ГОСТ 27583-88 Яйца куриные пищевые. Технические условия.
3.1. Аппаратура, материалы, реактивы по ГОСТ 9225 со следующими дополнениями:
сухая плазма кроличья, цитратная;
контрольный штамм Staphylococcus aureus;
мембранные фильтры;
калия теллурит [2], раствор с массовой концентрацией 10 г/дм3;
глицин [1], раствор с массовой концентрацией 200 г/дм3;
кристаллический фиолетовый [6];
натрия пируват [8], раствор с массовой концентрацией 200 г/дм3;
литий хлористый, гексагидрат [4];
триптон;
экстракт дрожжевой [3] или
экстракт дрожжевой, очищенный [7];
экстракт мясной;
фуксин основной [5], спиртовой раствор с массовой концентрацией 50 г/дм3;
яйца куриные пищевые по ГОСТ 27583
витаминный препарат "ЭКД" сухой [11].
3.2. Питательные среды
3.2.1. Гидролизованное и стерильное обезжиренное молоко по ГОСТ 10444.11 (3.3.1 и 3.3.3).
3.2.2. Среды питательные сухие для определения Staphylococcus aureus [9] или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой и питательный агар сухой II, выпускаемые Дагестанским НПО "Питательные среды" [10].
3.2.3. Желточную эмульсию готовят следующим образом.
Свежее куриное яйцо моют водопроводной водой, затем протирают ваткой, смоченной в спирте, и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см3 стерильного раствора хлористого натрия по ГОСТ 9225. Тщательно перемешивают. Приготовленная эмульсия может храниться при температуре 0 - 5 °C не более 72 ч.
--------------------------------
<*> Допускается применение солевого бульона [9], который готовится согласно указанию на этикетке.
Состав: натрий хлористый (NaCl) - 7,5 г;
питательный сухой бульон - 1,5 г;
или гидролизованное молоко - 100 см3.
Приготовление: в 100 см3 дистиллированной воды вносят 1,5 г сухого питательного бульона, кипятят 1 - 2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают pH (6,9 +/- 0,1).
Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение (10 +/- 1) мин.
Или к 100 см3 гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают pH (6,9 +/- 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.
--------------------------------
<**> Допускается использовать солевой агар [9], который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.
Состав: питательный агар <***> для культивирования микроорганизмов (на
основе гидролизата кильки) [10] - 35 г
или питательный агар II <***> (на основе гидролизата кормовых
дрожжей) [10] - 24 г;
натрий хлористый (NaCl) - 75 г;
эмульсия желточная - 50,0 см3;
вода дистиллированная - 1 дм3.
--------------------------------
<***> При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.
Приготовление: в 1 дм3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 75 г хлористого натрия (NaCl), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный тампон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45 +/- 1) °C и добавляют 50 см3 предварительно подготовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.
--------------------------------
<**> Допускается использовать солевой агар [9], который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.
Состав: питательный агар <***> для культивирования микроорганизмов (на
основе гидролизата кильки) [10] - 35 г
или питательный агар II <***> (на основе гидролизата кормовых
дрожжей) [10] - 24,0 г;
натрий хлористый (NaCl) - 75,0 г;
молоко обезжиренное - 100 см3;
вода дистиллированная - 1 дм3.
--------------------------------
<***> При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.
Приготовление: среду готовят, как указано в 3.2.5, но после охлаждения до температуры (45 +/- 1) °C добавляют вместо желточной эмульсии 100 см3 стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.
--------------------------------
<*> Допускается использовать агар Байрд-Паркера [9]. Среда готовится согласно указанию на этикетке.
Состав. Основа среды:
триптон - 10,0 г;
дрожжевой экстракт [3] - 1,0 г;
мясной экстракт - 5,0 г;
литий хлористый, гексагидрат [4] - 5,0 г;
агар - 12,0 - 20,0 г;
вода дистиллированная - 1 дм3.
Раствор пирувата натрия:
пируват натрия [8] - 20,0 г;
вода дистиллированная - 100 см3.
Раствор глицина:
глицин [1] - 20,0 г;
вода дистиллированная - 100,0 см3.
3.2.7.1. Приготовление основы среды: в 1 дм3 дистиллированной воды вносят 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара.
При отсутствии триптона применяют гидролизат казеиновый сухой, а при отсутствии дрожжевого экстракта применяют витаминный препарат "ЭКД" сухой [11].
При отсутствии мясного экстракта, триптона и дрожжевого экстракта вместо дистиллированной воды применяют 1 дм3 мясопептонного бульона или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II [10].
Все компоненты, внесенные в 1 дм3 дистиллированной воды (мясопептонный бульон), нагревают и перемешивают до полного растворения, охлаждают до температуры 50 - 60 °C. Устанавливают pH (7,2 +/- 0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см3 и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.
При использовании сухой среды в 1 дм3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полного растворения, охлаждают до температуры 50 - 60 °C, устанавливают pH (7,2 +/- 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.
