"ФС.2.3.0001.22. Фармакопейная статья. Хондроитина сульфат натрия"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 11.04.2022 N 246)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание")

Настоящая фармакопейная статья распространяется на хондроитина сульфат натрия [4)-(-D-глюкопиранозилуроновая кислота)--[2-(ацетиламино)-2-дезокси--D-галактопиранозил 4-сульфат]- и [4)-(-D-глюкопиранозилуроновая кислота)--[2-(ацетиламино)-2-дезокси--D-галактопиранозил 6-сульфата]-, натриевая соль, получаемый из сырья животного происхождения и соответствующий требованиям ОФС "Фармацевтические субстанции животного происхождения", и применяемый для производства лекарственных препаратов.

Содержит не менее 95,0% и не более 105,0% хондроитина сульфата натрия в пересчете на сухое вещество.

Описание. Белый или белый с желтоватым оттенком порошок.

<*> Гигроскопичен.

Растворимость. Легко растворим в воде, практически нерастворим в ацетоне и этаноле 96%.

ИК-спектрометрия. Инфракрасный спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом, в области от 4000 до 400 см^-1 по положению полос поглощения должен соответствовать спектру стандартного образца хондроитина сульфата натрия. В соответствии с требованиями ОФС "Спектрометрия в инфракрасной области".

Электрофорез. На электрофореграмме испытуемого раствора, полученной для определения родственных примесей, положение основной зоны должно совпадать с положением основной зоны на электрофореграмме раствора стандартного образца хондроитина сульфата натрия.

Субстанция должна давать реакцию А на натрий. В соответствии с требованиями ОФС "Общие реакции на подлинность".

Удельное вращение. От -20 до -30 в пересчете на сухое вещество (5% раствор). В соответствии с требованиями ОФС "Поляриметрия".

Характеристическая вязкость. От 0,01 м³/кг до 0,15 м³/кг в пересчете на сухое вещество. В соответствии с требованиями ОФС "Вязкость".

Натрия хлорида раствора 1,17%. 11,7 г натрия хлорида помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в 950 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Испытуемый раствор А. Около 5 г (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 80 мл натрия хлорида раствора 1,17% в течение 30 мин, интенсивно перемешивая, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, отбрасывая первые 10 мл.

Испытуемые растворы Б, В и Г готовят после проверки времени истечения испытуемого раствора А.

Испытуемый раствор Б. К 15,0 мл испытуемого раствора А прибавляют 5,0 мл натрия хлорида раствора 1,17%.

Испытуемый раствор В. К 10,0 мл испытуемого раствора А прибавляют 10,0 мл натрия хлорида раствора 1,17%.

Испытуемый раствор Г. К 5,0 мл испытуемого раствора А прибавляют 15,0 мл натрия хлорида раствора 1,17%.

Время истечения натрия хлорида раствора 1,17% (t₀) и время истечения испытуемых растворов (t_А, t_Б, t_В, t_Г) определяют при температуре (25 +/- 0,1) °C. Измерение проводят на капиллярном вискозиметре Уббелоде с висячим уровнем, номинальным значением К около 0,005 мм²/с², диапазон измерения вязкости от 1 до 5 мм²/с. Один и тот же вискозиметр используют для всех испытания, проводя измерения времени истечения не менее трех раз для каждого испытуемого раствора. Испытание считается достоверным, если отношение времени истечения испытуемого раствора А к времени истечения натрия хлорида раствора 1,17% составляет 1,6 - 1,8. В случае невыполнения данного требования, измеряют концентрацию испытуемого раствора А и повторяют испытание.

Относительную вязкость (, , , ) вычисляют по формуле:

где: t_i - время истечения соответствующего раствора (t_А, t_Б, t_В, t_Г), с;

t₀ - время истечения натрия хлорида раствора 1,17%, с;

B - коррекционный фактор кинетической энергии для капилляра (30800 с³).

Концентрацию хондроитина сульфата натрия в испытуемом растворе А в кг/м³ (C_А) вычисляют по формуле:

где: a_А - навеска субстанции в испытуемом растворе А, г;

X - содержание хондроитина сульфата натрия в субстанции, полученное при количественном определении, %;

W - потеря в массе при высушивании, %.

Концентрацию хондроитина сульфата натрия в испытуемом растворе Б в кг/м (C_Б) вычисляют по формуле:

Концентрацию хондроитина сульфата натрия в испытуемом растворе В в кг/м (C_В) вычисляют по формуле:

Концентрацию хондроитина сульфата натрия в испытуемом растворе Г в кг/м (C_Г) вычисляют по формуле:

Относительную вязкость для каждого испытуемого раствора (, , , ) вычисляют по формуле:

где - относительная вязкость (, , , ).

Для расчета характеристической вязкости строят зависимость приведенной вязкости от концентрации (C_i) и экстраполируют приведенную вязкость к нулевой концентрации.

<**> Прозрачность раствора. 10% раствор субстанции должен быть прозрачным или выдерживать сравнение с эталоном I. В соответствии с требованиями ОФС "Прозрачность и степень мутности жидкостей".

