"ОФС.1.2.2.2.0031. Общая фармакопейная статья. Примеси N-нитрозаминов"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 N 377)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание)

Методики определения примесей N-нитрозаминов в фармацевтических субстанциях синтетического происхождения группы сартана основаны на использовании масс-спектрометрии.

N-нитрозамины - это класс органических веществ, молекулы которых содержат алкилнитрозаминогруппу:

Соединения N-нитрозаминов классифицируются как вероятные канцерогены для человека. В силу потенциальной токсичности этих примесей рекомендуется применять меры по контролю и ограничению их присутствия в фармацевтических субстанциях.

Целесообразность определения примесей N-нитрозаминов в лекарственных препаратах устанавливается на этапе фармацевтической разработки.

Особое значение имеют соединения, приведенные в таблице 1.

Нормы содержания примесей N-нитрозаминов должны быть приведены в фармакопейной статье. В случае их отсутствия нормы содержания должны быть рассчитаны с использованием значений максимально допустимой суточной дозы примесей указанных веществ (табл. 2).

К наиболее вероятным причинам образования примесей N-нитрозаминов в лекарственных средствах относятся:

- использование натрия нитрита или других нитрозирующих соединений в синтезе фармацевтической субстанции.

Например:

- использование загрязненных сырьевых материалов (растворителей, реагентов и катализаторов) в синтезе фармацевтической субстанции;

- регенерация растворителей, реагентов и катализаторов в процессе синтеза;

- использование контаминированных исходных материалов;

- контаминация от перекрестно протекающих процессов синтеза;

- деградация исходных материалов, промежуточных продуктов или лекарственных веществ, в том числе при хранении;

- использование определенных видов упаковки (например, возможна контаминация лекарственного препарата в его первичной упаковке; в контурной ячейковой упаковке (блистере), так как покрывающая фольга, содержащая нитроцеллюлозный праймер, способна реагировать с аминами в чернилах с образованием нитрозаминов, которые могут быть перенесены в препарат при определенных условиях упаковки).

Определение N-нитрозаминов проводят приведенными ниже методиками или иными методиками, указанными в фармакопейной статье.

Методика распространяется на определение семи примесей N-нитрозаминов в валсартане, ирбесартане и лозартане калия: N-нитрозо-диметиламина (НДМА), N-нитрозо-диэтиламина (НДЭА), N-нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА), N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА), N-нитрозо-дибутиламина (НДБА), N-нитрозо-метил-фениламина (НМФА) и N-нитрозо-N-метил-4-аминобутановой кислоты (НМАК).

Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография") с использованием масс-спектрометрии (ОФС "Масс-спектрометрия").

Подвижная фаза А (ПФА). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 10 мл муравьиной кислоты безводной, прибавляют 500 мл воды и доводят объем раствора водой до метки.

Подвижная фаза Б (ПФБ). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 10 мл муравьиной кислоты безводной, прибавляют 500 мл метанола и доводят объем раствора метанолом до метки.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 5 мл помещают 0,1 г (точная навеска) субстанции, прибавляют 4 мл метанола, интенсивно перемешивают до растворения, доводят объем раствора метанолом до метки и фильтруют через шприцевой мембранный фильтр из поливинилиденфторида с размером пор 0,22 мкм, отбрасывая первый 1 мл фильтрата.

Стандартный раствор примесей N-нитрозамина. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДБА, НМАК, НДИПА, НЭИПА и НМФА в метаноле с концентрацией по 6 нг/мл.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДБА, НМАК, НДИПА, НЭИПА, НМФА в метаноле с концентрацией по 1 нг/мл.

Хроматографируют раствор для проверки чувствительности хроматографической системы, стандартный раствор и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений: НДБА - 1,0 (около 14,2 мин); НДМА - около 0,20; НМАК - около 0,31, НДЭА - около 0,46; НЭИПА - около 0,57; НДИПА - около 0,66; НМФА - около 0,67.

