"ГОСТ EN 14132-2013. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение охратоксина A в ячмене и жареном кофе. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1916-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") при участии специалистов Государственного научного учреждения "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии) на основе собственного аутентичного перевода на русский язык европейского регионального стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 14 ноября 2013 г. N 44)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. N 1916-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14132-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому региональному стандарту EN 14132:2009 Foodstuffs. Determination of ochratoxin A in barley and roasted coffee. HPLC method with immunoaffinity column cleanup (Продукты пищевые. Определение охратоксина A в ячмене и жареном кофе. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта).

Перевод с английского языка (en).

Официальный экземпляр европейского регионального стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.

Степень соответствия - идентичная (IDT)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт устанавливает метод определения охратоксина A в ячмене и жареном кофе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением очистки экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом. Метод прошел валидацию для диапазона содержания охратоксина A в ячмене от 0,1 до 4,5 мкг/кг и в жареном кофе от 0,2 до 5,5 мкг/кг.

Приведенные ниже ссылочные нормативные документы являются обязательными для применения настоящего стандарта. Датированные ссылки предполагают возможность использования только указанного издания документа. В случае недатированных ссылок используют последнее издание документа, включая все дополнения.

EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

При испытании ячменя охратоксин A экстрагируют из пробы водно-ацетонитрильной смесью, экстракт подвергают очистке на иммуноаффинной колонке. При испытании жареного кофе охратоксин A экстрагируют из измельченной пробы смесью метанола с водным раствором двууглекислого натрия. Экстракт подвергают очистке сначала на колонке с силикагелем, модифицированным фенилсилильными группами, затем на иммуноаффинной колонке. Количественное определение охратоксина A проводят методом ВЭЖХ с применением обращенно-фазовой колонки и флуориметрическим детектированием.

Для проведения анализа при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и дистиллированную воду или воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696:1995. Используемые растворители по степени чистоты должны быть пригодны для применения в анализе с помощью ВЭЖХ. Допускается использование доступных для приобретения готовых растворов при условии, что их характеристики не отличаются от приведенных ниже.

4.2 Натрий хлористый.

4.3 Натрий фосфорнокислый двузамещенный.

4.4 Калий фосфорнокислый однозамещенный.

4.5 Калий хлористый.

4.6 Натрия гидроксид, раствор массовой концентрации 

Растворяют 8 г гидроксида натрия в 900 см³ воды, объем полученного раствора доводят водой до 1 дм³.

Растворяют 8,0 г хлористого натрия по 4.2, 1,2 г двузамещенного фосфорнокислого натрия по 4.3, 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого калия по 4.4 и 0,2 г хлористого калия по 4.5 в 900 см³ воды. Значение pH полученного раствора доводят до 7,4 ед. pH путем добавления раствора гидроксида натрия по 4.13, после чего объем раствора доводят водой до 1 дм³. В качестве альтернативы допускается использовать доступный для приобретения таблетированный препарат аналогичного состава.

4.8 Натрий двууглекислый, раствор массовой концентрации 

Растворяют 30 г двууглекислого натрия в 900 см³ воды в мерной колбе вместимостью 1 дм³. Объем содержимого колбы доводят до метки водой.

4.9 Кислота уксусная ледяная массовой долей w (CH₃COOH) = 98%.

4.10 Метанол.

4.11 Ацетонитрил.

4.12 Толуол.

Смешивают 99 объемных частей толуола по 4.12 с одной объемной частью уксусной кислоты по 4.9.

Смешивают шесть объемных частей ацетонитрила по 4.11 с четырьмя объемными частями воды.

Смешивают одну объемную часть метанола по 4.10 с одной объемной частью раствора двууглекислого натрия по 4.8.

Смешивают 30 объемных частей метанола по 4.10 с 70 объемными частями воды и одной объемной частью уксусной кислоты по 4.9.

Смешивают 102 объемные части воды с 96 объемными частями ацетонитрила по 4.11 и двумя объемными частями уксусной кислоты по 4.9. Подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр диаметром пор 0,2 мкм по 5.12. Перед использованием подвижную фазу дегазируют.

Смешивают 20 объемных частей метанола по 4.10 с 80 объемными частями раствора двууглекислого натрия по 4.8.

