"ГОСТ ISO 10727-2013. Межгосударственный стандарт. Чай и чай растворимый. Определение содержания кофеина. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(введен в действие Приказом Росстандарта от 28.06.2013 N 355-ст)

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

1. Подготовлен Некоммерческой организацией "Российская Ассоциация производителей чая и кофе "РОСЧАЙКОФЕ" (Ассоциация "РОСЧАЙКОФЕ") на основе аутентичного перевода на русский язык указанного в пункте 5 международного стандарта, который выполнен ФГУП "СТАНДАРТИНФОРМ".

2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт).

3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол от 25 марта 2013 г. N 55-П).

За принятие голосовали:

4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2013 г. N 355-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10727-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2014 г.

5. Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 10727:2002 Tea and instant tea in solid form - Determination of caffeine content - Method using high-performance liquid chromatography (Чай и быстрорастворимый чай в твердой форме. Определение содержания кофеина. Метод жидкостной хроматографии высокого разрешения).

Международный стандарт разработан подкомитетом ISO TC 34/SC 8 "Чай" технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Перевод с английского языка (en).

Официальный экземпляр международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (раздел 3.6).

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном Приложении ДА.

Степень соответствия - идентичная (IDT).

6. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания кофеина в чае и растворимом чае методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Метод применим к чаю и растворимому чаю, в т.ч. декофеинизированным.

Следующие ниже стандарты содержат положения, которые посредством ссылок в данном тексте составляют положения данного стандарта. На время публикации данного стандарта указанные издания были действующими. Все стандарты могут пересматриваться, и сторонам - участникам соглашения по настоящему стандарту рекомендуется проанализировать возможность применения последнего издания указанных ниже стандартов. Комитеты - члены ISO и IEC ведут указатели действующих международных стандартов.

ISO 1572:1980 Tea; Preparation of ground sample of known dry matter content (Чай. Приготовление измельченной пробы с известным содержанием сухих веществ)

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use; Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

ISO 7513:1990 Instant tea in solid form; determination of moisture content (loss in mass at 103 °C) (Чай быстрорастворимый в твердой форме. Определение содержания влаги (потеря массы при 103 °C)).

Кофеин из пробы чая экстрагируется водой в присутствии оксида магния. После фильтрации содержание кофеина определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием.

Применяют реактивы подтвержденного аналитического качества.

4.1. Вода дистиллированная в соответствии с ISO 3696.

4.2. Метанол класса для ВЭЖХ.

4.3. Подвижная фаза, водный раствор метанола.

Вносят 600 см³ метанола (см. 4.2) в мерную колбу вместимостью 2 дм³. Добавляют дистиллированную воду до метки. Перемешивают и фильтруют раствор через фильтр с размером пор 0,45 мкм (см. 5.3).

Регулируя концентрацию метанола, можно изменять время удерживания кофеина с целью оптимизации хроматографического разделения. Той же цели можно достигнуть путем увеличения температуры колонки, но не выше 60 °C.

4.4. Этанол, 25% (об.) водный раствор.

4.5. Магния оксид (так называемый "тяжелый оксид магния").

Примечание. Использование легкого оксида магния может привести к ошибкам в определении кофеина.

4.6. Кофеин, исходный раствор массовой концентрации 500 мкг/см³.

Взвешивают 0,125 г кофеина с точностью +/- 0,001 г в мерную колбу вместимостью 250 см³. Добавляют достаточное количество водного раствора этанола (см. 4.4) - примерно до половины объема колбы. Перемешивают до полного растворения кофеина и добавляют водный раствор этанола до метки.

Раствор можно использовать в течение месяца при хранении в холодильнике.

4.7. Кофеин, стандартные растворы.

Стандартные растворы кофеина A, B, C и D готовят в день использования.

4.7.1. Кофеин, стандартный раствор A массовой концентрации 15 мкг/см³.

Используют исходный раствор (см. 4.6), имеющий комнатную температуру. С помощью пипетки помещают 3,0 см³ этого раствора в мерную колбу объемом 100 см³. Добавляют дистиллированную воду до метки и перемешивают.

4.7.2. Кофеин, стандартный раствор B массовой концентрации 10 мкг/см³.

Следуют процедуре, приведенной в 4.7.1, но отбирают пипеткой 2,0 см³ исходного раствора кофеина (см. 4.6).

4.7.3. Кофеин, стандартный раствор C массовой концентрации 5 мкг/см³.

Следуют процедуре, приведенной в 4.7.1, но отбирают пипеткой 1,0 см³ исходного раствора кофеина (см. 4.6).

