"ГОСТ 28566-90 (СТ СЭВ 6646-89). Государственный стандарт Союза ССР. Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества энтерококков"
(утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 29.05.1990 N 1332)

1. Разработан и внесен Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности.

Разработчики: В.И. Рогачев, д-р техн. наук; Б.И. Голод, канд. биол. наук; Р.А. Волкова.

2. Утвержден и введен в действие Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 29.05.90 N 1332.

3. Срок первой проверки - 1996 г.

Периодичность проверки - 5 лет.

4. Стандарт соответствует стандарту СЭВ 6646-89.

5. Введен впервые.

6. Ссылочные нормативно-технические документы

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления и количественного определения энтерококков (Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus avium, Streptococcus gallinarum).

Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведении в жидкую селективную среду или на поверхность плотной селективной среды, аэробном культивировании посевов при (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч, подтверждении принадлежности выросших микроорганизмов к энтерококкам, пересчете их количества на 1,0 г (см3) продукта.

Отбор проб - по ГОСТ 26668, подготовка к испытанию - по ГОСТ 26669.

Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности +/- 2 мг (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности +/- 10 мг (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический с увеличением в 900 - 1000 раз;

стерилизатор горячим воздухом;

термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55 °C, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью +/- 1 °C;

холодильник бытовой;

водорода перекись по ГОСТ 10929;

желчь крупного рогатого скота или сухая желчь;

железо (III) - аммония гидроцитрат;

ферментативный гидролизат казеина;

канамицин сульфат во флаконах по 0,5 г - 500000 ЕД и 1 г - 1000000 ЕД, в ампулах по 5 и 10 см3 5% раствора, содержащих 0,25 и 0,5 г препарата;

полимиксин М сульфат во флаконах по 500000 ЕД;

эскулин;

натрия гидрокарбонат (NaHCO₃) по ГОСТ 4201.

3.1. Приготовление растворов

3.1.1. Раствор с объемной долей перекиси водорода 10%: 33,3 см3 перекиси водорода с содержанием основного вещества 30% (в случае если перекись водорода имеет другое содержание основного вещества, то делается пересчет) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки.

3.1.2. Раствор с массовой долей HCl 5%: 11,5 см3 концентрированной соляной кислоты переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки.

3.1.3. Раствор массовой концентрацией натрия гидроокиси 50 г/дм3: 5 г натрия гидроокиси переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.4. Раствор 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) массовой концентрацией 10 г/дм3: 1 г ТТХ переносят, смывая дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670. В темной плотно закрытой посуде раствор хранят при (4 +/- 2) °C не более 3 мес.

3.1.5. Раствор массовой концентрацией теллурита калия 20 г/дм3: 2 г теллурита калия переносят, смывая дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.

3.1.6. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 г/дм3: 1,6 г бромтимолового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.7. Раствор массовой концентрацией кристаллического фиолетового 0,1 г/дм3: 0,01 г кристаллического фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.8. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового пурпурного 16 г/дм3: 1,6 г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.9. Раствор массовой концентрацией натрия азида 100 г/дм3: 10 г натрия азида переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют при легком подогревании в дистиллированной воде и раствор доливают до метки. Раствор готовят под вытяжкой, так как пары натрия азида ядовиты.

3.1.10. Раствор массовой концентрацией канамицина сульфата 50 г/дм3 (50000000 ЕД) и 100 г/дм3 (100000000 ЕД): во флаконы с 0,5 г или 1 г препарата вносят 10 см3 стерильной дистиллированной воды, содержимое флаконов растворяют.

3.1.11. Молоко обезжиренное готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.12. Растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1. Азидно-глюкозный бульон

Основа среды: к 1 дм3 мясопептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, добавляют 5,0 г пептона, 7,5 г глюкозы, 2,5 г натрия хлорида, составные части растворяют нагреванием. После этого охлаждают и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации при 25 °C он составлял (7,2 +/- 0,1). Затем основу среды стерилизуют текучим паром (при 100 °C) в течение 30 мин. К основе среды, охлажденной до 50 °C, добавляют 2,0 см3 натрия азида, приготовленного по п. 3.1.9, и 2,0 см3 раствора бромкрезолового пурпурного, приготовленного по п. 3.1.8. Готовую среду не стерилизуют. Среду хранят в защищенном от света и высыхания виде при (4 +/- 2) °C не более 3 мес. Непосредственно перед использованием ее разливают по 5 см3 в стерильные пробирки.

3.2.2. Глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с pH 7,2 и 9,6: 5,0 г триптона или ферментативного казеинового гидролизата, 12,5 см3 дрожжевого экстракта, 1,0 г глюкозы добавляют к 1 дм3 дистиллированной воды. Смесь, периодически помешивая, подогревают до полного растворения всех составных частей, охлаждают и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °C (7,2 +/- 0,1) или (9,6 +/- 0,1).