4.19 Раствор 2 для промывания колонки с фенилсилильным сорбентом массовой концентрации двууглекислого натрия 

Растворяют 1 г двууглекислого натрия в 90 см³ воды в мерной колбе вместимостью 100 см³, объем содержимого в колбе доводят водой до метки.

Смешивают семь объемных частей метанола по 4.10 с 93 объемными частями воды.

Для приготовления основного раствора 1 мг кристаллического охратоксина A или при использовании ампульного препарата в пленочной форме содержимое одной ампулы растворяют в таком объеме смеси толуола с уксусной кислотой по 4.13, чтобы массовая концентрация охратоксина A в полученном растворе составила от 20 до 30 мкг/см³.

Для определения точной массовой концентрации охратоксина A в основном растворе регистрируют его оптическую плотность в диапазоне длин волн от 300 до 370 нм с интервалом 5 нм в кварцевой кювете длиной оптического пути 1 см по 5.14. В качестве раствора сравнения используют смесь толуола с уксусной кислотой по 4.13. По полученному спектру определяют длину волны, соответствующую максимальной оптической плотности. Массовую концентрацию охратоксина A, , мкг/см³, рассчитывают по формуле

где A_max - максимальное значение оптической плотности в данном диапазоне длин волн ;

M - молярная масса охратоксина A, г/моль (M = 403,8 г/моль);

- молярный коэффициент поглощения охратоксина A в смешанном растворителе по 4.13, м²/моль ;

b - длина оптического пути кюветы, см.

Основной раствор хранят при температуре около минус 18 °C, при этом срок его годности составляет не менее четырех лет.

Раствор готовят разбавлением основного раствора по 4.21 смесью толуола с уксусной кислотой по 4.13 до получения раствора массовой концентрации охратоксина A 10 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре около 4 °C. Перед использованием проверяют соответствие фактической массовой концентрации охратоксина A номинальному значению.

В стеклянный флакон помещают 200 мм³ стандартного раствора охратоксина A массовой концентрации 10 мкг/см³ по 4.22. Раствор разбавляют до объема 1 см³ путем добавления 800 мм³ смеси толуола с уксусной кислотой по 4.13, получают раствор охратоксина A массовой концентрации 2 мкг/см³. Порцию полученного раствора объемом 100 мм³ переносят микропипеткой в другой стеклянный флакон по 5.2, удаляют растворитель в токе азота, сухой остаток перерастворяют в 10 см³ дилюента по 4.16, предварительно фильтрованного через мембранный фильтр размером пор 0,2 мкм по 5.12. Массовая концентрация охратоксина A в полученном растворе составляет 20 нг/см³. Раствор готовят в день проведения испытания.

В стеклянный флакон вносят микропипеткой 100 мм³ стандартного раствора охратоксина A массовой концентрации 10 мкг/см³ по 4.22. Объем содержимого флакона доводят до 2 см³ добавлением 1,9 см³ смеси толуола с уксусной кислотой по 4.13. Массовая концентрация охратоксина A в полученном растворе составляет 500 нг/см³.

Для проведения испытания пригодна колонка с иммуноаффинным сорбентом, содержащим иммобилизованные антитела, специфичные в отношении охратоксина A, имеющая сорбционную емкость по охратоксину A не менее 100 нг. Каждую партию колонок проверяют на пригодность для использования путем внесения в колонку 100 нг охратоксина A в растворителе, идентичном растворителю экстракта из пробы при его внесении в колонку по 6.1.2, при этом полнота обнаружения охратоксина A должна быть не менее 85%.

Для проведения испытания пригодна колонка, содержащая 500 мг сорбента, с резервуаром вместимостью 3 см³, толщиной слоя сорбента, достаточной для предотвращения потерь аналита из-за его прохождения сквозь колонку без связывания. Сорбционная емкость колонки по охратоксину A должна быть не меньше 100 нг. Колонка должна обеспечивать полноту обнаружения не менее 85% при внесении в нее 100 нг охратоксина A в растворителе, идентичном экстрагенту для кофе по 4.15.

При проведении испытания используют общеупотребительное лабораторное оборудование, в частности, перечисленное ниже.

5.1 Весы аналитические, пригодные для взвешивания с точностью до 0,01 мг.

