть градуировочных растворов, разбавляя 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 и 3,0 см³ промежуточного раствора до 100 см³ дистиллированной водой. Срок хранения растворов 1 день.

4.5.2 Стандартный раствор D-биоцитина массовой концентрации 

Приготавливают промежуточный раствор путем разбавления 1 см³ исходного раствора (4.4.2) до 10 см³ дистиллированной водой. Затем 3,0 см³ промежуточного раствора разбавляют до 100 см³ дистиллированной воды. Срок хранения раствора 1 день.

5.1 Общие положения

При проведении испытания используют обычное лабораторное оборудование, в частности, следующее.

5.2 Термостат, поддерживающий температуру на уровне (37 +/- 2) °C.

5.3 Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, флуориметрического детектора, позволяющего проводить измерения при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны регистрации 520 нм, и системы для сбора и обработки данных, например интегратора.

5.4 Обращенно-фазовые аналитические колонки, например 100 RP-18 endcapped <1>

Приведенные ниже характеристики аналитической колонки обеспечивают разделение пиков аналитов до базовой линии:

a) длина колонки 250 мм;

b) внутренний диаметр 4,0 мм;

c) размер частиц 5 мкм.

Допускается использовать колонки иных размеров и с иным размером частиц. При этом параметры разделения на таких колонках должны быть проверены, с тем чтобы гарантировать получение сопоставимых результатов. Критерием эффективности подходящих аналитических колонок является разделение пиков аналитов до базовой линии.

5.5 Устройства для фильтрования

Устройства для фильтрования подвижной фазы большого и малого размера, снабженные, например, фильтрами с размером пор 0,45 мкм.

Примечание - Фильтрование подвижной фазы и растворов проб через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм перед применением или инжектированием продлевает срок жизни колонок.

5.6 Послеколоночный реактор, состоящий из системы для ввода реагента, например Т-образного смесителя со следующим за ним капиллярным реактором длиной 10 м, выполненным из политетрафторэтиленовой трубки внутреннего диаметра 0,5 мм, смотанной по спирали диаметром 14 мм, изготовленной, например, по [7] (модель KOT2). Капиллярные реакторы могут быть приобретены у компаний Супелко или MicroSolv Tech <1>.

--------------------------------

<1> Эта информация приведена только для удобства пользователя настоящего стандарта и не означает поддержки этих продуктов. Допускается использование аналогичных продуктов, если доказано, что их использование приводит к аналогичному результату.

6.1 Подготовка испытуемой пробы

Испытуемую пробу гомогенизируют. Грубые материалы размалывают в подходящей мельнице и тщательно перемешивают. Чтобы исключить длительное воздействие высоких температур, пробу предварительно охлаждают.

6.2 Экстракция

Пробу массой от 0,5 до 10 г (что приблизительно соответствует содержанию D-биотина от 2 до 15 мкг) взвешивают с точностью до 1 мг и помещают в колбу Эрленмейера. К пробе добавляют 300 мм³ раствора глутатиона (4.2.11), 300 мм³ раствора ЭДТА (4.2.12), 30 см³ цитратного буферного раствора (4.2.10) и 3 см³ раствора папаина (4.2.18). При высоком содержании крахмала добавляют 100 мг така-диатазы (4.2.23). Смесь выдерживают в течение ночи в термостате при 37 °C при постоянном перемешивании. После охлаждения раствор переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³ и разбавляют дистиллированной водой до метки. Раствор перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Перед вводом в хроматограф его фильтруют еще раз через фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.5).

Примечание - Фильтрование как подвижной фазы, так и растворов проб через мембранный фильтр перед применением или вводом в хроматограф продлевает срок службы колонок.

6.3 Проведение хроматографического анализа

Дозируют в ВЭЖХ-систему равные объемы градуировочных растворов и растворов проб. D-биотин идентифицируют путем сравнения времен удерживания пика на хроматограмме раствора пробы и градуировочных растворов. Идентификацию пиков можно также осуществить при помощи добавки образца сравнения к раствору пробы.

Из-за ограниченной стабильности раствора для послеколоночной дериватизации (4.2.21) ее регулярно проверяют при проведении серии измерений путем ввода градуировочного раствора. Приведенные ниже условия обеспечивают разделение и количественное определение D-биотина:

Хроматографическая колонка: 100 RP-18 endcapped, 5 мкм, 250 x 4,0 мм;

Подвижная фаза: 80 объемных частей фосфатного буферного раствора с pH 6 (4.2.15) и 20 объемных частей метанола (4.2.1);

Расход подвижной фазы: 0,4 см³/мин;

Объем инжектирования: 30 мм³;

Флуоресцентное детектирование: длина волны возбуждения 490 нм, длина волны регистрации 520 нм;

Расход реагента для послеколоночной дериватизации: 1 см³/мин.

Примечание - Этот метод может быть также использован для оценки содержания D-биоцитина.

При использовании метода внешнего стандарта определяют площади или высоты пиков и затем устанавливают градуировочную характеристику, аппроксимируемую уравнением второго порядка.

