"ОФС.1.7.2.0031.15. Общая фармакопейная статья. Испытание на присутствие микоплазм"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II")

Настоящая общая фармакопейная статья описывает испытание на присутствие микоплазм посевных (исходных) клеток, клеточных культур мастер банка, рабочих банков, производственных и контрольных клеточных культур, посевного и рабочего вирусных банков, вирусных сборов, готового лекарственного препарата до розлива, готовой лекарственной формы препарата, которые согласно нормативной документации не должны содержать микоплазм. Кроме этого, испытанию на присутствие микоплазм подлежат клеточные культуры, используемые в лечебной практике, а также вспомогательные материалы (трипсин, сыворотка крови животных и др.).

Испытание на присутствие микоплазм проводят при соблюдении всех правил асептики, в условиях, не оказывающих влияния на выявляемые микроорганизмы и исключающих контаминацию испытуемого образца.

Испытание на присутствие микоплазм проводят следующими методами: микробиологическим (культуральным) - посев на питательные среды для выделения и культивирования микоплазм, и методом индикаторной клеточной культуры (цитохимическим) с использованием флюоресцирующего красителя ДНК.

Испытание посевных (исходных) клеток, клеточных культур мастер банка, рабочих банков, производственных и контрольных клеточных культур проводят двумя методами - микробиологическим и методом индикаторной клеточной культуры.

Испытание посевного и рабочего вирусных банков, вирусного сбора, готового препарата до розлива и готовой формы препарата на присутствие микоплазм проводят микробиологическим методом.

Для выявления ДНК Mycoplasma species (spp) может быть использован альтернативный метод - метод полимеразной цепной реакции при условии проведения соответствующей валидации.

Микробиологический (культуральный) метод испытания на присутствие микоплазм может быть выполнен по следующим схемам:

Схема 1 - прямой посев испытуемого образца на полужидкую питательную среду для выделения и культивирования микоплазм, содержащую 0,3% агара (среда Каган полужидкая), с последующим инкубированием посевов при температуре (37 +/- 1) °C в течение 14 сут.

Схема 2 - посев испытуемого образца в жидкую питательную среду для выделения и культивирования микоплазм (среда Каган жидкая), предварительное инкубирование в течение 5 - 7 сут при температуре (37 +/- 1) °C с последующим посевом на полужидкую питательную среду, содержащую 0,3% агара и инкубирование в течение 14 сут при температуре (37 +/- 1) °C.

Учет результатов при проведении испытаний по обеим схемам проводят путем визуального просмотра засеянных пробирок.

Для проведения испытания на присутствие микоплазм используют полужидкую питательную среду для выделения и культивирования микоплазм, содержащую 0,3% агара (среда Каган полужидкая).

Жидкую питательную среду для выделения и культивирования микоплазм (среда Каган жидкая) используют как вспомогательную для накопления микоплазм.

Для подтверждения наличия микоплазм используют плотную питательную среду, содержащую 1,3% агара (среда Каган плотная).

Все среды Каган для выделения и культивирования микоплазм готовят на одной основе - среде Каган жидкой, в состав которой входят:

Значение pH готовой среды после стерилизации (7,8 +/- 0,1).

Для приготовления полужидкой среды, содержащей 0,3% агара, вносят 3,0 г агара микробиологического на 1,0 л среды. Для приготовления плотной среды, содержащей 1,3% агара, вносят 13,0 г агара микробиологического на 1,0 л среды.

Приготовление питательных сред. Смешивают гидролизат бычьего сердца, мясной экстракт (или мясную воду), экстракт хлебопекарных дрожжей, натрия хлорид и воду очищенную. Для приготовления полужидкой или плотной среды дополнительно вносят 3,0 г или 13,0 г агара соответственно. Доводят pH среды до (8,1 +/- 0,1) 10% раствором натрия гидроксида. Среду нагревают до кипения, кипятят 2 - 3 мин и при необходимости фильтруют. С помощью 5% раствора хлористоводородной кислоты устанавливают pH (7,8 +/- 0,1).

