"ГОСТ 28424-2014. Межгосударственный стандарт. Средства воспроизводства. Эмбрионы крупного рогатого скота. Технические условия"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 19.08.2014 N 890-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. N 45-2014)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2014 г. N 890-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 28424-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

5 ВЗАМЕН ГОСТ 28424-90

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Настоящий стандарт распространяется на свежеполученные и замороженные эмбрионы крупного рогатого скота (далее - эмбрионы), предназначенные для пересадки животным-реципиентам.

Требования к качеству и безопасности эмбрионов изложены в 4.1 - 4.4, к маркировке - в 4.5.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.2.003-91 Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности

ГОСТ 12.3.002-75 Система стандартов безопасности труда. Процессы производственные. Общие требования безопасности

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 10164-75 Реактивы. Этиленгликоль. Технические условия

ГОСТ 19710-83 Этиленгликоль. Технические условия

ГОСТ 26030-83 Сперма быков замороженная. Технические условия

ГОСТ 27775-88 Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. Термины и определения

ГОСТ 28085-89 Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом, следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 27775.

4.1.1 Эмбрионы должны соответствовать требованиям настоящего стандарта и [1], быть получены в центрах и пунктах трансплантации эмбрионов в соответствии с требованиями [2], правилами по трансплантации эмбрионов и ветеринарно-санитарными требованиями, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

4.1.2 Все манипуляции по получению, обработке, использованию и хранению эмбрионов проводят в соответствии с 4.1.1 с использованием стерильных инструментов, материалов и сред, безопасных для эмбрионов.

4.2.1 Эмбрионы получают от клинически здоровых самок крупного рогатого скота, осемененных спермой быков по ГОСТ 26030.

4.2.2 Доноров яйцеклеток (в последующем - эмбрионов) отбирают из поголовья, на которое не наложены ветеринарные ограничения по причине наличия болезни или возбудителя болезни, которые не входят в категорию 1 в соответствии с приложением А.

4.2.3 Доноры яйцеклеток (в последующем - эмбрионов) должны подбираться с учетом комплекса селекционно-генетических признаков, иметь продуктивность (молочную, мясную, мясомолочную), превышающую стандарт породы.

4.2.4 Самок крупного рогатого скота перед отбором в качестве доноров яйцеклеток (в последующем - эмбрионов) подвергают клиническому осмотру. На каждое животное оформляют документ с указанием клинического состояния здоровья, благополучия по инфекционным заболеваниям с указанием даты проведения последних диагностических исследований и обработок.

4.2.5 Быки-производители, сперму которых используют для осеменения самок-доноров, должны находиться на племенных предприятиях, отвечающих требованиям по ветеринарному благополучию и здоровью животных, а также по соблюдению санитарно-гигиенических условий отбора, замораживания, хранения и отправки спермы, действующих на территории государства, принявшего стандарт.

4.2.6 Племенные животные должны иметь подтверждение достоверности происхождения и отсутствия генетических аномалий.

4.3 Требования к процедурам предотвращения распространения инфекционных заболеваний через эмбрионы, отобранные in vivo

4.3.1 По отношению к болезням, не входящим в категорию 1 (см. приложение А), учитывают ветеринарно-санитарное положение страны или зоны, экспортирующей эмбрионы, ветеринарно-санитарное состояние поголовья и доноров эмбрионов, а также патогенность возбудителей, от которых стремится защититься страна, импортирующая эмбрионы.

4.3.2 Для предотвращения заражения инфекционными заболеваниями, которые не входят в категорию 1 (см. приложение А), проводят надзор за животными - донорами яйцеклеток (в последующем - эмбрионов) и поголовьем их происхождения в течение средней длительности инкубационного периода болезней, а также лабораторные исследования жидкостей после отбора и отмывки эмбрионов или других биологических материалов (например, крови) на предмет определенных патогенных возбудителей болезней.

4.4.1 Полученные на седьмой день после искусственного осеменения самок-доноров эмбрионы должны быть на стадии развития ранней морулы (Мо I), поздней морулы (Мо II), ранней бластоцисты (Бл I), экспандированной бластоцисты (Бл II), полностью экспандированной бластоцисты (Бл III) с показателями в соответствии с таблицей 1.

4.4.2 В зависимости от оценки морфологических показателей, указанных в таблице 2, полученным эмбрионам присваивают код качества от 1 до 4 в соответствии с приложением Б.

4.4.3 В коммерческих целях могут быть использованы только эмбрионы, которым присвоен код качества 1.

4.4.4 Свежеполученные эмбрионы не должны быть контаминированы патогенными и условно патогенными микроорганизмами, грибами, вирусами и другими микроорганизмами.