На хроматограмме стандартного раствора относительное стандартное отклонение площади каждого из пиков примесей N-нитрозаминов должно быть не более 20,0% (6 введений).

На хроматограмме раствора для проверки чувствительности отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей N-нитрозаминов должно быть не менее 10.

Для количественного определения используются площади пиков целевых ионов с допуском m/z 15 ppm. Ниже перечислены целевые значения m/z:

Примечание - Примеси НМАК и НЭИПА существуют как синконформационный и антиконформационный изомеры из-за ограниченного вращения связи N-N. Эти изомеры в условиях метода разделяются частично. Пик НМАК наблюдается как дублет, для расчета концентрации НМАК интегрируют оба пика и используют суммарную площадь. Пик НЭИПА может быть как дублетом, так и одиночным пиком с хвостовым плечом. Если конформеры разделяются, для расчета концентрации НЭИПА интегрируют оба пика и суммируют их площади, если же конформеры разделены не полностью (наблюдается полупик), для расчета концентрации НЭИПА интегрируют основной пик и полупик как единый.

Содержание каждой из примесей N-нитрозаминов в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:

где S₁ - площадь пика каждой из примесей N-нитрозаминов на хроматограмме испытуемого раствора;

S₀ - площадь пика соответствующей примеси N-нитрозаминов на хроматограмме стандартного раствора;

C₁ - концентрация субстанции в испытуемом растворе, нг/мл;

C₀ - концентрация каждой из примеси НДМА, НДЭА, НДБА, НМАК, НДИПА, НЭИПА и НМФА в стандартном растворе, нг/мл;

P - содержание основного вещества в стандартном образце соответствующей примеси, %.

Методика распространяется на определение четырех примесей N-нитрозаминов в валсартане, ирбесартане, лозартане калия, олмесартане медоксомиле, кандесартане цилексетиле и телмисартане: N-нитрозо-диметиламина (НДМА), N-нитрозо-диэтиламина (НДЭА), нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА) и N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА).

Определение проводят методом ГХ (парофазный анализ, ОФС "Газовая хроматография") с использованием масс-спектрометрии (ОФС "Масс-спектрометрия").

Раствор внутреннего стандарта А. Готовят раствор N-нитрозо-диметиламина-d₆ в метаноле с концентрацией 0,4 мкг/мл.

Раствор внутреннего стандарта Б. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,0 мл раствора внутреннего стандарта А и доводят объем раствора метанолом до метки.

Испытуемый раствор. В хроматографический флакон для парофазного анализа помещают 0,2 г (точная навеска) субстанции, 0,1 г имидазола, 1,0 мл раствора внутреннего стандарта Б и 1,0 мл ацетонитрила. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Стандартный раствор А. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДИПА и НЭИП в метаноле с концентрацией по 0,4 мкг/мл.

Стандартный раствор Б. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,0 мл стандартного раствора А и 2,0 мл раствора внутреннего стандарта А и доводят объем раствора метанолом до метки.

Стандартный раствор В. Помещают 1,0 мл стандартного раствора Б во флакон для парофазного анализа, содержащий 0,1 г имидазола и 1,0 мл ацетонитрила. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы А. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 0,5 мл стандартного раствора А и 2,0 мл раствора внутреннего стандарта А и доводят объем раствора метанолом до метки.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы Б. Во флакон для парофазного анализа, содержащий 0,1 г имидазола и 1,0 мл ацетонитрила, помещают 1,0 мл раствора для проверки чувствительности хроматографической системы А. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Контрольный раствор. В хроматографический флакон помещают около 0,1 г (точная навеска) имидазола, прибавляют 1,0 мл раствора внутреннего стандарта Б и 1,0 мл ацетонитрила. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Хроматографируют контрольный раствор, стандартный раствор В, раствор для проверки чувствительности хроматографической системы Б и испытуемый раствор.