При использовании некоторых стеклянных флаконов возможны потери охратоксина A при выпаривании раствора. Для их предотвращения внутреннюю поверхность флаконов силанизируют, для чего флаконы заполняют силанизирующим реактивом и оставляют в покое на 1 мин. Затем флаконы дважды ополаскивают сначала растворителем (толуолом, ацетоном или гексаном), затем водой, после чего высушивают.

5.3 Блендер лабораторный взрывозащищенного исполнения с контейнером вместимостью 1 дм³, снабженным крышкой, обеспечивающий скорость вращения диспергирующего элемента до 20000 мин^-1.

5.4 Пипетки автоматические вместимостью 200 мм³, 1 и 5 см³ в комплекте с подходящими наконечниками.

5.5 Устройство для вакуумной фильтрации многопозиционное, приспособленное для установки иммуноаффинных и фенилсилильных колонок (манифолд).

5.6 Резервуары для элюента в комплекте с приспособлениями для установки иммуноаффинных колонок.

5.7 Насос вакуумный, обеспечивающий разрежение 10 мбар производительностью не менее 18 дм³/мин.

5.8 Встряхиватель лабораторный.

5.9 Центрифуга лабораторная рефрижераторная, обеспечивающая центробежное ускорение 1300 g и рабочую температуру 4 °C.

5.10 Пробирки центрифужные вместимостью 50 см³.

5.11 Фильтры бумажные размером пор от 20 до 25 мкм или аналогичные.

5.12 Фильтры мембранные полисульфоновые шприцевые размером пор 0,2 мкм, диаметром 25 мм.

5.13.1 Инжектор петлевого типа, обеспечивающий объем инжекции 100 мм³.

5.13.2 Насос для подачи подвижной фазы, работающий в изократическом режиме, обеспечивающий скорость подачи подвижной фазы 1 см³/мин.

5.13.3 Колонка для ВЭЖХ аналитическая, заполненная обращенно-фазовым сорбентом, например с привитыми октадецильными группами (ODS), обеспечивающая отделение пика охратоксина A от сопутствующих пиков матрицы пробы. Перекрывание пика охратоксина A другими пиками не должно превышать 10% его высоты. При необходимости для достижения требуемой степени разделения пиков проводят корректировку состава подвижной фазы. Для предотвращения потери работоспособности аналитической колонки рекомендуется использовать защитную колонку.

5.13.4 Детектор флуориметрический с проточной кюветой, пригодный для проведения измерений при длинах волн возбуждения и эмиссии соответственно 333 и 460 нм.

5.13.5 Компьютерная система обработки данных.

5.14 Спектрофотометр, пригодный для измерений оптической плотности в ультрафиолетовой области спектра, в комплекте с кварцевыми кюветами.

Лабораторную пробу измельчают до частиц, проходящих через сито размером ячейки 0,5 мм. 25 г пробы для анализа, взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в контейнер блендера по 5.3. В контейнер добавляют 100 см³ экстрагента по 4.14, контейнер закрывают крышкой и гомогенизируют его содержимое в течение 3 мин при скорости вращения диспергирующего элемента 20000 мин^-1. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр по 5.11.

Иммуноаффинную колонку подготавливают к использованию в соответствии с инструкциями изготовителя.

Аликвоту фильтрата, полученного по 6.1.1, объемом 4 см³ переносят с помощью пипетки в стакан, куда добавляют 44 см³ фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.7. Иммуноаффинную колонку по 4.25 устанавливают в вакуумный манифолд, к входному концу колонки присоединяют резервуар по 5.6. В резервуар вносят экстракт, разбавленный фосфатно-хлоридным буферным раствором, и пропускают его через колонку со скоростью не более 5 см³/мин. При этом не допускают попадания в колонку воздуха. Колонку промывают 10 см³ воды, после чего ее отсоединяют от манифолда и высушивают путем пропускания через нее воздуха не менее чем в двукратном объеме. Затем колонку устанавливают над стеклянным флаконом по 5.2, предназначенным для сбора элюата.

Охратоксин A элюируют с использованием подходящего растворителя в соответствии с рекомендациями изготовителя колонки. Элюат собирают в стеклянный флакон по 5.2. По окончании элюирования растворитель удаляют в токе азота при температуре около 50 °C. Сухой остаток перерастворяют в 1,0 см³ дилюента по 4.16 (V₃), раствор фильтруют через мембранный фильтр размером пор 0,2 мкм по 5.12. Полученный раствор пробы для хроматографического анализа переносят во флакон автосамплера хроматографа.