Содержание D-биотина, w, мкг/100 г пробы, вычисляют по формуле (1):

где - массовая концентрация D-биотина в растворе пробы (6.2), мкг/см³, вычисленная при помощи градуировочной характеристики;

V_e - объем раствора пробы (6.2), см³;

m_s - масса пробы, г;

100 - множитель для пересчета содержания D-биотина к 100 г пробы.

8.1 Общие положения

Данные по прецизионности хроматографического метода определения D-биотина были получены согласно ИСО 5725-2 [1] в 2000 году в ходе межлабораторных сравнительных испытаний, организованных Генеральной комиссией по унификации методов анализа, Франция [3]. Все участники межлабораторных испытаний использовали градуировочные характеристики, установленные по трем точкам.

Полученные статистические данные приведены в приложении B.

8.2 Предел повторяемости

Абсолютная разность между двумя единичными результатами испытаний, полученными одним исполнителем на идентичном исследуемом материале на одном и том же оборудовании в течение возможно короткого промежутка времени, может превышать предел повторяемости r не чаще, чем в 5% случаев. Значения для D-биотина приведены ниже:

8.3 Предел воспроизводимости

Абсолютная разность между двумя единичными результатами, полученными в двух лабораториях на идентичном исследуемом материале, может превышать предел воспроизводимости R не чаще, чем в 5% случаев. Значения приведены ниже:

Протокол испытаний должен содержать, по меньшей мере, следующие сведения:

a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;

b) ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;

c) результаты испытаний с указанием единиц измерений, в которых результат испытаний выражен;

d) дату и способ отбора проб (если он известен);

e) дату поступления пробы;

f) дату проведения испытаний;

g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытаний;

h) любые применявшиеся операции, не оговоренные в методе или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат испытаний.

Обозначения:

X - время, мин

Y - интенсивность флуоресценции

1 - D-биотин

2 - D-биоцитин

Условия анализа:

Хроматографическая колонка: 100 RP-18 endcapped, 5 мкм, 250 мм·4,0 мм

Подвижная фаза: смесь восьми объемных частей фосфатного буферного раствора с pH 6 (4.2.15) и двух объемных частей метанола (4.2.1)

Расход подвижной фазы: 0,4 см³/мин

Объем инжектирования: 30 мм³

Флуоресцентное детектирование: возбуждение при 490 нм, регистрация при 520 нм

Расход реагента для послеколоночной дериватизации: 1,0 см³/мин

Обозначения:

X - время, мин

Y - интенсивность флуоресценции

1 - D-биотин

Условия анализа:

Хроматографическая колонка: 100 RP-18 endcapped, 5 мкм, 250 мм·4,0 мм

Подвижная фаза: смесь восьми объемных частей фосфатного буферного раствора с pH 6 (4.2.15) и двух объемных частей метанола (4.2.1)

Расход подвижной фазы: 0,4 см³/мин

Объем инжектирования: 30 мм³

Флуоресцентное детектирование: возбуждение при 490 нм, регистрация при 520 нм

Расход реагента для послеколоночной дериватизации: 1,0 см³/мин

Значения, приведенные в таблице B.1, были получены при межлабораторных сравнительных испытаниях, организованных в 2000 году Генеральной комиссией по унификации методов анализа, Франция [3], [8]. Эти испытания были проведены в соответствии со стандартом ИСО 5725-2 [1]. Все участники межлабораторных испытаний использовали градуировочные характеристики, установленные по трем точкам.

[1] ISO 5725-2, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method

[2] Lahely, S., Ndaw, S., Arella, F., Hasselmann, C: Determination of biotin in foods by high-performance liquid chromatography with post-column derivatization and fluorimetric detection, Food chem., 65, 253 - 258 (1999)

[3] Arella, F., Deborde, J.L, Bourguignon, J.B., Bergaentlze, M., Ndaw, S., Hasselmann, C: Liquid chromatographic determination of biotin in foods. A collaborative study, Ann. Fals. Exp. Chim., 93. 951, 193 - 200 (2000)

[4] Hentz. N.G., Bachas, L.G.: Class-selective detection systems for liquid chromatography based on the streptavidin-biotin interaction, Anal. Chem., 67, 1014 - 1018 (1995)

[5] Przyjazny, A., Hentz, N.G,. Bachas, L.G.: Sensitive and selective liquid chromatographic post-column reaction detection system for biotin and biocytin using an homogeneous fluorophore-linked assay, J. chromatogr., 654, 79 - 86 (1993)

[6] European Pharmacopoeia 5.0, 01/2005:1073, Seite 110

[7] Selavska, C.M., Jino. K.S., Krull, I.S.: Construction and comparison of open tubular reactors for post-column reaction detection in liquid chromatography. Anal. Chem., 59, 2221 - 2224 (1987)

[8] Horwitz, W.: Evaluation of Analytical Methods used for Regulation of Foods and Drugs, Anal. Chem. 1982, 54 (1), 67A - 76A