На хроматограмме стандартного раствора В относительное стандартное отклонение отношения площади каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА НЭИПА и НДИПА к площади пика НДМА-d₆ должно быть не более 20% (6 введений).

На хроматограмме раствора для проверки чувствительности отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА НЭИПА и НДИПА должно быть не менее 10.

Содержание каждой из примесей N-нитрозаминов в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:

где B₁ - отношение площади пика каждой из примесей N-нитрозаминов к площади пика N-нитрозо-диметиламина-d₆ на хроматограмме испытуемого раствора;

B₀ - отношение площади пика каждой из примесей N-нитрозаминов к площади пика N-нитрозо-диметиламина-d₆ на хроматограмме стандартного раствора В;

C₁ - концентрация субстанции в испытуемом растворе, нг/мл;

C₀ - концентрация каждой из примеси НДМА, НДЭА, НДИПА и НЭИП в стандартном растворе В, нг/мл;

P - содержание основного вещества в соответствующем образце примеси, %.

Методика распространяется на определение пяти примесей N-нитрозаминов в валсартане, ирбесартане и лозартане калия, кандесартане цилексетиле и олмесартане медоксомиле: N-нитрозо-диметиламина (НДМА), N-нитрозо-диэтиламина (НДЭА), N-нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА), N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА) и N-нитро-N-метил-4-аминобутановой кислоты (НМАК).

Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография") с использованием масс-спектрометрии (ОФС "Масс-спектрометрия")

Подвижная фаза А (ПФА). Муравьиной кислоты раствор 0,1%.

Подвижная фаза Б (ПФБ). Метанол.

Раствор внутреннего стандарта. Готовят раствор НДЭА-d₁₀ в метаноле с концентрацией 9,0 нг/мл.

Испытуемый раствор. Суспендируют 0,150 г (точная навеска) субстанции в 0,5 мл метанола, прибавляют 0,5 мл раствора внутреннего стандарта, тщательно перемешивают, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры, прибавляют 4,0 мл воды, тщательно перемешивают, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 3000 g и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Стандартный раствор примесей N-нитрозаминов. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НМАК, НДИПА и НЭИПА в метаноле с концентрацией по 500 мкг/мл. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 0,3 мл полученного раствора и доводят объем раствора метанолом до метки. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,3 мл полученного раствора и доводят объем раствора метанолом до метки.

Стандартный раствор А. Суспендируют около 0,15 г (точная навеска) субстанции в 0,5 мл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, прибавляют 0,5 мл раствора внутреннего стандарта и тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры, прибавляют 4,0 мл воды, тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 g и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Стандартный раствор Б. Смешивают 0,5 мл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов и 0,5 мл раствора внутреннего стандарта, тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры, прибавляют 4,0 мл воды, тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 g, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Детектирование: трехквадрупольный масс-спектрометр в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Следующие настройки были признаны подходящими и приведены в качестве примера; настройки могут быть скорректированы таким образом, чтобы выполнялись требования пригодности системы.

Хроматографируют стандартный раствор Б, стандартный раствор А, испытуемый раствор.

На хроматограмме стандартного раствора Б относительное стандартное отклонение отношения площади каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НМАК, НДИПА и НЭИПА к площади пика НДЭА-d₁₀ должно быть не более 20% (6 введений).

На хроматограмме стандартного раствора А:

- отношение сигнал/шум (S/N) для пика НДМА, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 5;

- отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДЭА, НМАК, НДИПА, НЭИПА, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 10;

- отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НМАК, НДИПА, НЭИПА, соответствующего переходу классификатора, должно быть не менее 3.

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора (B₁).

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме стандартного раствора А (B₀).

Для каждой обнаруженной примеси N-нитрозамина отношение B₁/B₀ должно быть менее 0,50.

Испытание действительно, если соотношение между площадью пика, соответствующего основному переходу, и площадью пика, соответствующего переходу квалификатора, для испытуемого раствора отличается не более чем на 20% от того же соотношения, рассчитанного для стандартного раствора А.