Лабораторную пробу измельчают до частиц, проходящих через сито размером ячейки 1 мм. Пробу для анализа массой 15 г, взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в коническую колбу вместимостью 500 см³, куда добавляют 150 см³ экстрагента по 4.15. Колбу закрывают пробкой, содержимое колбы встряхивают в течение 30 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр по 5.11. Порцию фильтрата объемом 50 см³ помещают в центрифужную пробирку по 5.10 и центрифугируют при центробежном ускорении 1300 g в течение 15 мин при температуре 4 °C.

Колонку с фенилсилильным сорбентом по 4.26 устанавливают в вакуумный манифолд по 5.5. На стадии подготовки колонки к использованию не следует применять разрежение. При необходимости скорость протока растворителя через колонку увеличивают, создавая некоторое избыточное давление с помощью азота. Колонку кондиционируют, пропуская через нее сначала 15 см³ метанола, затем 5 см³ раствора двууглекислого натрия по 4.8, элюат отбрасывают.

Аликвоту прозрачного центрифугированного экстракта по 6.2.1 объемом 10 см³ помещают в стакан, куда добавляют 10 см³ раствора двууглекислого натрия по 4.8. Разбавленный таким образом экстракт пропускают через фенилсилильную колонку, при этом скорость протока не должна превышать 5 см³/мин. Далее через колонку пропускают сначала 10 см³ промывного раствора 1 по 4.18, затем 5 см³ промывного раствора 2 по 4.19, при этом скорость протока также не должна превышать 5 см³/мин. После этого колонку отсоединяют от манифолда и высушивают путем пропускания через нее с помощью шприца не менее 10 см³ воздуха. Затем колонку устанавливают над стеклянным флаконом подходящей вместимости и элюируют охратоксин A с помощью 10 см³ элюента по 4.20 при скорости протока, не превышающей 5 см³/мин.

Полученный по 6.2.2 элюат разбавляют 30 см³ фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.7. Иммуноаффинную колонку по 4.25 устанавливают в вакуумный манифолд, к входному концу колонки присоединяют резервуар по 5.6. В резервуар вносят элюат, разбавленный фосфатно-хлоридным буферным раствором, и пропускают его через колонку со скоростью не более 5 см³/мин. При этом не допускается попадание в колонку воздуха. Колонку промывают 10 см³ воды, после чего ее отсоединяют от манифолда и помещают над стеклянным флаконом по 5.2, предназначенным для сбора элюата.

Охратоксин A элюируют четырьмя порциями элюента, указанного в инструкции по применению колонки, объемом 1 см³ каждая, элюат собирают во флакон по 5.2. По окончании элюирования растворитель удаляют в токе азота при температуре около 50 °C. Сухой остаток перерастворяют в 1,0 см³ дилюента по 4.16 (V₃), раствор фильтруют через мембранный фильтр размером пор 0,2 мкм по 5.12. Полученный раствор пробы для хроматографического анализа переносят во флакон автосамплера хроматографа.

Пробу для анализа массой 25 г, взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в контейнер блендера, куда затем добавляют 200 мм³ раствора охратоксина A по 4.24. Контейнер с пробой оставляют на ночь в вытяжном шкафу для удаления растворителя. Дальнейшую процедуру проводят в соответствии с 6.1.

Пробу кофе измельчают до частиц, проходящих через сито размером ячейки 1 мм. Отбирают пробу для анализа массой 15 г, взвешенной с точностью до 0,1 г, и помещают ее в коническую колбу вместимостью 500 см³, куда затем вносят 120 мм³ раствора охратоксина A по 4.24. Контейнер с пробой оставляют на ночь в вытяжном шкафу для удаления растворителя. Дальнейшую процедуру проводят в соответствии с 6.2.

Градуировку осуществляют в день проведения испытания перед хроматографическим анализом растворов проб или в случае изменения условий хроматографического анализа.

Готовят пять градуировочных растворов в соответствии с таблицей 1, для чего в мерные колбы вместимостью по 5 см³ пипеткой вносят различные объемы стандартного раствора по 4.23, объем содержимого в колбах доводят до метки дилюентом по 4.16, фильтрованным через мембранный фильтр.

