"ГОСТ 33036-2014. Межгосударственный стандарт. Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Определение острой токсичности для дождевых червей"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 20.11.2014 N 1695-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

1. Подготовлен Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ" (ФГУП "ВНИЦСМВ") на основе собственного аутентичного перевода на русский язык руководящего документа, указанного в пункте 5.

2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт).

3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол от 20 октября 2014 г. N 71-П).

За принятие проголосовали:

4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 20 ноября 2014 г. N 1695-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33036-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 августа 2015 г.

5. Настоящий стандарт идентичен руководящему документу OECD, Test No 207:1984 Earthworm, Acute Toxicity Tests (Определение острой токсичности для дождевых червей).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного руководящего документа для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (подраздел 3.6).

Перевод с английского языка (en).

Степень соответствия - идентичная (IDT).

6. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт устанавливает метод определения острой токсичности химических веществ для дождевых червей.

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

2.1. медианное значение летальной концентрации (LC₅₀): Концентрация химического вещества в пищевом рационе, которая приводит к 50%-ной гибели тестируемых животных.

Примечание. Для контактного теста концентрацию вещества выражают в миллиграммах на квадратный сантиметр, для теста с искусственной почвой - в миллиграммах на килограмм (сухой массы почвы).

Скриннинговый тест (контактный тест с фильтровальной бумагой) включает воздействие на червей тестируемого вещества, нанесенного на влажную фильтровальную бумагу, и позволяет идентифицировать вещества, потенциально токсичные для дождевых червей.

Тест с искусственной почвой включает экспозицию дождевых червей в специально приготовленной искусственной почве, содержащей тестируемое вещество в определенном диапазоне концентраций. Гибель дождевых червей оценивается на 7-й и 14-й день после применения тестируемого вещества.

В серии тестируемых концентраций вещества одна концентрация не должна вызывать гибели, а еще одна - должна приводить к гибели всех червей.

Должна быть известна следующая информация о тестируемом веществе:

- растворимость в воде;

- давление паров;

- структурная формула;

- чистота;

- стабильность в воде, почве и на свету;

- коэффициент распределения н-октанол/вода;

- результаты теста на способность к биоразложению.

Вещество сравнения в тесте для определения LC₅₀ должно выбираться по собственному усмотрению и гарантировать, что лабораторные условия, в которых проводят опыты, соответствуют требованиям и не подвержены существенным временным изменениям. Оптимальным веществом сравнения, удовлетворяющим этим условиям, является хлорацетамид.

Тест считается достоверным, если гибель червей в контроле не превышает 10% к концу испытания.

7.1. Оборудование и материалы

Обычное лабораторное оборудование и специальные принадлежности:

- культура дождевых червей (см. 7.2);

- фильтровальная бумага среднего качества толщиной примерно 0,2 мм и плотностью от 80 до 85 г/м²;

- искусственный почвенный субстрат, приготовленный следующим образом:

10% сфагнового сухого и тонко растертого торфа (pH 5,5 - 6,0; без видимых растительных остатков);

20% каолиновой глины (с содержанием каолина около 30%);

70% промышленного песка (предпочтителен мелкий песок с преобладанием частиц размером от 50 до 200 микрон - более 50%).

pH в искусственном субстрате регулируют в пределах 6,0 +/- 0,5 карбонатом кальция [1]. Сухие составные части тщательно смешивают в строго установленных пропорциях, каждый раз взвешивая общую массу. Влажность смеси определяют при высушивании небольшого количества образца при температуре 105 °C. Деионизированную воду добавляют к полученной смеси до влажности примерно 35% сухой массы таким образом, чтобы при сжатии субстрата в руке не выделялась вода. Для некоторых видов торфа приемлемым будет и более высокое содержание влаги.

Сосуды, используемые в тесте, должны быть стеклянными вместимостью около 1 л и должны быть покрыты стеклянными крышками или перфорированной пленкой.

Освещение лабораторной комнаты или камеры должно контролироваться в пределах от 400 до 800 люкс, температура - (20 +/- 2) °C.

