"ГОСТ ISO 8607-2015. Межгосударственный стандарт. Средства воспроизводства. Сперма племенных быков замороженная. Подсчет живых аэробных микроорганизмов"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 05.06.2015 N 558-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.К. Эрнста" (ВИЖ им. Л.К. Эрнста) на основе собственного аутентичного перевода на русский язык англоязычной версии международного стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 29 мая 2015 г. N 77-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 5 июня 2015 г. N 558-ст введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2016 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 8607:2003 Artificial insemination of animals. Frozen semen of breeding bulls. Enumeration of living aerobic microorganisms (Оплодотворение искусственное животных. Замороженная сперма племенных быков. Подсчет живых аэробных микроорганизмов), включая его изменение Amd.1:2011.

Международный стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации ISO/ТС 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.

Перевод с английского языка (en).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.

Степень соответствия - идентичная (IDT).

Изменение к международному стандарту, принятое после его официальной публикации, внесено в текст настоящего стандарта и выделено двойной вертикальной линией на полях справа от соответствующего текста.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта в связи с особенностями построения межгосударственной системы стандартизации

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Количественный микробиологический контроль гигиены отбора и обработки спермы быков имеет большое значение в обеспечении эффективности искусственного осеменения и выполнении требований биобезопасности [1]. По этой же причине очень важно исследование бактериальной загрязненности и возможного присутствия факультативных патогенных микроорганизмов в замороженной сперме быков.

Существует необходимость в разработке международного метода, подходящего для подсчета микроорганизмов в замороженной сперме, который указывал бы на гигиенический статус в период отбора проб, обработки и хранения. Метод подсчета колоний, указанный в настоящем стандарте, устанавливает правила подсчета сапрофитных микроорганизмов, которые изначально присутствуют или поступили в сперму быков из окружающей среды. С помощью этого метода обнаруживают только общее количество бактерий, главным образом аэрофильные и мезофильные сапрофиты, а также некоторые факультативно патогенные микроорганизмы, не очень чувствительные к условиям окружающей среды.

Поскольку образцы замороженной спермы крупного рогатого скота дополнительно содержат антибиотики, определение микробиологической загрязненности данного типа образцов несколько отличается от общепринятых микробиологических методов. При исследовании образцов замороженной спермы при низком разведении, число колоний может быть ниже, чем ожидалось и не отвечать обычным пропорциям. Поэтому для компенсации эффекта действия антибиотиков необходимо использовать относительно высокое десятикратное разведение. В результате использования высокого разведения в каждой чашке Петри получают 15 или меньшее количество колоний и результат подсчета этих колоний должен быть принят как окончательный. В этом состоит отличие от обычного микробиологического исследования пищевых продуктов, при котором разведение образцов может быть выбрано таким образом, что число колоний в чашке Петри для более точного исследования может быть 15 и более.

Микробиальные клетки часто образуют в образце сгустки или группы. Встряхивание проб и разведение позволяет равномерно распределить сгустки бактерий, но не разбивает их полностью до отдельных клеток. В последующем каждая колония, появляющаяся на среде, может вырасти как от сгустка, так и от одной клетки, это позволяет получить более точный результат по числу колониеобразующих единиц, по сравнению с результатом по числу микроорганизмов [2].

Настоящий стандарт устанавливает значение допустимого предела не для всех КОЕ-бактерий, которые могут быть затребованы покупателями в торговле. Это должно быть указано в коммерческих контрактах.

Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета живых аэробных микроорганизмов в замороженной сперме племенных быков. Подсчитывают число колоний, выросших на питательной среде после аэробной инкубации при температуре 37 °C. Микробиологическое загрязнение выражают как число колониеобразующих единиц микроорганизмов на кубический сантиметр испытуемой пробы.

В настоящем стандарте применяют следующие ссылочные документы. Для датированных ссылок применяют только указанное издание. Для недатированных ссылок применяют последнее издание приведенного документа (включая все изменения).

ISO 6887-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений)

ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям)

В настоящем стандарте применены термины по ISO 6887-1, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 сперма (semen): Продукт генитальных органов самцов, предназначенный для оплодотворения самок.

3.2 эякулят (ejculate): Количество спермы, полученной в результате одной садки самца.

3.3 доза (dose): Количество спермы, индивидуально расфасованной для одного осеменения.

3.4 серия доз (series doses): Группа доз спермы, полученных от одного быка и одного или более эякулятов в один день и подвергнутых одной и той же обработке.

3.5 живые аэробные микроорганизмы (living aerobic microorganisms): Бактерии, дрожжи, плесени, которые растут аэробно при температуре 37 °C в условиях, указанных в настоящем стандарте.

3.6 колониеобразующая единица, КОЕ (colony-forming unit, CFU): Единичные микробные клетки или колонии, или группы клеток, формирующие одну колонию на питательной среде в условиях, указанных в настоящем стандарте.

