"ОФС.1.5.3.0017. Общая фармакопейная статья. Определение состава жирных кислот в маслах жирных растительных и жирах"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 N 377)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание")

Метод определения состава жирных кислот в маслах жирных растительных и жирах проводят методом газовой хроматографии (ОФС "Газовая хроматография").

Методика неприменима для масел, содержащих глицериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, циклопропиловыми или циклопропениловыми группами, а также для масел, в составе которых большая часть жирных кислот имеет длину цепи менее восьми атомов углерода, или для масел с кислотным числом более 2,0.

Метиловые эфиры жирных кислот могут быть получены следующими способами, если в фармакопейной статье не приведены иные условия:

1. В колбу вместимостью 50 мл помещают 0,1 - 0,15 мл тщательно перемешанного испытуемого образца, добавляют 1 мл метанола и 0,05 - 0,1 мл ацетилхлорида. Смесь аккуратно перемешивают и нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч. Избыток метанола отгоняют. К остатку прибавляют 0,2 мл гексана (гептана или другого растворителя с соответствующей полярностью) и перемешивают.

2. В колбу вместимостью 50 мл, снабженную пришлифованным обратным холодильником, помещают 0,1 г тщательно перемешанного испытуемого образца, приливают 10 мл метанола. К полученной смеси прибавляют 0,28 г калия гидроксида и нагревают с обратным холодильником на песчаной бане при температуре 105 - 110 °C в течение 1 часа. Смесь охлаждают до комнатной температуры, приливают по каплям 0,5 мл диметилсульфата, нагревают с обратным холодильником на песчаной бане при температуре 105 - 110 °C в течение 30 мин и приливают еще 0,2 мл диметилсульфата. Из полученного раствора отгоняют метанол до объема 2,5 мл. Смесь охлаждают до комнатной температуры, приливают 20 мл воды, переносят в делительную воронку, добавляют 20 мл гексана (гептана или другого растворителя с соответствующей полярностью) и интенсивно встряхивают. Верхний слой отделяют и фильтруют через беззольный фильтр, содержащий 1 г натрия сульфата безводного.

Раствор сравнения А. Готовят 0,5 г смеси веществ, применяемых для калибровки (калибровочной смеси), состава приведенного в таблицах 1, 2 или 3, в соответствии с указаниями в фармакопейной статье. Если в фармакопейной статье не указан определенный раствор, готовят смесь состава, приведенного в таблице 1. Смесь растворяют в гексане (гептане или другом растворителе с соответствующей полярностью) и доводят объем раствора тем же растворителем до 50 мл.

Раствор сравнения Б. Доводят 1,0 мл раствора сравнения А гептаном до 10 мл.

Раствор сравнения В. Готовят 0,5 г смеси метиловых эфиров жирных кислот, которые по составу соответствуют смеси жирных кислот, указанных в фармакопейной статье на испытуемое вещество. Смесь растворяют в гексане (гептане или другом растворителе с соответствующей полярностью) и доводят объем раствора тем же растворителем до 50 мл. Допускается также использование готовых смесей метиловых эфиров жирных кислот.

Если требуется линейный градиент температуры, температуру колонки увеличивают, например, со скоростью 3 °C/мин от 170 до 230 °C.

Пригодности хроматографической системы. Хроматографическая система считается пригодной, если при использовании смеси веществ, используемых для калибровки, приведенных в таблице 1 или таблице 2, выполняются следующие условия:

- разрешение (R_S) между пиками метилолеата и метилстеарата на хроматограмме раствора сравнения А должно быть не менее 1,8;

- отношение сигнал/шум (S/N) для пика метилмиристата на хроматограмме раствора сравнения Б должно быть не менее 5;

- эффективность хроматографической колонки (N), рассчитанная по пику метилстеарата на хроматограмме раствора сравнения А должна быть не менее 30000 теоретических тарелок.

Примечание - при выполнении качественного анализа с использованием калибровочных кривых в калибровочную смесь рекомендуется добавлять компонент испытуемого раствора с максимальным числом атомов углерода в цепи.

Хроматографическая система считается пригодной, если при использовании смеси веществ, применяемых для калибровки, приведенных в таблице 3 выполняются следующие условия:

- разрешение (R_S) между пиками метилкаприлата и метилдеканоата на хроматограмме раствора сравнения А должно быть не менее 4,0;

- отношение сигнал/шум (S/N) для пика метилкапроата на хроматограмме раствора сравнения Б должно быть не менее 5;

- эффективность хроматографической колонки (N), рассчитанная по пику метилдеканоата на хроматограмме раствора сравнения А должна быть не менее 15000 теоретических тарелок.