7.2. Экспериментальные животные

Рекомендуемый вид дождевых червей для теста - Eisenia foetida (Michaelsen). Этот вид не совсем типичен для традиционных типов почв и обычно обитает в почвах, богатых органическим веществом. Он чувствителен к химическим веществам, имеет короткий жизненный цикл - черви выводятся из коконов за 3 - 4 недели и достигают половой зрелости за 7 - 8 недель при температуре окружающей среды 20 °C. Вид очень плодовитый, взрослый червь производит от 2 до 5 коконов в неделю, из которых выводятся другие черви. Коконы можно приобрести или разводить, разделив популяцию на части (см. Приложение А).

Eisenia foetida существует в виде двух рас червей, морфологически сходных между собой [2]. Но одна раса - E. foetida foetida имеет типичные поперечные полоски на сегментах, а другая - E. foetida andrei не имеет таковых и более красного цвета. В тесте используют E. foetida foetida, однако возможно использование и другой расы.

Для опытов берут взрослых червей в возрасте от двух месяцев и живой массой от 300 до 600 мг.

7.3. Выполнение теста

7.3.1. Тест с фильтровальной бумагой

Рекомендуются плоскодонные стеклянные колбы с плоским дном или другие стеклянные сосуды высотой 8 см и диаметром 3 см с плоским дном, стенки которых покрывают фильтровальной бумагой, нарезанной таким образом, чтобы ее края частично перекрывали друг друга.

Тестируемое вещество известной концентрации растворяют в дистиллированной воде (если растворимость вещества не менее 1000 мг/л) или в наиболее подходящем органическом растворителе (ацетоне, хлороформе, гексане). 1 мл раствора капают пипеткой в колбу и испаряют растворитель (операция может быть повторена для достижения требуемого количества осадка вещества). Контрольный сосуд должен быть аналогично обработан 1 мл дистиллированной воды или используемого органического растворителя. После высушивания 1 мл дистиллированной воды переносят в другой сосуд для смачивания бумаги, который накрывают стеклянным колпаком или полимерной пленкой с небольшим отверстием.

Предварительный тест предшествует более точному скриннинговому тесту. Он может быть следующим:

Для основного скриннингового теста необходимо использовать пять и более уровней геометрического ряда концентраций. Для каждой концентрации - 10 повторностей, помещая одного червя в сосуд. Более одного червя помещать не рекомендуется, т.к. гибель одного червя может оказать неблагоприятное воздействие на других, находящихся с ним в сосуде. Точность полученных при тестировании данных, может быть увеличена доведением количества повторностей до 20. Дождевые черви перед использованием их в тесте должны содержаться в течение 3 часов на влажной фильтровальной бумаге, чтобы удалить содержимое их кишечника. Затем их промывают и слегка подсушивают. Во время теста сосуды должны находиться в горизонтальном положении на каком-либо подносе. Температуру во время теста поддерживают в пределах (20 +/- 2) °C. Первые 48 ч сосуды держат в затемненном месте, а по прошествии 72 ч оценивают гибель червей. Червь считается погибшим, если он не реагирует на легкие механические раздражения, производимые по направлению от головы к хвосту.

7.3.2. Тест с искусственной почвой

Желателен предварительный тест, который определяет диапазон концентраций вещества и включает следующий ряд концентраций: 0,01; 0,1; 1,0; 10; 100; 1000 мг/кг (тестируемого вещества в сухой искусственной почвенной смеси). Для основного теста необходимо использовать пять концентраций геометрического ранжированного ряда.

Тест с искусственной почвой и тестируемым веществом необходимо проводить следующим образом: непосредственно перед тестированием эмульсию или дисперсию химиката в дистиллированной воде смешивают с искусственным субстратом или равномерно разбрызгивают по его поверхности. Если тестируемое вещество нерастворимо в воде, оно может быть растворено в подходящем органическом растворителе (ацетоне, гексане или хлороформе), после чего растворителю дают возможность испариться. Если вещество не растворяется, его дисперсию или эмульсию в количестве, соответствующем 750 г искусственной почвы (влажной массы), смешивают с 10 г мелкого кварцевого песка, после чего полученную смесь прибавляют к 740 г влажного искусственного субстрата. Так готовят смесь для каждого тестируемого сосуда. В качестве растворителей химических веществ могут использоваться только сильно летучие вещества. Перед тестированием растворитель должен испариться. Количество испарившейся воды из искусственной смеси должно быть адекватно восполнено.