4.5.1 Каждую партию свежеполученных эмбрионов после определения морфологических показателей помещают и укупоривают в пайеты со средой для хранения эмбрионов, представляющую собой стерильный фосфатно-буферный раствор, содержащий альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота (BSA) концентрацией 4 г/дм³ или фетальную сыворотку крови крупного рогатого скота (FCS) концентрацией 20 см³/дм³ и антимикробный препарат (гентамицин концентрацией 0,05 г/дм³ или полиген концентрацией 0,3 г/дм³).

4.5.2 Эмбрионы, предназначенные для замораживания, после промывки и экспозиции в криопротекторе (глицерин концентрацией 1,0 моль/дм³ или 1,4 моль/дм³ по ГОСТ 6259 или этиленгликоль концентрацией 1,5 моль/дм³ по ГОСТ 10164 или ГОСТ 19710, помещают в пайеты, укупоривают и замораживают в предусмотренных для этих целей программных замораживателях в соответствии с правилами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

4.5.3 Пайеты с замороженными эмбрионами помещают в контейнеры (гоблеты, канистры, тубы), которые переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом по ГОСТ 9293.

4.5.4 Упаковочные и укупорочные материалы должны соответствовать требованиям документов, в соответствии с которыми они изготовлены, и обеспечивать сохранность качества и безопасность эмбрионов при перевозках, хранении и реализации.

Каждую пайету маркируют, нанося маркером номер партии и дату получения эмбрионов.

5.1 Производственный процесс и оборудование должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.2.003 и ГОСТ 12.3.002.

5.2 Требования безопасности, производственной санитарии и санитарно-противоэпидемического режима должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.008 и требованиям, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

5.3 Утилизацию эмбрионов проводят кипячением в течение 20 мин.

6.1 Свежеполученные и замороженные эмбрионы принимают партиями.

Под партией понимают любое количество эмбрионов, полученное от одного донора эмбрионов за один технологический цикл и оформленное одним документом, удостоверяющим качество и безопасность эмбрионов.

6.2 Каждая партия свежеполученных и замороженных эмбрионов должна быть проверена и принята соответствующим специалистом предприятия-изготовителя.

6.3 Экспортируемые эмбрионы должны сопровождаться документом, подтверждающим благополучие животных, от которых они получены, а также соответствие условий получения и замораживания эмбрионов международным требованиям [3] (см. приложение В).

6.4 Каждая партия замороженных эмбрионов, предназначенных для пересадки, должна быть принята специалистом по пересадке эмбрионов предприятия-изготовителя или предприятия-получателя.

Качество эмбрионов по морфологическим показателям определяют у всех свежеполученных эмбрионов. Качество замороженных эмбрионов после оттаивания определяют в случае использования многоступенчатого насыщения эмбриона криопротектором или, при необходимости, в случае одноступенчатого насыщения (при использовании этиленгликоля).

7.1.1.1 Термостат, обеспечивающий поддержание температуры (37 +/- 1) °C.

7.1.1.2 Микроскоп инвертированный.

7.1.1.3 Лупа бинокулярная.

7.1.1.4 Столик нагревательный.

7.1.1.5 Сифон или фильтр для отбора промывной среды.

7.1.1.6 Чашки Петри диаметром 90 и 35 мм для поиска и сбора эмбрионов.

7.1.1.7 Флаконы вместимостью 450 - 500 см³.

7.1.1.8 Пипетки для отлова эмбрионов.

7.1.1.9 Среда фосфатно-буферная, содержащая альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота (BSA) концентрацией 4 г/дм³ или фетальную сыворотку крови крупного рогатого скота (FCS) концентрацией 20 см³/дм³ и антимикробный препарат (гентамицин концентрацией 0,05 г/дм³ или полиген концентрацией 0,3 г/дм³).

7.1.1.10 Трипсин, раствор массовой долей 0,25%.

Допускается использование другого оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и сред по качеству не ниже вышеуказанных.

Раствор, полученный с соблюдением правил асептики в отдельный флакон после вымывания эмбрионов из каждого рога матки самки-донора, выдерживают при температуре от 18 °C до 25 °C в течение 20 мин или в термостате при температуре 37 °C в течение 20 мин для осаждения эмбрионов. Верхнюю часть раствора удаляют с помощью сифона, оставляя 80 - 100 см³ раствора. Оставшийся раствор переносят в две-три чашки Петри диаметром 90 мм.

При использовании промывочной системы с фильтром отфильтрованный раствор просматривают непосредственно в прилагаемой к системе емкости для сбора эмбрионов.

Эмбрионы просматривают под бинокулярной лупой при увеличении 20^X - 28^X.

Эмбрионы с оценкой "непригодные" удаляют.