<**> Цветность раствора. 10% раствора субстанции должен выдерживать сравнение с эталоном Y₆. В соответствии с требованиями ОФС "Степень окраски жидкостей".

pH. От 5,5 до 7,5 (5% раствор). В соответствии с требованиями ОФС "Ионометрия", метод 3.

Родственные примеси. Определение проводят методом электрофореза в соответствии с требованиями ОФС "Электрофорез".

Испытуемый раствор. Около 0,75 г (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 20 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Раствор стандартного образца (СО) хондроитина сульфат натрия. Около 0,06 г (точная навеска) СО хондроитина сульфата растворяют в 2,0 мл воды и перемешивают.

Раствор сравнения А. 1,0 мл раствора СО хондроитина сульфата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Раствор сравнения Б. 5,0 мл раствора СО хондроитина сульфата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Растворы используют свежеприготовленными.

Раствор А. 225 мл 0,1 М бария ацетата буферного раствора pH 5,0 помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объем раствора спиртом 96% до метки и перемешивают.

Раствор Б. 175 мл 0,1 М бария ацетата буферного раствора pH 5,0 помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объем раствора спиртом 96% до метки и перемешивают.

Окрашивающий раствор. 0,2 г толуидинового синего и 0,4 г натрия хлорида помещают в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводят объем раствора 0,01 М раствором хлористоводородной кислоты до метки, перемешивают и фильтруют.

Срок годности раствора не более 30 сут при хранении в холодном месте.

Агарозный гель. 0,5 г агарозы для электрофореза помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл воды и перемешивают. Колбу нагревают на водяной бане, периодически взбалтывая, до получения прозрачного раствора. Полученный раствор охлаждают до температуре 60 °C, заливают в гелевую рамку размером 125 x 75 мм и высотой 4 - 5 см, с одной стороны геля сразу помещают гребенку из оргстекла на 10 зубцов. Через 10 мин после начала полимеризации выдерживают гель, не вынимая гребенку, при температуре 4 °C в течение 10 мин, после чего вынимают гребенку из геля.

Проверка пригодности электрофоретической системы. Система считается пригодной, если выполняются следующие условия:

- на электрофореграмме раствора сравнения Б должна отчетливо проявляться основная зона;

- на электрофореграмме раствора сравнения А должна отчетливо проявляться основная зона по положению, совпадающая с зоной на электрофореграмме СО хондроитина сульфата натрия.

Агарозный гель выдерживают в течение 1 мин в 0,1 М бария ацетата буферного раствора pH 5,0, осторожно удаляют избыток жидкости с геля фильтровальной бумагой и сушат на воздухе в течение 5 мин. В лунки геля вносят по 1 мкл испытуемого раствора, стандартного раствора СО хондроитина сульфата натрия, раствора сравнения А и раствора сравнения Б. Гель помещают в камеру с 1,0 М бария ацетата буферного раствора pH 5,0 и проводят электрофорез. Гель вынимают, осторожно сливают с него жидкости, сушат на воздухе в течение 5 мин, затем помещают гель на 2 мин в раствор А и проводят электрофорез в течение 20 мин. Гель снова вынимают, осторожно сливают с него жидкости, сушат на воздухе в течение 5 мин, затем помещают гель на 2 мин в раствор Б и проводят электрофорез в течение 20 мин.

Гель проявляют в окрашивающем растворе в течение 10 мин, после чего отмывают проточной водой в течение 15 мин до проявления зоны раствора сравнения Б, затем подсушивают на воздухе.

На электрофореграмме испытуемого раствора основная зона по положению должна совпадать с положением зоны хондроитина сульфата натрия на электрофореграмме стандартного раствора СО хондроитина сульфата натрия; любая другая зона должна быть не интенсивнее зоны, соответствующей раствору сравнения А (не более 2,0%).

Результаты считаются достоверными, если выполняются требования проверки пригодности электрофоретической системы.

- любой единичной примеси должно быть не более 2%.

Белок. Не более 3,0% в пересчете на сухое вещество. В соответствии с требованиями ОФС "Определение белка", метод 2 А.

Раствор стандартного образца (СО) бычьего сывороточного альбумина. Около 50 мг (точная навеска) СО бычьего сывороточного альбумина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 0,01 М растворе натрия гидроксида, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают (около 1 мг/мл).

Раствор СО бычьего сывороточного альбумина А. 5,0 мл раствора (точная навеска) СО бычьего сывороточного альбумина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора 0,01 М раствором натрия гидроксида до метки и перемешивают (около 0,1 мг/мл).

Раствор СО бычьего сывороточного альбумина Б. 4,0 мл раствора (точная навеска) СО бычьего сывороточного альбумина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора 0,01 М раствором натрия гидроксида до метки и перемешивают (около 0,08 мг/мл).

Раствор СО бычьего сывороточного альбумина В. 3,0 мл раствора (точная навеска) СО бычьего сывороточного альбумина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора 0,01 М раствором натрия гидроксида до метки и перемешивают (около 0,06 мг/мл).