4.7.4. Кофеин, стандартный раствор D массовой концентрации 2 мкг/см³.

С помощью пипетки переносят 20 см³ стандартного раствора кофеина B (см. 4.7.2) в мерную колбу объемом 100 см³. Добавляют дистиллированную воду до метки и перемешивают.

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности:

5.1. Высокоэффективный жидкостной хроматограф, оборудованный УФ детектором, позволяющим проводить измерения в диапазоне длин волн от 254 до 280 нм, и системой сбора данных или самописцем.

Примечание. Предпочтительным является измерение на длине волны, близкой к 280 нм, т.к. максимум поглощения кофеина наблюдается на длине волны 272 нм.

Если наблюдается заметное суточное изменение температуры, должны быть предприняты меры для поддержания постоянной температуры колонки, например с помощью термостата колонки или водяного охлаждения.

5.2. Хроматографическая колонка для ВЭЖХ с обращенными фазами типа C18 (предпочтительно со сферическими частицами и эффективностью не менее 5000 теоретических тарелок) <*>. Число теоретических тарелок N может быть рассчитано исходя из формы пика, полученного при вводе одного из стандартных растворов кофеина (см. 4.7), по формуле

где t - время удерживания пика;

W_0,5 - ширина пика на половине высоты.

--------------------------------

<*> Spherisorb 5 ODS, Spherisorb 10 ODS, Nucleosil 5 C18, Nucleosil 7 C18, Nucleosil 10 C18, Zorbax BP C18, Hypersil ODS, CP-Sper C18, Bondapak C18, Supelcosil L C18 и Partisphere C18 являются примерами продукции, имеющейся в продаже. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является одобрением данной продукции со стороны ISO.

Примечание. В данном стандарте условия проведения хроматографического разделения и состав подвижной фазы (см. 4.3) определены для колонки Partisphere C18 размером 110 x 4,6 мм, установленной в систему для ВЭЖХ Whatman. Если используются другие типы колонок, могут потребоваться другие подвижные фазы и условия проведения хроматографического разделения.

5.3. Фильтр с размером пор 0,45 мкм.

5.4. Электрический колбонагреватель, подходящий для колб с круглым дном вместимостью 1 дм³.

5.5. Колба круглодонная вместимостью 1 дм³, со шлифом.

5.6. Противоударные гранулы.

5.7. Обратный холодильник с водяным контуром, со шлифом, предназначенный для присоединения к круглодонной колбе вместимостью 1 дм³.

5.8. Аналитические весы с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,001 г.

Необходимо, чтобы полученная проба была репрезентативной и не была повреждена при хранении и транспортировании.

Процедура отбора пробы настоящим стандартом не регламентируется. Рекомендуемые методы отбора проб по [1] для чая, по [2] - для растворимого чая.

Измельчают пробу чая в соответствии с ISO 1572.

В измельчении пробы растворимого чая необходимости нет.

8.1. Общие положения

Необходимо убедиться в том, что удовлетворено требование к повторяемости. Проводят два испытания в соответствии с 8.2 - 8.6 при соблюдении условия повторяемости.

8.2. Определение массовой доли сухого вещества в пробе

Рассчитывают массовую долю сухого вещества исходя из массовой доли влаги, определенной по потере массы частью пробы при 103 °C в соответствии с ISO 1572 для чая, ISO 7513 - для растворимого чая.

8.3. Пробы для анализа

8.3.1. Чай

В круглодонную колбу (см. 5.5) отвешивают 1,0 г анализируемой пробы (см. раздел 7) с точностью +/- 0,001 г.

8.3.2. Растворимый чай

В круглодонную колбу (см. 5.5) отвешивают 0,5 г пробы (см. раздел 7) с точностью +/- 0,001 г.

8.4. Экстрагирование кофеина

8.4.1. В круглодонную колбу, содержащую подготовленную пробу чая, добавляют (4,5 +/- 0,5) г оксида магния (см. 4.5), помещают несколько противоударных гранул (см. 5.6) и добавляют 300 см³ дистиллированной воды. Взвешивают колбу с содержимым с точностью до 0,1 г.

8.4.2. Перемешивают содержимое. Присоединяют к колбе обратный холодильник (см. 5.7), помещают колбу на электрический колбонагреватель (см. 5.4) и быстро доводят содержимое до кипения. Уменьшают мощность колбонагревателя и кипятят содержимое в течение 20 мин при периодическом перемешивании.