Приведенные ниже параметры обеспечивают приемлемое качество хроматографического анализа при использовании аналитической колонки по 5.13.3 длиной 250 мм, внутренним диаметром 4.6 мм и диаметром частиц сорбента 5 мкм.

Скорость подачи подвижной фазы - 1,0 см³/мин.

Параметры работы флуориметрического детектора: длина волны возбуждения 333 нм, длина волны эмиссии 460 нм.

Объем инжекции - 100 мм³ (V₄).

Пик охратоксина A на хроматограмме раствора пробы идентифицируют по совпадению его времени удерживания с временем удерживания пика охратоксина A на хроматограммах градуировочных растворов. При возникновении сомнений в правильности идентификации пик охратоксина A на хроматограмме раствора пробы идентифицируют путем ее сопоставления с хроматограммой раствора пробы с добавлением градуировочного раствора охратоксина A.

Количественное определение проводят по методу внешнего стандарта. При этом либо осуществляют градуировку по одному градуировочному раствору, площадь или высота пика аналита на хроматограмме которого наиболее близки к площади или высоте пика аналита на хроматограмме раствора пробы, либо используют градуировочный график. В последнем случае проводят анализ нескольких градуировочных растворов, при этом необходимо, чтобы массовые концентраций охратоксина A в них находились в пределах линейного участка градуировочной зависимости.

Соблюдают одинаковые объемы инжекции при анализе раствора пробы и градуировочных растворов.

Если аналитический сигнал, относящийся к пику охратоксина A в растворе пробы, выходит за верхнюю границу диапазона градуировки, раствор пробы разбавляют в необходимой мере.

По градуировочной характеристике определяют массу охратоксина A, нг, в инжектированной аликвоте раствора пробы.

Содержание охратоксина A в пробе, w_ota, мкг/кг, рассчитывают по формуле

где m_a - масса охратоксина A в инжектированной аликвоте раствора пробы, нг;

m_s - масса анализируемой пробы, г (m_s = 25 г для ячменя и m_s = 15 г для кофе);

V₃ - объем приготовленного раствора пробы для хроматографического анализа по 6.1.3 и 6.2.3, см³ (V₃ = 1,0 см³);

V₁ - объем экстрагента, использованный для экстракции, см³ (V₁ = 100 см³ для ячменя и V₁ = 150 см³ для кофе);

V₄ - объем инжекции раствора пробы для хроматографического анализа по 6.2, см³;

V₂ - объем аликвоты экстракта, отобранной для очистки на иммуноаффинной колонке, см³ (V₂ = 4,0 см³ для ячменя по 6.2.1 и V₂ = 10 см³ для кофе по 6.2.2).

Результат испытания выражают в микрограммах на килограмм, или в нанограммах на грамм.

Подробности межлабораторных испытаний по определению прецизионности метода приведены в приложении A. Значения метрологических характеристик, полученные в результате межлабораторных испытаний, могут быть не применимы к другим содержаниям аналита и другим типам матриц, чем те, что указаны в приложении A.

Абсолютное расхождение между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в одной лаборатории одним оператором с использованием одного оборудования в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости r более чем в 5% случаев.

Значения предела повторяемости для ячменя равны:

(холостая проба);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);

(проба с добавкой охратоксина A);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем).

Значения предела повторяемости для кофе равны:

(холостая проба);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);

(проба с добавкой охратоксина A);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем).

Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования, не должно превышать предел воспроизводимости R более чем в 5% случаев.

Значения предела воспроизводимости для ячменя равны:

(холостая проба);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);

(проба с добавкой охратоксина A);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем).

Значения предела воспроизводимости для кофе равны:

(холостая проба);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);

(проба с добавкой охратоксина A);

(проба, загрязненная охратоксином A естественным путем).

Протокол испытаний должен содержать как минимум следующие сведения:

a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;

b) ссылку на настоящий стандарт;

c) дату и время отбора пробы (если известны);

d) дату поступления пробы в лабораторию;

e) дату проведения испытания;

f) результаты испытания с указанием единиц измерения;

g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытания;

h) все операции, не оговоренные в методике или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат испытания.

Приведенные в таблицах A.1 и A.2 данные получены в результате межлабораторных испытаний [2], [3], организованных в соответствии с [4].