Две чашки Петри заполняют определенной питательной средой. Среду инокулируют на значительной глубине определенным количеством испытуемой пробы с последующей аэробной инкубацией при температуре 37 °C.

Число КОЕ микроорганизмов на кубический сантиметр испытуемой пробы подсчитывают по числу полученных колоний.

Общее руководство - по ISO 7218.

Химические вещества должны отвечать требованиям для аналитических и микробиологических исследований.

Используемая вода должна быть дистиллированной или эквивалентной по качеству (см. ISO 7218).

Разбавителем является солевой раствор пептона, как указано в ISO 6887-1. Его состав, приготовление и использование приведены только для удобства пользователя настоящего стандарта.

Чтобы добиться воспроизводимости результатов, для приготовления разбавителя используют обезвоженные основные компоненты или обезвоженный готовый разбавитель. Следует строго соблюдать инструкции производителя.

Растворяют компоненты в воде, при необходимости подогревают.

При необходимости, регулируют pH так, чтобы после стерилизации он был 7,0 +/- 0,2 при температуре 25 °C.

Для приготовления исходной суспензии разбавитель разливают в испытательные пробирки или колбы (6.3) определенной вместимости.

Для приготовления десятикратного разведения разбавитель разливают в пробирки или колбы (6.3) таким образом, чтобы после стерилизации каждая пробирка или колба содержала 9,0 см³. Неопределенность измерений данного конечного объема после стерилизации не должна превышать +/- 2%.

--------------------------------

<1> Согласно прочности геля агара.

Растворяют компоненты или дегидратированную готовую среду в воде, при необходимости подогревают.

При необходимости, устанавливают значение pH так, чтобы после стерилизации оно было равно 7,0 +/- 0,2 при температуре 25 °C.

Распределяют среду по пробиркам или колбам (6.3) в количествах, необходимых для заполнения 1/2 их объема.

Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

Если среду будут использовать сразу, то ее охлаждают до температуры 44 °C - 47 °C на водяной бане (6.8), а затем добавляют 10% (по объему) инокулированной и стерилизованной <1> бычьей или овечьей сыворотки.

--------------------------------

<1> Путем ультрафильтрации (фильтр 0,2 нм).

Примечание - Имеющееся оборудование должно быть приемлемой альтернативой используемой стеклянной посуде и иметь подходящие характеристики.

Используют обычное для микробиологических лабораторий оборудование, в том числе:

6.1 Стерилизатор (для сухой стерилизации) или автоклав (для стерилизации паром), см. ISO 7218.

6.2 Инкубатор, способный поддерживать температуру (37 +/- 1) °C.

6.3 Пробирки диаметром 16 мм и длиной 160 см или флаконы вместимостью не более 500 см³.

6.4 Чашки Петри из стекла или пластика диаметром 90 - 100 мм.

6.5 Пипетки градуированные вместимостью 1 см³ с ценой деления 0,1 см³.

Нельзя использовать выдувные пипетки.

Вместе с тем, можно использовать микропипетки вместимостью (1,0 +/- 0,01) см³.

6.6 pH-метр электрический с точностью измерения 0,1 ед. pH при температуре 25 °C.

6.7 Водяная баня, способная поддерживать температуру (37 +/- 1) °C.

6.8 Водяная баня, способная поддерживать температуру (45 +/- 1) °C.

6.9 Водяная баня, позволяющая поддерживать температуру кипения.

6.10 Оборудование для подсчета колоний, состоящее из освещенной базы с темным фоном с увеличительными линзами, подходящее для использования при увеличении x 1,5, оснащенное механическим или электронным цифровым счетчиком.

Отбирают из серии доз необходимое количество доз спермы глубокой заморозки в упаковке любого типа (гранулы или соломинки по 0,25 см³ или 0,5 см³) так, чтобы объем выборки составлял 1,0 см³.

Отобранные испытуемые пробы хранят в жидком азоте.

Для исследования испытуемые пробы переносят из большого сосуда с жидким азотом в небольшой лабораторный контейнер с жидким азотом.

Испытуемую пробу размораживают, поместив ее в водяную баню (6.7) с температурой 37 °C на 3 мин.

Размороженная испытуемая проба может храниться в холодильнике при температуре 4 °C, но не более 1 ч.

Готовят в стерильном боксе исходную суспензию в соответствии с ISO 6887-1.

Число дальнейших разведений выполняют в зависимости от содержания антибиотиков в исходной суспензии как указано ниже.

a) Если исходная суспензия содержит обычное количество антибиотиков [т.е. 10³ международных единиц (МЕ) <1> пенициллина и 1 мг стрептомицина или другого антибиотика широкого спектра действия в процентах], то используют конечное разбавление 10^-5.

--------------------------------

<1> МЕ - точно установленное значение международного стандартного образца. Для группы пенициллина имеется несколько стандартных образцов. Например, 1 мг калиевой соли бензил пенициллина соответствует 1670 МЕ.

b) Если количество антибиотиков отличается от указанного в пункте a), то используют такое конечное разбавление, при котором в суспензии содержится пенициллина не более 0,1 МЕ/см³, а антибиотиков широкого спектра действия - не более 0,1 мкг/см³.

