"ОФС.1.7.2.0026.15. Общая фармакопейная статья. Определение белкового азота с реактивом Несслера с предварительным осаждением белкового материала в биологических лекарственных препаратах"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II")

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения белкового азота в биологических лекарственных препаратах (БЛП). Метод основан на свойстве реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония, образующимися после минерализации белковых продуктов.

Для количественного определения содержания белкового азота используются колориметрические методы:

- метод с предварительным осаждением белковых компонентов с использованием трихлоруксусной кислоты (ТХУ), рекомендуемый для определения белкового азота в вирусных вакцинах, анатоксинах и инфекционных аллергенах (методы A и B).

- метод с предварительным осаждением белковых компонентов с использованием фосфорновольфрамовой кислоты, рекомендуемый для определения белкового азота в неинфекционных аллергенах.

В центрифужную пробирку вместимостью 10 мл вносят необходимое количество испытуемого образца (A), прибавляют раствор ТХУ до конечной концентрации 10% и перемешивают (табл.).

Пробу оставляют на 18 - 20 ч при температуре 4 - 8 °C. Образовавшийся осадок отделяют от надосадочной жидкости центрифугированием при 2000 об/мин при температуре 4 - 6 °C в течение 30 мин. Далее осадок промывают 1 мл 10% раствора ТХУ и вновь центрифугируют в аналогичных условиях. К осадку прибавляют 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Пробирку закрывают стеклянным колпачком и минерализуют на песочной бане при температуре 190 - 210 °C. Одновременно в аналогичных условиях минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Для ускорения минерализации используют водорода пероксид, который периодически добавляют по 1 - 2 капли в предварительно охлажденную пробирку. Минерализацию продолжают не менее 10 ч до обесцвечивания содержимого пробирки. К полученному минерализату добавляют 9,9 мл воды очищенной и перемешивают.

В химическую пробирку вносят необходимое количество минерализата (B) (табл.), содержащего 8 - 20 мкг азота, доводят объем раствора до 9,5 мл водой очищенной, перемешивают, прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают.

Измеряют оптическую плотность испытуемого и калибровочных растворов при 400 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, приготовленным аналогичным образом из контрольной пробы.

Одновременно с испытуемым образцом для подтверждения правильности методики проводят анализ стандартного образца (СО) "Содержание белкового азота". Анализ проводят при каждом определении.

Построение калибровочного графика. В химические пробирки вносят 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 мл стандартного раствора N 2 (0,05 мг/мл аммония сульфата), доводят объем растворов водой очищенной до 9,5 мл, перемешивают (содержание азота 5; 10; 15; 20; 25 мкг соответственно), прибавляют по 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Измеряют оптическую плотность, как указано выше. В качестве контрольного раствора используют 9,5 мл воды очищенной и 0,5 мл реактива Несслера. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество белкового азота (мкг), а по оси ординат - среднее значение оптической плотности.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Содержание белкового азота (X, мг/мл) вычисляют по формуле:

где: a - количество азота, рассчитанное по калибровочному графику, мкг;

A - объем анализируемого образца, мл;

B - объем минерализата, мл;

1000 - перевод мкг в мг;

10 - разведение минерализата.

Содержание белка по белковому азоту (Y, мг/мл) вычисляют по формуле:

где: X - содержание белкового азота, мг/мл;

6,25 - коэффициент пересчета белкового азота на белок.

Содержание белкового азота, полученное по методу A, должно составлять от 0,01 до 0,4 мг/мл.

Примечания

Испытуемый раствор. 1, 2, 3 или 5 мл раствора испытуемого образца (согласно Таблице 1) (содержание белкового азота в анализируемой пробе должно быть 0,08 - 0,4 мг).

Основной стандартный раствор аммония сульфата 0,1 мг/мл (раствор N 1). В мерной колбе вместимостью 500 мл в воде очищенной растворяют 0,2357 г аммония сульфата, доведенного до постоянной массы в эксикаторе над безводным кальция хлоридом, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Основной раствор хранят при температуре 4 - 8 °C в колбе с притертой пробкой в течение 1 года.