Среду разливают по 5 см3 в пробирки и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин. Среду хранят при (4 +/- 2) °C не более 14 сут.

3.2.3. Солевой бульон

Основа среды - глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с pH (7,2 +/- 0,1) по п. 3.2.2.

При приготовлении питательной среды в 1 дм3 основы среды растворяют на водяной бане 65,0 г натрия хлорида, разливают по 5 см3 в пробирки, стерилизуют при (121 +/- 1)°C в течение 15 мин.

Питательную среду можно готовить за одну операцию, тогда в процессе приготовления основы среды добавляют 65,0 г натрия хлорида. Среду хранят при (4 +/- 2) °C не более месяца.

3.2.4. 40%-ный желчный бульон

Основа среды - глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с pH (7,2 +/- 0,1). К 600 см3 охлажденной до 45 - 55 °C основы среды добавляют асептически 400 см3 стерильной профильтрованной желчи крупного рогатого скота или эквивалентное количество сухой желчи.

Среду хранят при (4 +/- 2) °C не более 3 мес.

3.2.5. Селективный агар по Сланецу и Бертли:

20,0 г пептона, 25,0 см3 дрожжевого экстракта, 2,0 г глюкозы, 4,0 г калия фосфорнокислого двузамещенного, (15,0 +/- 3,0) г агара помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доливают дистиллированной водой до метки, нагревают до растворения компонентов. Охлаждают, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °C (7,2 +/- 0,1). Стерилизуют текучим паром (при 100 °C) в течение 30 мин, охлаждают до 50 °C. Добавляют 4,0 см3 раствора азида натрия, приготовленного по п. 3.1.9, и 10,0 см3 раствора 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида, приготовленного по п. 3.1.4, хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри. Среду хранят при (4 +/- 2) °C не более 7 сут.

3.2.6. Канамицин азидно-эскулиновый агар (КАЭ-агар):

20,0 г пептона из казеина, 25,0 см3 дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлорида, 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,5 г железа (III) - аммония гидроцитрата, 1,0 г эскулина, (15,0 +/- 3,0) г агара помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доливают дистиллированной водой до метки. Растворяют составные части при нагревании, охлаждают, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации при 25 °C он составлял (7,1 +/- 0,1). Стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 15 мин, охлаждают до 50 °C, добавляют 1,5 см3 раствора азида натрия, приготовленного по п. 3.1.9, и 0,4 см3 раствора канамицина сульфата массовой концентрацией 50 г/дм3 или 0,2 см3 раствора канамицина сульфата массовой концентрацией 100 г/дм3 и разливают по чашкам Петри. Среду хранят при (4 +/- 2) °C не более 7 сут.

3.2.7. Глюкозо-триптонный агар с дрожжевым экстрактом с pH (7,2 +/- 0,1) готовят по п. 3.2.2, но при приготовлении добавляют на 1 дм3 среды (15,0 +/- 3,0) г агара.

3.2.8. Щелочная полимиксиновая среда:

Основа среды - к 400 см3 мясо-пептонного бульона по ГОСТ 10444.1 добавляют 5 г натрия хлорида, 10 г глюкозы, 10 см3 дрожжевого экстракта. Основу среды стерилизуют при (110 +/- 1) °C в течение 12 мин, охлаждают и добавляют 250 см3 раствора натрия карбоната массовой концентрацией 21,2 г/дм3 и 250 см3 раствора бикарбоната натрия массовой концентрацией 10 г/дм3. Устанавливают pH таким образом, чтобы при 25 °C он составлял (10,1 +/- 0,1). После этого к среде добавляют 200000 ЕД полимиксина М сульфата, 5,0 см3 спиртового раствора бромтимолового синего, приготовленного по п. 3.1.6. Среду хранят в защищенном от света и высыхания виде при (4 +/- 2) °C не более 7 сут. Непосредственно перед использованием среду разливают по 5 см3 в стерильные пробирки.

3.2.9. Молочно-ингибиторная среда (МИС):

К 850 см3 расплавленного и охлажденного до 50 °C мясо-пептонного агара, приготовленного по ГОСТ 10444.1, добавляют 150 см3 обезжиренного молока, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 12,5 см3 раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.7, 10,0 см3 раствора калия теллурита массовой концентрацией 20 г/дм3, 200000 ЕД полимиксина М сульфата. Среду не стерилизуют, разливают в стерильные чашки Петри и хранят при (4 +/- 2) °C не более 10 сут. Допускается взамен раствора калия теллурита добавлять в среду 5,0 см3 раствора 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида, приготовленного по п. 3.1.4.

4.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить ожидаемое количество энтерококков в 1,0 г (см3) продукта или определить допустимое количество энтерококков, указанное в нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта.

При выявлении энтерококков из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений так, чтобы можно было определить минимальное количество продукта, содержащее энтерококки, или высевают навеску продукта, которая указана в нормативно-технической документации на этот продукт.