Готовую основу среды хранят не более 30 сут при температуре (6 +/- 2) °C.
3.2.7.2. Перед использованием к 90 см3 расплавленной основы среды добавляют асептически стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3 см3 раствора глицина, 5 см3 раствора пирувата натрия; 1 см3 раствора теллурита калия; 5 см3 желточной эмульсии.
Допускается растворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсию готовить в асептических условиях на стерильной дистиллированной воде.
После тщательного перемешивания приготовленную среду разливают в чашки Петри.
Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.
4.1. Приготовление растворов и реактивов
4.1.1. Раствор плазмы кроличьей цитратной готовится согласно инструкции по применению плазмы, прилагаемой к упаковке.
4.1.2. Растворы и реактивы для окраски препаратов готовят по ГОСТ 9225.
4.1.3. Приготовление реактивов для окраски по Граму
В 100 см3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового [6].
К 96 см3 спиртового раствора йодистого калия массовой концентрацией 5 г/дм3 добавляют 2 см3 спиртового раствора основного фуксина [5] массовой концентрацией 50 г/дм3 и 2 см3 спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/дм3.
Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при температуре (45 +/- 5) °C при постоянном помешивании.
4.2. Отбор и подготовка проб по ГОСТ 9225.
5.1. Метод определения количества Staphylococcus aureus с предварительным обогащением
5.1.1.1. Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений по ГОСТ 9225 так, чтобы можно было определить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.
5.1.1.2. Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см3 в пробирки или колбочки с солевым бульоном (3.2.4).
Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:10.
Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч.
5.1.1.3. Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера (3.2.7), желточно-солевой агар или молочно-солевой агар (3.2.5; 3.2.6).
Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч.
5.1.1.4. После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.
На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2 - 4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.
На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2 - 4 мм, слегка выпуклых.
На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1 - 1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1 - 3 мм.
5.1.1.5. С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных колоний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, как указано в 3.2.5, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии.
Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч.
У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.
5.1.1.6. Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus колоний, делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. Затем вносят петлей каплю реактива 1, приготовленного по 4.1.3.1. Смесь распределяют на участке примерно 1 см2, просушивают при температуре (20 +/- 2) °C и фиксируют, медленно пронося предметное стекло над пламенем горелки. На одном стекле можно готовить по шесть - восемь мазков, отделяя их один от другого линиями, проведенными с лицевой стороны стекла.
Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.
После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2, приготовленный по 4.1.3.2 так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5 - 1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму, будут темно-фиолетового цвета, не красящиеся по Граму - красного цвета.
Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.
В пробирку с 0,5 см3 разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк). Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37 +/- 1) °C в течение 3 - 6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.
При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).
Реакцию считают положительной, если:
++++ - сгусток плотный;
+++ - сгусток, имеющий небольшой отсек;
++ - сгусток в виде взвешенного мешочка.
Все три варианта являются положительным результатом.
При получении положительной реакции считают, что в посевах обнаружен Staphylococcus aureus.
5.1.2. Обработка результатов контроля
Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
5.1.3. Оформление результатов контроля
Морфологические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта.
5.2. Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения
5.2.1. Проведение контроля
5.2.1.1. 1 см3 жидкого продукта или его разведения (5.1.1) наносят на поверхность питательных сред (3.2.5 или 3.2.6 или 3.2.7) в 3 чашки Петри, тщательно растирают шпателем по поверхности питательной среды. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх.
5.2.1.2. После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри (5.1.4). С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подозрительных колоний Staphylococcus aureus, а в случае роста менее пяти - все колонии, характерные для Staphylococcus aureus, и пересевают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки, как указано в 3.2.5, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч.
У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика в соответствии с требованиями 5.1.6 и 5.1.7.
5.2.2. Обработка результатов контроля
Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
Если при изучении характерных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост Staphylococcus aureus, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашках Петри (5.1.7), принадлежат к Staphylococcus aureus. В остальных случаях количество Staphylococcus aureus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.
5.2.3. Оформление результатов контроля
Количество колоний Staphylococcus aureus в 1 г или 1 см3 X после определения его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле
, (1)где
n - число десятикратных разведений.
Пример:
Подсчитываем количество колоний Staphylococcus aureus, выросших на трех засеянных чашках при посевах продукта или его разведений:
1 г или 1 см3 продукта - 84 96 72
-1
10 разведение - 9 10 7
(2) -1
10 разведение - 84 96 72
-2
10 разведение - 99 10 7
. (3)(справочное)
БИБЛИОГРАФИЯ
условия
условия
микробиологических целей. Технические
условия
Технические условия
Технические условия
Технические условия
определения Staphylococcus aureus.
Технические условия
микроорганизмов сухой и питательный
агар сухой II, выпускаемые
Дагестанским НПО "Питательные среды"
Вернуться в "Каталог нормативных документов"
Источник информации: https://internet-law.ru/documents/prod/gost_gosudarstvennyj-standart/55/gost_53274.html
На правах рекламы:
|