Стандартный раствор аммония сульфата 0,05 мг/мл (раствор N 2). В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 50 мл раствора N 1, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4 - 8 °C в колбе с притертой пробкой в течение 3 мес.

Стандартный образец (СО) "Содержание белкового азота".

Приготовление 80% раствора ТХУ. Растворяют 150 г ТХУ в 100 мл воды очищенной. После этого 1 мл раствора титруют 1 М раствором натрия гидроксида (индикатор - фенолфталеин).

Концентрацию ТХУ (X) в % в анализируемом растворе вычисляют по формуле:

где: a - количество 1 М раствора натрия гидроксида, израсходованное на титрование испытуемого образца, мл;

0,1634 - количество ТХУ, соответствующее 1 мл 1 М раствора натрия гидроксида, г.

Концентрация ТХУ должна быть 80 - 90%.

Раствор ТХУ разводят до концентрации 80% и хранят в емкости из темного стекла в течение 6 мес. (растворы ТХУ меньших концентраций готовят соответствующим разведением 80% раствора). Перед каждым использованием раствора ТХУ проводят проверочное определение ее процентной концентрации.

В центрифужную пробирку емкостью 10 мл вносят 5 мл испытуемого образца, прибавляют 0,72 мл 80% раствора ТХУ и перемешивают. Далее проводят минерализацию испытуемого образца по методу A. Одновременно в аналогичных условиях минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Объем минерализата доводят до 5 мл водой очищенной и перемешивают. Отбирают в пробирку 1 мл полученного раствора, доводят объем раствора водой очищенной до 9,5 мл, перемешивают, прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Измеряют оптическую плотность испытуемого и калибровочных растворов при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной слоя 20 мм по сравнению с контрольным раствором, приготовленным аналогичным образом из контрольной пробы.

Содержание белкового азота (X) в мг/мл вычисляют по формуле:

где: a - количество азота, рассчитанное по калибровочному графику, мкг;

5^а - разведение минерализата, мл;

5^б - объем испытуемого образца, взятый на минерализацию, мл;

1 - объем минерализата, взятый на колориметрирование, мл;

1000 - перевод в миллиграммы.

Построение калибровочного графика. В химические пробирки вносят 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл стандартного раствора N 3 (содержание белкового азота 2; 4; 6; 8; 10; 12 мкг соответственно), доводят объем раствора водой очищенной до 9,5 мл, перемешивают, прибавляют по 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. В качестве контрольного раствора используют 9,5 мл воды очищенной и 0,5 мл реактива Несслера. Измеряют оптическую плотность растворов, как указано выше. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество белкового азота (мкг), а по оси ординат - среднее значение оптической плотности.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Содержание белкового азота, полученное по методу B, должно составлять от 2,5 до 10 мкг/мл.

Примечания

Основной стандартный раствор аммония сульфата 0,1 мг/мл (раствор N 1). Приготовление указано в методе A.

Стандартный раствор аммония сульфата 0,02 мг/мл (раствор N 3). В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 20 мл раствора N 1, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4 - 8 °C в колбе с притертой пробкой в течение 3 мес.

Приготовление 80% раствор ТХУ. Приготовление указано в методе A.

Определение проводят по ОФС "Определение белка" (метод В) с использованием фосфорновольфрамовой кислоты.

Содержание белкового азота в неинфекционных аллергенах должно быть от 0,01 до 0,4 мг/мл.

Построение калибровочного графика аналогично изложенному в методе A.

Одновременно с испытуемым образцом для подтверждения правильности методики проводят анализ стандартного образца (СО) "Содержание белкового азота в неинфекционных аллергенах". Анализ проводят при каждом определении.

Примечание

Стандартный образец (СО) "Содержание белкового азота в неинфекционных аллергенах". Определение проводят в соответствии с инструкцией по применению.