Эмбрионы, пригодные к пересадке и замораживанию и отобранные в чашки Петри диаметром 35 мм со средой по 7.1.1.9, не менее десяти раз переносят для промывки в чистую фосфатно-буферную среду, используя при каждом переносе эмбрионов новую пипетку. Допускается групповая промывка эмбрионов, взятых у одной самки-донора, но их число не должно превышать десяти в каждой промывке.

В случае, когда требуется проведение операций по инактивации или удалению вирусов (например, герпесвирус-1 крупного рогатого скота, вирус болезни Ауески), проводят дополнительную промывку 0,25%-ным раствором трипсина.

После промывки зону пеллюцида каждого эмбриона исследуют по всей поверхности при увеличении 50^X - 100^X для признания ее неповрежденной и не имеющей никаких посторонних включений.

Оценку качества эмбрионов по морфологическим показателям проводят на соответствие требованиям, указанным в 4.4.

Свежеполученные эмбрионы с оценкой "отличные и хорошие" подлежат прямой пересадке животным-реципиентам или замораживанию.

Свежеполученные эмбрионы с оценкой "удовлетворительные", "условно пригодные" пересаживают животным-реципиентам.

Замороженные эмбрионы, получившие после оттаивания оценку "отличные и хорошие", "удовлетворительные" и "условно пригодные", пересаживают животным-реципиентам.

Эмбрионы с оценкой "непригодные" выбраковывают.

7.2.1 Санитарное состояние определяют у свежеполученных эмбрионов, подлежащих пересадке или замораживанию.

7.2.2 Санитарное состояние свежеполученных эмбрионов, а также эмбрионов, подлежащих замораживанию, устанавливают на основании выборочного микробиологического исследования предпоследнего промывочного раствора соответствующей среды, не менее чем от шести партий эмбрионов в один квартал.

7.2.3 Для определения санитарного состояния эмбрионов отбирают по 2 см³ соответствующей среды - 1 см³ среды используют для микробиологических исследований, 1 см³ среды помещают в пробирку, плотно закрывают, маркируют и хранят в замороженном виде до использования всех эмбрионов данной партии.

7.2.5 Контроль стерильности сред проводят по ГОСТ 28085.

8.1 Эмбрионы транспортируют в сопровождении специалиста с соблюдением правил асептики. Время транспортирования свежеполученных эмбрионов не должно превышать пять часов.

8.2 Эмбрионы транспортируют всеми видами транспорта в соответствии с правилами перевозок скоропортящихся грузов и багажа, действующими на данном виде транспорта.

8.3 Оттаянные эмбрионы пересаживают реципиентам в течение 10 - 15 мин.

8.4 Эмбрионы хранят в стерильных укупоренных пайетах с соблюдением требований [2] в специально предназначенном для этого хранилище.

А.1 В соответствии с [4] следующие болезни и возбудители болезней классифицированы в четыре категории. Данная классификация относится исключительно к эмбрионам, отобранным in vivo.

В категорию 1 включены болезни и возбудители болезней, в отношении которых имеются надежные доказательства, позволяющие утверждать, что риск передачи незначителен, при условии, что обращение с эмбрионами проводилось надлежащим образом.

В категорию 1 включены следующие болезни и возбудители болезней:

- Brucella abortus (поражает крупный рогатый скот);

- губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (поражает крупный рогатый скот);

- ящур (поражает крупный рогатый скот);

- катаральная лихорадка овец (поражает крупный рогатый скот);

- энзоотический лейкоз крупного рогатого скота;

- болезнь Ауески: требует обработки трипсином (поражает крупный рогатый скот, оленей, овец, свиней, лошадей и др.);

- инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота: требует обработки трипсином.

В категорию 2 включены болезни и возбудители болезней, в отношении которых имеются доказательства, достаточные, чтобы утверждать, что риск передачи незначителен, при условии, что обращение с эмбрионами проводилось надлежащим образом, но в отношении которых имеющиеся данные должны быть перепроверены в ходе новых трансплантаций.

В категорию 2 включены следующие болезни и возбудители болезней:

- катаральная лихорадка овец (к заболеванию восприимчив крупный рогатый скот).

В категорию 3 включены болезни и возбудители болезней, в отношении которых имеются определенные доказательства, позволяющие утверждать, что риск передачи незначителен, при условии, что обращение с эмбрионами проводилось надлежащим образом, но в отношении которых эти определенные доказательства должны быть подкреплены дополнительными экспериментальными результатами в ходе новых трансплантаций in vivo или in vitro.

