"ГОСТ 7702.2.3-93. Межгосударственный стандарт. Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Метод выявления сальмонелл"
(введен в действие Постановлением Госстандарта России от 02.06.1994 N 160)

Ссылочные нормативно-технические документы

1. Разработан Госстандартом России.

Внесен Техническим секретариатом Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации.

2. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации 21 октября 1993 г.

За принятие проголосовали:

3. Постановлением Комитета Российской Федерации по стандартизации, метрологии и сертификации от 02.06.94 N 160 межгосударственный стандарт ГОСТ 7702.2.3-93 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 01.01.95.

4. Взамен ГОСТ 7702.2-74 в части метода выявления сальмонелл.

5. Переиздание.

Настоящий стандарт распространяется на предназначенные для реализации и промышленной переработки:

мясо птицы в виде потрошеных, полупотрошеных и потрошеных с комплектом потрохов и шеей тушек, частей, полученных при их разделке, а также обваленное и измельченное;

субпродукты и полуфабрикаты птичьи.

Стандарт устанавливает метод выявления сальмонелл.

Метод основан на высеве определенного количества продукта или смывов с его поверхности на жидкие неселективные и селективные питательные среды с выделением чистых культур на диагностических средах с морфологическими и культуральными признаками сальмонелл; в проверке биохимических свойств выделенных культур; в проверке их серологических реакций.

2.1. Для выращивания бактериальных культур навеску продукта не менее 25 г или смыва не менее 25 см3 высевают в пептонно-буферную воду, приготовленную по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.11 в соотношении 1:5. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 16 - 24 ч. Затем 10 см3 культуры из пептонно-буферной воды пересевают в 90 см3 одной из сред обогащения (Мюллера, Кауфмана, селенитовую, селенит-цистиновую, магниевую) по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.12 - 2.4.16. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч.

Через 24 и 48 ч со второй среды обогащения пересевают на две любые дифференциальные среды - Эндо, Левина, висмут-сульфитный агар и другие - по выбору см. (ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.10; 2.4.17; 2.4.18). Посевы на всех средах, кроме висмут-сульфитного агара инкубируют в течение 18 - 24 ч, а на висмут-сульфитном агаре при отсутствии роста подозрительных колоний инкубируют (48 +/- 1) ч при (37 +/- 1) °C.

Сальмонеллы на средах Эндо и Плоскирева растут в виде бесцветных колоний, на среде Левина - голубоватых, на висмут-сульфитном агаре - обычно в виде черных колоний с металлическим блеском с окраской среды под колониями в черный цвет. S. typhi и некоторые другие на висмут-сульфитном агаре растут в виде бесцветных или светло-зеленых колоний без окраски среды под колониями. На агаре с бриллиантовым зеленым и феноловым красным типичные сальмонеллы имеют розовую окраску.

При отсутствии подозрительных колоний на дифференциальных средах работу с посевами прекращают. Подозрительные колонии используют в дальнейших исследованиях.

2.2. Биохимические свойства культуры определяют путем исследования не менее пяти подозрительных колоний, выросших на дифференциальной среде. Определяют расщепление сахаров, мочевины, образование индола, сероводорода, ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра), утилизацию цитрата, расщепление аминокислот.

2.2.1. Для выявления расщепления сахаров используют либо среды Гисса по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.19, либо одну из комбинированных сред (Клиглера, Ресселя, агар тройной сахарный по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.20 - 2.4.22).

Для посевов в среды Гисса часть каждой из пяти отобранных подозрительных колоний снимают бактериологической петлей, размешивают в 0,5 - 1 см3 стерильного физиологического раствора. Полученную взвесь засевают в среды Гисса, инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 12 - 18 ч, после чего посевы просматривают. При образовании кислоты меняется цвет среды.

Посев на одну из комбинированных сред проводят штрихом на скошенную часть и уколом в столбик. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C, учет проводят через (24 +/- 1) ч.

При ферментации лактозы, сахарозы в скошенной части столбика комбинированных сред происходит пожелтение. Покраснение или пожелтение самого столбика указывает на расщепление глюкозы.

Сальмонеллы не разлагают лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу с образованием кислоты и газа, а маннит - с образованием кислоты.

2.2.2. Для выявления расщепления мочевины используют одну из сред: агар тройной сахарный или скошенный агар с мочевиной по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.24.

Восстановление изменившегося цвета среды агара тройного сахарного при расщеплении глюкозы (см. 2.2.1) с красного или желтого цвета до бледно-розового свидетельствует о расщеплении мочевины.

Посевы на поверхность скошенного агара с мочевиной инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 1) ч. Окрашивание среды в красный цвет происходит при расщеплении мочевины. Отсутствие изменения окраски - отрицательная реакция.

Сальмонеллы мочевину не расщепляют.

2.2.3. Для выявления образования индола проводят посев в одну из питательных сред: 1%-ную пептонную воду по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.3.2 или в триптон-триптофановую среду по ГОСТ 28560. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 1) ч.