Раствор СО бычьего сывороточного альбумина Г. 2,0 мл раствора (точная навеска) СО бычьего сывороточного альбумина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора 0,01 М раствором натрия гидроксида до метки и перемешивают (около 0,04 мг/мл).

Раствор СО бычьего сывороточного альбумина Д. 1,0 мл раствора (точная навеска) СО бычьего сывороточного альбумина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора 0,01 М раствором натрия гидроксида до метки и перемешивают (около 0,02 мг/мл).

Растворы используют свежеприготовленными.

Около 100 мг (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 0,01 М раствором натрия гидроксида, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают (испытуемый раствор).

Испытания проводят в соответствии с требованиями ОФС "Определение белка", метод 2 А, в качестве контрольного раствора используют 0,01 М раствор натрия гидроксида.

Расчет содержания белка проводят по калибровочному графику зависимости оптической плотности от содержания белка в мг в 1 мл соответствующего раствора СО бычьего сывороточного альбумина. Параллельно измеряют оптическую плотность испытуемого раствора.

Содержание белка в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:

где: C - содержание белка в 1 мл испытуемого раствора, найденное по калибровочному графику, мг;

a - навеска субстанции, мг;

P - содержание основного вещества в СО бычьего сывороточного альбумина, %;

W - потеря в массе при высушивании, %.

Потеря в массе при высушивании. Не более 10,0%. Около 1,0 г (точная навеска) субстанции сушат при 100 - 105 °C до постоянной массы. В соответствии с требованиями ОФС "Потеря в массе при высушивании", способ 1.

Азот. От 2,0 до 3,5% в пересчете на сухое вещество. В соответствии с требованиями ОФС "Определение азота в органических соединениях методом Къельдаля" (из навески 0,1 г).

Сера. Не более 7,5%. В соответствии с требованиями ОФС "Метод сжигания в колбе с кислородом" (из навески 0,05 г).

Сульфаты. Не более 0,25%. Около 0,1 г (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 25,0 мл, растворяют в 20 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. 10,0 мл полученного раствора должны выдерживать испытания на сульфаты. В соответствии с требованиями ОФС "Сульфаты", метод 1.

Хлориды. Не более 0,5%. Около 0,1 г (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 250,0 мл, растворяют в 100 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. 10,0 мл полученного раствора должны выдерживать испытания на хлориды. В соответствии с требованиями ОФС "Хлориды".

Сульфатная зола. Не более 30%. В соответствии с требованиями ОФС "Сульфатная зола". Для определения используют около 0,5 г (точная навеска) субстанции.

Тяжелые металлы. Не более 0,002%. Определение проводят в соответствии с требованиями ОФС "Тяжелые металлы" в зольном остатке, полученном после сжигания 0,5 г субстанции (ОФС "Сульфатная зола").

Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС "Остаточные органические растворители".

<**> Бактериальные эндотоксины. Не более 1,75 ЕЭ/мг хондроитина сульфата натрия в пересчете на сухое вещество. В соответствии с требованиями ОФС "Бактериальные эндотоксины".

Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной. В соответствии с требованиями ОФС "Аномальная токсичность". Тест-доза - 30 мг хондроитина сульфата натрия в пересчете на сухое вещество в 0,5 мл воды для инъекций на мышь, внутривенно. Срок наблюдения 48 ч.

Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями ОФС "Микробиологическая чистота".

Количественное определение. Определение проводят методом титриметрии.

Раствор СО хондроитина сульфата натрия А. Около 100 мг (точная навеска) СО хондроитина сульфата натрия, предварительно высушенного при 100 - 105 °C в течение 4 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Раствор СО хондроитина сульфата натрия Б. 5,0 раствора СО хондроитина сульфата натрия А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Раствор титранта. 1,0 г цетилпиридиния хлорида моногидрата помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в 500 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Растворы используют свежеприготовленными.

Около 100 мг (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают (испытуемый раствор А).

5,0 мл испытуемого раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (испытуемый раствор Б).

50,0 мл раствора СО хондроитина сульфата натрия Б и 50,0 мл испытуемого раствора Б титруют раствором титранта. Определение конечной точки титрования проводят с использованием автотитранта, снабженного фототроном, при одной из длин волн; 420 нм, 550 нм, 555 нм или 660 нм.

Содержание хондроитина сульфата натрия в пересчете на сухое вещество в процентах (X) вычисляют по формуле:

где: V₀ - объем раствора титранта, пошедшего на титрование раствора СО хондроитина сульфата натрия, мл;

V - объем раствора титранта, пошедшего на титрование испытуемого раствора Б, мл;

a₀ - навеска СО хондроитина сульфата натрия, мг;

a - навеска субстанции, мг;

P - содержание основного вещества в СО хондроитина сульфата натрия, %;

W - потеря в массе при высушивании, %.

Хранение. В соответствии с требованиями ОФС "Хранение лекарственных средств".

--------------------------------

<*> Приводится для информации.

<**> Проводят для субстанции, предназначенной для производства лекарственных форм для парентерального применения.