Методика распространяется на определение шести примесей N-нитрозаминов: N-нитрозо-диметиламина (НДМА), N-нитрозо-диэтиламина (НДЭА), N-нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА), N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА), N-нитрозо-дибутиламина (НДБА) и N-нитрозо-дипропиламина (НДПА).

Определение проводят методом ГХ (ОФС "Газовая хроматография") с использованием масс-спектрометрии (ОФС "Масс-спектрометрия").

Раствор внутреннего стандарта. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 5 мг (точная навеска) НЭМА (N-нитрозо-этилметиламина, 10595-95-6), растворяют в метаноле и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,5 мл полученного раствора и доводят объем раствора водой до метки.

Раствор для экстракции. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 40,0 мг натрия гидроксида, растворяют в 500 мл воды, прибавляют 100 мкл раствора внутреннего стандарта и 50 мл ацетонитрила и доводят объем раствора водой до метки.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,25 г (точная навеска) субстанции, суспендируют в растворе для экстракции и доводят объем раствора тем же растворителем до метки, встряхивают в течение 5 мин, экстрагируют 2 мл метиленхлорида, встряхивая в течение 5 мин и центрифугируя в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор примесей N-нитрозаминов. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА в метаноле с концентрацией по 500 мкг/мл. В мерную колбу 10 мл помещают 100 мкл полученного раствора и доводят объем раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 20 мл помещают 0,3 мл полученного раствора и доводят объем раствора водой до метки.

Испытуемый раствор с добавками. Суспендируют 0,25 г субстанции в 10 мл раствора для экстракции, прибавляют 0,1 мл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют с помощью 2 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор А. К 10 мл раствора для экстракции прибавляют 50 мкл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют 2,0 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор Б. К 10 мл раствора для экстракции прибавляют 100 мкл стандартный раствор примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют 2,0 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор В. К 10 мл раствора для экстракции прибавляют 200 мкл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют 2,0 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Хроматографируют стандартный раствор А, стандартный раствор Б, стандартный раствор В и испытуемый раствор.

На хроматограмме стандартного раствора Б относительное стандартное отклонение отношения площади каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА к площади пика внутреннего стандарта должно быть не более 20% (6 введений).

На хроматограмме испытуемого раствора с добавками:

- отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 10;

- отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА, соответствующего переходу квалификатора, должно быть не менее 3.

Для расчета содержания используют основные MRM-переходы.

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора (B₁).

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора с добавками (B₀).

Для каждой обнаруженной примеси N-нитрозамина отношение B₁/B₀ должно быть менее 0,50.

Испытание действительно, если соотношение между площадью пика, соответствующего основному переходу, и площадью пика, соответствующего квалификационному переходу, для испытуемого раствора отличается не более чем на 20% от того же соотношения, рассчитанного для раствора с добавками.

Для расчета содержания используют основные MRM-переходы.

Хроматографируют по 3 мкл раствора с добавками, испытуемого раствора и стандартных растворов А, Б и В.

Для каждого N-нитрозамина:

- относительное стандартное отклонение отношения площади пика каждого нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме стандартного раствора Б не должно превышать 20% (6 введений);

- отношение сигнал/шум (S/N) для пика, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 10;

- отношение сигнал/шум (S/N) для пика, соответствующего переходу квалификатора, должно быть не менее 3.

Расчет: используют основные MRM-переходы.

Строят калибровочную кривую зависимости отношения площади пика каждого N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта в зависимости от концентрации N-нитрозамина на хроматограммах стандартных растворов А, Б и В. По полученной калибровочной кривой определяют концентрацию N-нитрозамина в испытуемом растворе.

- отношение площади пика, соответствующего основному переходу, к площади пика, соответствующего переходу квалификатора, для испытуемого раствора не должно отличаться от того же отношения для раствора с добавками более чем на 20%;

- рассчитанное извлечение для всех растворов с добавками должно составлять от 70 до 130%.