В категорию 3 включены следующие болезни и возбудители болезней:

- Campylobacter fetus;

- губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота;

- Haemophilus somnus (поражает крупный рогатый скот);

- Micobacterium paratuberculosis (поражает крупный рогатый скот);

- Neospora caninum (поражает крупный рогатый скот);

- чума крупного рогатого скота (поражает крупный рогатый скот);

- репродуктивно-респираторный синдром свиней [болезнь часто протекает в ассоциации с другими инфекциями (болезнь Ауески, парвовирусная и энтеровирусная инфекция, энцефаломиокардит, грипп, лептоспироз и др.)];

- вирус иммунодефицита крупного рогатого скота;

- вирус вирусной диареи крупного рогатого скота.

В категорию 4 включены болезни и возбудители болезней, в отношении которых проведены или проводятся исследования, показавшие:

- что пока никаких заключений о риске передачи сделать нельзя или

- что риск передачи путем пересадки эмбрионов не может быть незначительным, даже если обращение с эмбрионами проводилось надлежащим образом.

В категорию 4 включены следующие болезни и возбудители болезней:

- анаплазмоз крупного рогатого скота;

- Chlamydia psittaci (поражает крупный рогатый скот, овец);

- энтеровирус (поражает крупный рогатый скот, свиней);

- заразный узелковый дерматит;

- Escherichia coli O9:K99 (поражает крупный рогатый скот);

- катаральная лихорадка овец [коз (у крупного рогатого скота возможны аборты, рождение уродливого потомства)];

- герпесвирус-4 крупного рогатого скота;

- Leptospira borgpetersenii серовар hardjobovis (крупный рогатый скот);

- болезнь Бордера (обладает высокой патогенностью для плодов крупного рогатого скота);

- Mycobacterium bovis (поражает крупный рогатый скот);

- везикулярный стоматит (поражает крупный рогатый скот, свиней);

- Trichomonas foetus (поражает крупный рогатый скот);

- Ureaplasma/Mycoplasma spp. (поражает крупный рогатый скот, коз);

- вирус Акабане (поражает крупный рогатый скот);

- вирус парагриппа-3 (поражает крупный рогатый скот).

a - Если подобные эмбрионы извлечены на седьмой день или позже, но стадия их развития не соответствует ожидаемой, то показатель качества снижается на один балл.

b - Крупные клетки, выделенные из клеточной массы ранее 16-клеточной стадии, составляют не более 15% всего клеточного материала до стадии поздней морулы.

c - Отдельные большие бластомеры указывают на то, что компактизация не завершена и он является более ранним.

d - Выделенные или маленькие бластомеры составляют менее чем 15% от всей клеточной массы, эмбрион соответствует стадии развития.

e - Сперматозоиды на зоне пеллюцида.

f - Выделенные клетки или дебрис (посторонние включения) представляют трудности для определения наличия, качества и жизнеспособности эмбриона.

g - Код качества 3 относится к эмбрионам, у которых менее 50% клеток в пределах зоны пеллюцида.

h - Эмбрионы содержат качественные клетки, но их очень мало. Если эмбриональных клеток менее 25% всего клеточного материала, им присваивают код качества 4 (непригодные).

i - Неправильная форма и изменения в развитии полости бластоцисты.

j - Сжатие полости бластоцисты считается нормальным физиологическим процессом, что не снижает качественную оценку.

k - Выделение клеток на стадиях экспандированной, полностью экспандированной и вылупившейся бластоцисты часто сжимают зону пеллюцида в случае физиологического коллапса или при введении криопротектора.

l - Эмбрион имеет плоскую или вогнутую зону пеллюцида, что может послужить причиной его фиксации в чашке Петри или пайете. Этот дефект не позволяет дать им высшую оценку, но не является причиной выбраковки в рамках определенных коммерческих соглашений, если нет других причин для снижения оценки.

m - Посторонние клеточные включения на поверхности зоны пеллюцида указывают, что эмбрион не был отмыт надлежащим образом.

n - Эмбрион имеет трещину зоны пеллюцида. Эмбрионы, не имеющие интактную зону пеллюцида в интернациональных коммерческих программах, не утилизируют.

[1] Единые ветеринарные (ветеринарно-санитарные) требования, предъявляемые к товарам, подлежащим ветеринарному контролю (надзору), утвержденные Решением Комиссии Таможенного союза от 18 июня 2010 г. N 317 <*>

[2] Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Утверждена Госагропромом СССР 05.06.87

[3] Stringfellow D.A, Seidel S.M: Manual of the International Embryo Transfer Society: A procedural guide and general information for the use of embryo transfer technology emphasizing sanitary procedures. 3rd edition. Savoy, IL: International Embryo Transfer Society; 1998, 172 p.

[4] Кодекс здоровья наземных животных МЭБ, 2012 г., том 1

--------------------------------

<*> Действуют на территории Таможенного союза.