8.4.3. Снимают колбу с колбонагревателя и охлаждают содержимое до комнатной температуры. Вытирают внешнюю поверхность колбы от влаги и взвешивают колбу с содержимым с точностью до 0,1 г. Масса колбы с содержимым должна равняться значению, полученному в 8.4.1. Если значения различаются, добавляют соответствующее количество дистиллированной воды так, чтобы масса достигла значения, полученного в 8.4.1, и перемешивают содержимое.

8.4.4. Дают раствору отстояться, отбирают примерно 10 см³ экстракта и фильтруют через фильтр (см. 5.3).

8.5. Разбавление (для чая и растворимого чая с нормальным содержанием кофеина)

С помощью пипетки помещают 1,0 см³ фильтрата, полученного по 8.4.4, в мерную колбу вместимостью 10 см³. Добавляют дистиллированную воду до метки и перемешивают.

Для декофеинизированных чаев разбавление не проводят.

8.6. Проведение анализа

8.6.1. Подготовка хроматографа

Готовят хроматограф в соответствии с рекомендациями изготовителя и устанавливают следующие параметры хроматографического разделения:

- скорость потока подвижной фазы (см. 4.3): от 0,5 до 1,5 см³/мин в зависимости от используемой колонки (см. 5.2);

- температура колонки (см. 5.2): оптимальное значение 40,0 °C (с учетом 4.3).

8.6.2. Хроматографический анализ

Убедившись в стабильности скорости потока подвижной фазы (см. 4.3) и температуры колонки, вводят в колонку по 0,02 см³ стандартных растворов кофеина A, B, C и D (см. 4.7.1 - 4.7.4), а затем такой же объем анализируемого раствора, полученного в соответствии с 8.4.4 для декофеинизированного чая, в соответствии с 8.5 - для листового и растворимого чая с нормальным содержанием кофеина. Периодически повторяют введение стандартных растворов (обычно после 6 анализируемых растворов). Записывают данные для всех пиков, соответствующих стандартным и анализируемым растворам.

Идентифицируют пики, соответствующие стандартным и анализируемым растворам, и измеряют их высоту или площадь (площади предпочтительнее). Для стандартных растворов кофеина строят линейную калибровочную зависимость стандартной концентрации кофеина (мкг/см³) от площади или высоты пиков. Автоматически (с помощью системы сбора данных) или вручную (по выбранным точкам на линии калибровочной зависимости) вычисляют коэффициент отклика RF

где C_std - концентрация стандартного раствора кофеина в мкг/см³;

A_std - площадь пика, полученного для стандартного раствора кофеина;

h_std - высота пика, полученного для стандартного раствора кофеина.

Содержание кофеина w, массовая доля (в процентах), приведенная к содержанию сухого вещества в пробе, вычисляют по формуле

или

где A_samp - площадь пика, полученного для анализируемого раствора;

RF - коэффициент отклика для кофеина;

d - коэффициент разбавления (10 для чая и чая растворимого);

m - масса пробы в граммах;

w_DM - содержание сухого вещества в пробе (массовая доля в процентах), определяемое в соответствии с 8.2;

h_samp - высота пика, полученного для анализируемого раствора.

10.1. Межлабораторные испытания

Подробности межлабораторных испытаний для определения прецизионности метода приведены в Приложении А. Значения, полученные в результате этих межлабораторных испытаний, могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и образцам, отличным от указанных.

10.2. Повторяемость

Абсолютное значение разности результатов двух независимых испытаний, проведенных с использованием одного и того же метода на одном и том же образце в одной и той же лаборатории на одном и том же оборудовании одним и тем же оператором в течение небольшого промежутка времени, не должно превышать значения предела повторяемости r, приведенного в таблице А.1, более чем в 5% испытаний.

10.3. Воспроизводимость

Абсолютное значение разности результатов двух независимых испытаний, проведенных с использованием одного и того же метода на одном и том же образце в различных лабораториях на различном оборудовании разными операторами, не должно превышать значения предела воспроизводимости R, приведенного в таблице А.1, более чем в 5% испытаний.

Протокол испытаний должен содержать:

- информацию, необходимую для идентификации пробы;

- информацию о методе отбора пробы;

- информацию о методе испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

- детали испытания, не установленные в данном стандарте или считающиеся необязательными, а также подробности всех обстоятельств, которые могут повлиять на результат;

- результаты испытаний;

- полученный окончательный результат, если проводилась проверка повторяемости.

В межлабораторных испытаниях, проведенных в 1999 г. под эгидой Международной организации стандартизации, были получены результаты (оцененные в соответствии с [3]), которые приведены в таблице А.1.