4.2. Для определения количества энтерококков 0,1 или 0,2 см3 продукта или его разведения высевают по ГОСТ 26670 на поверхность предварительно подсушенной агаризованной питательной среды, приготовленной по п. 3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.9.

4.3. Если необходимо выявить энтерококки в навеске продукта определенной массы или объема, то навеску продукта или его разведение высевают непосредственно в жидкую питательную среду по п. 3.2.1 или 3.2.8.

4.4. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч, через 24 ч проводят предварительный учет результатов, через 48 ч - окончательный.

4.5. После инкубирования посевов, проведенных по п. 4.3, учитывают пробирки с признаками роста микроорганизмов: помутнением среды и изменением ее окраски в желтый цвет. Из пробирок с признаками роста, предположительно энтерококков, делают пересевы на поверхность агаризованной среды по п. 3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.9 таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний, посевы на этих средах инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч.

4.6. После инкубирования посевов, проведенных по п. 4.2, учитывают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 характерных для энтерококков колоний:

на питательной среде по п. 3.2.5 колонии энтерококков красно-розовые или карминовые с коричневым оттенком диаметром до 2 мм;

на питательной среде по п. 3.2.6 колонии энтерококков оливково-зеленые до темно-коричнево-черных с равномерной окраской поля;

на питательной среде по п. 3.2.9:

1) с 2- 3-, 5-ТТХ-колонии вишнево-красные с зоной протеолиза или бесцветные с розовым центром;

2) с теллуритом калия - колонии окрашены в черный цвет.

4.7. Посевы по п. 4.5 через 24 - 48 ч инкубирования просматривают и отмечают рост колоний, характерных для энтерококков по п. 4.6.

4.8. Для дальнейшего подтверждения принадлежности характерных колоний к энтерококкам отбирают не менее пяти колоний из посевов по пп. 4.6 и 4.7 и пересевают их на чашки Петри с агаризованной средой по п. 3.2.7 таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч.

4.9. Подтверждение принадлежности характерных колоний к энтерококкам

4.9.1. Из колоний, выросших по п. 4.8, готовят препараты, окрашивают по Граму по ГОСТ 10444.3.

Энтерококки - грамположительные кокки, расположенные парами, короткими или длинными цепочками.

4.9.2. У колоний определяют наличие каталазы по ГОСТ 10444.3. Энтерококки каталазу не образуют.

4.10. При более углубленном анализе и в целях эпидемиологического обследования проводят дальнейшее подтверждение характерных колоний.

4.10.1. Для определения возможности роста при температуре (45 +/- 1) °C культуры высевают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с pH (7,2 +/- 0,1) по п. 3.2.2. Посевы инкубируют при (45 +/- 1) °C 48 - 72 ч. Энтерококки вызывают помутнение среды.

4.10.2. Для определения возможности роста в среде с массовой концентрацией NaCl 65 г/дм3 культуры высевают в солевой бульон по п. 3.2.3 и инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч. Энтерококки вызывают помутнение среды и выпадение осадка. S. avium в среде с массовой концентрацией NaCl 65 г/дм3 не растет или растет очень медленно.

4.10.3. Для определения возможности роста в питательной среде с pH 9,6 культуры высевают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом и pH 9,6 по п. 3.2.2 и инкубируют в течение 24 - 48 ч при (37 +/- 1) °C. Энтерококки вызывают помутнение среды.

4.10.4. Для постановки теста на терморезистентность культуры высевают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с pH (7,2 +/- 0,1), пробирки выдерживают при (60 +/- 1) °C в течение 30 мин и инкубируют в течение 24 - 48 ч при (37 +/- 1) °C. Энтерококки вызывают помутнение среды.

4.10.5. Для определения возможности роста в среде с 40%-тами желчи культуры высевают в 40%-ный желчный бульон по п. 3.2.4 и инкубируют в течение 24 - 48 ч при (37 +/- 1) °C. Энтерококки вызывают помутнение среды.

5.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2. Если при изучении культуральных и морфологических свойств микроорганизмов обнаружены грамположительные, не образующие каталазу кокки, то дают заключение о том, что обнаруженные микроорганизмы относят к энтерококкам.

5.3. Если при подтверждении характерных колоний в 80% случаев, т.е. не менее чем в 4 из 5 колоний, подтвержден рост энтерококков, то считают, что все колонии, выросшие на чашке по п. 4.6, принадлежат к энтерококкам.

В остальных случаях количество энтерококков определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству колоний, взятых для подтверждения.

При посеве навески продукта или разведения продукта на жидкие среды пробирки считают положительными, если при последующем пересеве на агаризованные среды и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной характерной колонии обнаружены энтерококки.

5.4. Результаты записывают следующим образом:

5.4.1. Результаты определения количества энтерококков пересчитывают на 1 г/см3 продукта и записывают в соответствии с требованиями ГОСТ 26670.

5.4.2. Результаты выявления энтерококков в определенной навеске записывают: энтерококки обнаружены или не обнаружены (при этом указывается навеска продукта).