Примечание - при выполнении качественного анализа с использованием калибровочных кривых в калибровочную смесь рекомендуется добавлять компонент испытуемого раствора с максимальным числом атомов углерода в цепи.

Следует избегать условий хроматографирования, которые могут дать неразделенные пики (наличие компонентов с небольшим различием между временами удерживания, например, линоленовая и арахидоновая кислоты).

Качественный анализ. Идентифицируют пики на хроматограмме раствора сравнения В (изотермические условия хроматографирования или линейный градиент температуры).

При использовании изотермических условий хроматографирования пики могут быть также идентифицированы построением калибровочных кривых с использованием хроматограммы раствора сравнения А и данных таблиц 1, 2 или 3.

На хроматограмме раствора сравнения А измеряют приведенное время удерживания (t'_R) каждого пика.

t'_R - разница между временем удерживания пика растворителя и временем удерживания несорбирующегося (в условиях определения) вещества.

Строят график линейной зависимости:

Lg (t'_R) = f (эквивалент числа атомов углерода в цепи).

Логарифмы t'_R ненасыщенных жирных кислот расположены на этой линии в точках, соответствующих не целым значениям "эквивалента числа атомов углерода в цепи". Эквивалент числа атомов углерода в цепи представляет собой длину теоретической цепи насыщенной жирной кислоты, которая должна была иметь такое же t'_R, как идентифицируемая жирная кислота. Например, у линолевой кислоты такое же t'_R, как у теоретической насыщенной жирной кислоты, имеющей 18,8 атомов углерода.

Идентификацию пиков на хроматограмме испытуемого раствора проводят по прямой линии и уменьшающимся временам удерживания.

Эквиваленты числа атомов углерода в цепи представлены в таблице 4.

Количественный анализ. Используют метод внутренней нормализации. Не учитывают пики, площадь которых составляет менее 0,05% от суммы площадей всех пиков.

В определенных случаях, например, при наличии жирных кислот с 12 или менее атомами углерода, в фармакопейной статье должен быть указан поправочный коэффициент для преобразования площадей пиков в проценты (м/м).

Содержание олеиновой кислоты представляет собой сумму олеиновой кислоты (18:1 n-9) и цис-вакциновой кислоты (18:1 n-7).

Методика неприменима для масел, содержащих глицериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, циклопропиловыми и циклопропениловыми группами или для масел с кислотным числом более 2,0.

Испытуемый раствор. В центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой помещают 0,1 г (точная навеска) испытуемого образца, растворяют в смеси 1 мл гептана (гексана или другом растворителе с соответствующей полярностью) с 1 мл диметилкарбоната, энергично перемешивают и нагревают до температуры 50 +/- 5 °C. Прибавляют к еще теплому раствору 1 мл натрия раствора 1,2% в метаноле и энергично перемешивают в течение 5 мин, прибавляют 3 мл воды и энергично перемешивают в течение 30 с. Смесь центрифугируют 15 мин со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве испытуемого раствора.

Растворы сравнения и анализ данных. Если в фармакопейной статье нет других указаний, поступают, как указано в методике 1.

Методика неприменима для масел, содержащих глицериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, альдегидными, кетоновыми, циклопропиловыми и циклопропениловыми группами и сопряженными полиненасыщенными и ацетиленовыми соединениями из-за частичного или полного разрушения этих групп.

Испытуемый раствор. В коническую колбу вместимостью 25 мл помещают 0,1 г испытуемого образца, растворяют в 2 мл натрия гидроксида раствора в метаноле 2% и кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин. Прибавляют через холодильник 2,0 мл бора фторида в метаноле 14% и кипятят в течение 30 мин, прибавляют через холодильник 4,0 мл гептана и кипятят в течение 5 мин. Смесь охлаждают, прибавляют 10,0 мл натрия хлорида насыщенного раствора, встряхивают в течение 15 с и прибавляют такое количество натрия хлорида насыщенного раствора, чтобы верхний слой поднялся к горлу колбы. Отбирают 2,0 мл верхнего слоя, помещают в делительную воронку, промывают тремя порциями воды, по 2 мл каждая, и сушат полученный экстракт над натрия сульфатом безводным.

Растворы сравнения, хроматографическая методика и анализ данных. Если в фармакопейной статье нет других указаний, поступают, как указано в методике 1.