В каждый сосуд добавляют 750 г влажной искусственной почвы и тестируемое вещество, после чего на поверхность помещают 10 промытых дождевых червей, которые адаптируются в течение 24 ч в искусственном субстрате (без тестируемого вещества). Сосуды накрывают пластиковой пленкой для предотвращения пересыхания содержимого и выдерживают 14 дней.

Рекомендуются четыре повторности для каждой тестируемой концентрации химического вещества. В каждом тесте используют четыре контрольных сосуда, причем искусственный субстрат обрабатывают растворителем, используемым для тестируемых сосудов. Продолжительность теста - 14 дней (определение гибели проводят на 7-й и 14-й дни). Температура проведения теста (20 +/- 2) °C. Необходимо контролировать червей в тестируемой смеси в течение всего теста. Гибель подопытных червей определяют, высыпая содержимое сосуда на стеклянную плоскую пластину (поднос), затем проводят выборку червей из субстрата и определяют их состояние по реакции на механические раздражения, производимые от головы к хвосту. После оценки гибели в срок 7 дней червей и смесь искусственной почвы с химикатом помещают в контейнер. Данные о червях с какими-либо патологиями (в том числе поведенческими) фиксируют и отмечают в отчете. В конце теста необходимо оценить влажность субстрата.

8.1. Обработка результатов

Данные зависимости гибели от концентрации тестируемого вещества отражают в виде графика, по которому определяют медиану летальной концентрации (LC₅₀) и ее доверительные интервалы [3]. Приемлемы также другие методы пробит-анализа. Если при двух последовательных концентрациях тестируемого вещества гибель составляет 0% и 100% гибели, эти два значения концентрации являются достаточными, чтобы определить диапазон, в котором находится LC₅₀.

8.2. Отчет о проведении теста

Отчет о тесте должен включать в себя следующую информацию:

- тестируемое вещество: химическую формулу, способ применения;

- тестируемые черви: возраст, условия содержания и кормления, источник приобретения;

- условия теста: описание, детали отклонения от рекомендуемых условий и материалов;

- информацию о растворителе, примененном в тесте.

Результаты теста:

- средняя живая масса - число живых червей до начала и в конце теста;

- описание явных физических или поведенческих патологических изменений у тестируемых животных;

- метод определения LC₅₀ со ссылкой на все использованные и полученные данные теста;

- графическое отражение зависимости эффекта от концентрации;

- гибель червей в контроле;

- гибель для вещества сравнения и тестируемого вещества;

- влажность и pH искусственной почвы перед началом и в конце теста;

- наивысшая концентрация, не вызвавшая гибели;

- самая низкая концентрация, вызвавшая 100% гибель.

Eisenia foetida может выращиваться с использованием различных видов отходов животного происхождения. Рекомендуется выращивать их в смеси конского или коровьего навоза и торфа, смешанных в пропорции 50:50; возможно также использование навоза других животных. Водный экстракт смеси должен иметь pH около 7,0, обладать низкой электропроводностью (менее 6,0 миллисименс) и не быть чрезмерно загрязненным аммиаком или мочой. Для крупномасштабного содержания червей идеальны деревянные ящики размером 50 x 50 x 15 см с плотно подогнанными крышками, в которых возможно получение более чем 1000 червей за шесть недель. Для производства достаточного количества червей на 20 кг навоза вносят 1 кг червей. В таких условиях черви достигают живой массы более 1 г каждый. Применяют червей, выравненных по возрасту и массе, лучше произведенных из коконов, которые выбирают из емкости с половозрелыми червями в течение 3 - 4 недель. После выведения из коконов черви созревают 7 - 8 недель при температуре 20 °C и могут использоваться в опыте.