В пробирки с суточной культурой в пептонной воде по стенке добавляют 5 - 10 капель одного из реактивов: Эрлиха или Ковача по ГОСТ 28560. В первом случае при наличии индола не позднее чем через 5 мин в пограничном слое образуется ярко-красное кольцо, при отсутствии - кольцо остается светло-желтого цвета. Во втором случае после взбалтывания результаты учитывают через 10 мин: реактив поднимается на поверхность среды и при наличии индола окрашивается в темно-красный цвет.

В пробирку с суточной культурой в триптон-триптофановой среде добавляют 1 см3 реактива Эрлиха или Ковача. Темно-красное кольцо - реакция положительная; коричнево-желтое кольцо - реакция отрицательная.

Сальмонеллы индола не образуют.

2.2.4. Для выявления образования сероводорода используют одну из питательных сред: агар тройной сахарный, или среду Клиглера, или 1%-ную пептонную воду. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 24 - 72 ч.

При посеве культуры в одну из комбинированных сред об образовании сероводорода судят по почернению среды в столбике.

При посеве культуры в 1%-ную пептонную воду в пробирку под пробку помещают полоску фильтровальной бумаги, предварительно смоченную уксуснокислым свинцом и высушенную по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.3.21. Полоска не должна соприкасаться с питательной средой. При выделении культурой сероводорода через 24 - 72 ч инкубирования бумажка с уксуснокислым свинцом чернеет.

Сальмонеллы выделяют сероводород.

2.2.5. Для выявления утилизации цитрата культуру высевают на скошенный столбик агара Симмонса по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.23, инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 1) ч. Окрашивание среды в синий цвет - положительная реакция, отсутствие изменений - отрицательная реакция.

Сальмонеллы, за небольшим исключением, дают положительную реакцию.

2.2.6. Для выявления способности культуры к образованию ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра) засевают ее в среду по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.25. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч, после чего переносят 1 см3 посева в пустую пробирку, добавляют 0,2 см3 раствора гидроокиси калия по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.3.19 и 0,6 см3 раствора по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.3.18 и несколько кристаллов креатина. Пробирки тщательно встряхивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. При наличии ацетилметилкарбинола среда окрашивается в розовый цвет. При отрицательной реакции остаток среды инкубируют еще 24 ч и тест повторяют.

Сальмонеллы имеют отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра.

2.2.7. Для определения расщепления аминокислот культуру высевают методом укола в пробирку со столбиком агаризованной среды с одной из аминокислот по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.27, 2.4.28, инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

При декарбоксилировании лизина появляется темно-красная окраска. При отрицательной реакции окраска желтая. Сальмонеллы декарбоксилируют лизин.

Для теста расщепления фенилаланина культуру высевают на поверхность скошенного агара, инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 1) ч, затем на поверхность среды наносят 3 - 4 капли хлорного железа. Появление зеленой окраски среды - положительная реакция, цвет среды не изменяется - отрицательная реакция. Сальмонеллы дают отрицательную реакцию.

2.3. Для выявления подвижности культуру высевают методом укола в пробирку со столбиком полужидкого агара по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.29. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 1) ч.

О наличии подвижности свидетельствуют диффузный рост вокруг линии укола и помутнение столбика агара.

2.4. Серологические реакции проводят с суточной культурой, выросшей на агаризованной среде по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0, 2.4.1, 2.4.4.

Определяют чистые колонии на способность самоагглютинации и на присутствие O, Vi, H - антигенов сальмонелл.

При этом на предметное стекло помещают каплю физиологического раствора, а рядом каплю одной из антисальмонеллезных сывороток (поливалентную O-сыворотку, отдельных O-групп и другие).

Растирают в капле некоторое количество исследуемой культуры до получения однородной мутной суспензии. Покачивают стекло в течение 30 - 40 с, затем помещают его на темный фон и рассматривают. При агглютинации образуются хлопья, комочки.

Штампы считаются самоагглютинирующими при образовании хлопьев, комочков в капле физиологического раствора, и они серологическому подтверждению не подлежат.

При получении положительной реакции с поливалентной O-сывороткой культуру испытывают с сыворотками к антигенам отдельных O-групп, входящими в поливалентные сыворотки.

Для выявления Vi-антигена исследуемую культуру испытывают с моновалентной Vi-сывороткой; H-антигенов - с моновалентными H-сыворотками.

Для выявления H-антигена в реакции агглютинации следует использовать культуру с нижней, более влажной части скошенного агара, в которой лучше развит H-антиген.

Положительная реакция - агглютинация бактерий, отрицательная реакция - отсутствие агглютинации. Сальмонеллы дают положительную реакцию.

На основании серологических исследований подтверждают или исключают принадлежность выделенной культуры к роду сальмонелл.

3.1. Результаты исследований оценивают по каждой пробе в отдельности.

3.2. К бактериям рода сальмонелл относят те культуры, которые дали типичные биохимические и серологические реакции.

3.3. Результаты исследований записывают следующим образом: сальмонеллы обнаружены или не обнаружены в 25 г продукта или в смыве с продукта с указанием исследуемой площади в квадратных сантиметрах.