Примечание - Высокая концентрация антибиотиков может ингибировать рост микроорганизмов и можно получить искаженные результаты.

9.2.1 Берут две стерильные чашки Петри (6.4). В каждую чашку стерильной пипеткой (6.5) вносят по 1 см³ конечного разведения исходной суспензии (см. 9.1).

В две другие стерильные чашки Петри новой стерильной пипеткой вносят в каждую чашку по 1 см³ суспензии с разведением на порядок меньше, чем последнее.

9.2.2 В каждую чашку Петри заливают около 15 см³ агаровой среды (5.2) с температурой (45 +/- 1) °C. Промежуток от окончания подготовки исходной суспензии до разлива среды по чашкам не должен превышать 15 мин.

Тщательно перемешивают инокулят со средой и дают смеси затвердеть, оставив чашки на горизонтальной поверхности в прохладном месте.

9.2.3 Подготовленные чашки переворачивают и ставят в инкубатор (6.2) с температурой 37 °C на (72 +/- 3) ч.

Инокулируют и инкубируют две контрольные чашки параллельно с операциями, определенными 9.2, используя 1 см³ разбавителя (5.1) конечного разбавления (см. 9.1).

Во всех случаях осуществляют первоначальный осмотр контрольных чашек (9.3) для определения присутствия колоний в пределах среды. Если колонии присутствуют, то контрольные чашки и чашки, содержащие испытуемые пробы, бракуют, и процедуру повторяют.

Если колонии отсутствуют, то проводят оценку чашек, содержащих испытуемые пробы по 9.4.2.

Подсчет колоний в каждой из чашек, содержащей испытуемую пробу, проводят с помощью оборудования (6.10) или визуально.

Считают только хорошо различимые колонии, которые выросли в среде и на поверхности среды. Чашки, в которых более половины поверхности зарастает, не учитывают.

Примечание - Этот раздел основан на ISO 4833:1991 (см. [3]).

Если количество колоний на чашках с конечным разбавлением больше, чем на чашках с предварительным разбавлением, то берут в расчет количество колоний, полученных на чашках с конечным разбавлением.

Отбирают чашки от двух последующих разбавлений, содержащие не более 300 колоний. Важно, чтобы одна из этих чашек содержала, по меньшей мере, 15 колоний.

Вычисляют N количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на кубический сантиметр испытуемой пробы, используя следующее уравнение

где - сумма колоний, посчитанных на всех чашках;

n₁ - число чашек, отобранных при первом из двух последующих разбавлений;

n₂ - число чашек, отобранных при втором разбавлении;

d - коэффициент разбавления, соответствующий первому разбавлению.

Полученный результат округляют до двух значащих цифр.

Количество колониеобразующих единиц на сантиметр кубический испытуемой пробы выражают как число между 1,0 и 9,9, умноженное на 10^x, где x - число, соответствующее показателю степени.

ПРИМЕР

Подсчет колоний дал следующие результаты:

- при первом разведении (10^-4): 168 и 215 колоний, соответственно, в двух чашках;

- при втором разведении (10^-5): 14 и 25 колоний, соответственно, в двух чашках:

Округление результата, указанного выше, дает 1900000 или 1,9 x 10⁶ колониеобразующих единиц на сантиметр кубический испытуемой пробы.

Если обе чашки первого разбавления содержат менее 15 колоний, количество колониеобразующих единиц рассчитывают, как среднеарифметическое значение для двух этих чашек, используя следующее уравнение:

где N_E - предполагаемое количество колониеобразующих единиц на сантиметр кубический;

m - среднеарифметическое число колоний, рассчитанное для двух чашек;

d - коэффициент разведения для первого из двух последовательных разведений.

Если для окончательного разбавления не наблюдается рост колоний, то результат выражают, как "менее 1 x d^-1 КОЕ/см³ испытуемой пробы", где d - коэффициент для конечного разбавления.

10.2.1 Чашки, содержащие 15 - 300 колоний (см. 10.1.2)

Статистически достоверные (в 95% случаях) доверительные пределы этого метода варьируются от +/- 12% до +/- 37% (см. [4]). На практике, особенно среди результатов, полученных различными микробиологами, можно найти еще отклонения.

10.2.2 Чашки, содержащие 15 или менее колоний (см. 10.1.3)

Доверительные пределы для оценки небольшого числа колониеобразующих единиц приведены в таблице A.1.

В протоколе испытаний указывают:

- всю необходимую информацию для точной идентификации пробы;

- метод отбора проб, если известно;

- используемый метод испытаний со ссылкой на настоящий стандарт;

- все операции, не установленные настоящим стандартом или принимаемые во внимание как факт, вместе с подробной информацией о любых случаях, которые могли повлиять на результат испытаний;

- полученный результат испытаний, даже если было выявлено небольшое количество колоний, входящий в доверительные пределы на уровне 95%.