Среды разливают во флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 110 °C в течение 30 мин. Готовые среды хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 4 мес.

Стерильность питательных сред. Каждая партия питательной среды должна быть проверена на стерильность. Образцы сред в количестве определенном в соответствии с ОФС 1.1.0004.15 "Отбор проб" инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C и (22,5 +/- 2,5) °C в течение не менее 14 сут. Рост микроорганизмов должен отсутствовать.

Подготовка сред для проведения испытания.

Перед применением полужидкую среду, содержащую 0,3% агара, и плотную среду, содержащую 1,3% агара, нагревают на водяной бане до полного расплавления и охлаждают до температуры 40 - 45 °C. Добавляют 15 - 20% нормальной сыворотки крови лошади без консерванта, предварительно отконтролированной на стерильность и отсутствие контаминации микоплазмами.

Во все готовые питательные среды вносят стерильный раствор аргинина до конечной концентрации 1% и стерильный раствор глюкозы до конечной концентрации 1%. В жидкую среду Каган вносят 5,0 мл (0,6 г/л) стерильного раствора фенолового красного в качестве индикатора роста микоплазм.

Готовую жидкую и полужидкую питательные среды разливают по 10 мл в пробирки, плотную питательную среду разливают в чашки Петри (диаметр 90 мм) по 15 - 20 мл и хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 7 сут.

При проведении испытания на присутствие микоплазм возможно использование альтернативных питательных сред при условии подтверждения их соответствия требованиям по ростовым свойствам в отношении соответствующих штаммов.

Каждую партию приготовленной полужидкой питательной среды, предназначенной для проведения испытания на присутствие микоплазм, проверяют на ростовые свойства, используя Отраслевой стандартный образец тест-штамма Mycoplasma arginini G230 (ОСО) в соответствии с инструкцией по применению.

Среду считают чувствительной и признают годной для использования, если не позднее 7 сут инкубации, визуально обнаруживают рост стандартного образца тест-штамма M. arginini G230 при посеве 10 - 100 КОЕ (разведение 10^-1, 10^-6.)

Для проверки ростовых свойств, в зависимости от типа испытуемого препарата, также можно использовать другие виды микоплазм, полученные из музейных коллекций: M. orale, M. fermentans, M. gallisepticum, M. hyorhinis, M. synoviae, M. pneumoniae, Acholeplasma laidlawii.

Для правильной оценки проводимого испытания на присутствие микоплазм однократно определяют наличие ингибирующего действия для каждого испытуемого материала. Определение ингибирующего действия может быть проведено одновременно с определением ростовых свойств питательной среды.

При проведении испытания по схеме 1 в 3 - 4 пробирки с 10,0 мл полужидкой питательной среды, содержащей 0,3% агара, вносят 0,5 мл испытуемого образца и 10 - 100 КОЕ тест-штамма M. arginini G230 (разведение 10^-7, 10^-6). Посевы инкубируют в течение 7 сут при температуре (37 +/- 1) °C.

При проведении испытания по схеме 2 в 100,0 мл жидкой питательной среды вносят 10,0 мл испытуемого образца и 10 - 100 КОЕ тест-штамма M. arginini G230, инкубируют в течение 5 - 7 сут и далее высевают по 0,5 - 1,0 мл на полужидкую среду, содержащую 0,3% агара. Посевы инкубируют в течение 7 сут при температуре (37 +/- 1) °C.

В качестве положительного контроля, в зависимости от применяемой схемы, вносят 10 - 100 КОЕ тест-штамма M. arginini G230.

В качестве отрицательного контроля одновременно инкубируют образцы питательных сред.

Учет результатов проводят визуально в прямом проходящем свете, сравнивая рост тест-штамма M. arginini G230 в положительном контроле и в посевах испытуемого материала. Если в посевах испытуемого материала рост микоплазм визуально сравним с ростом в посевах положительного контроля, делают вывод о том, что препарат в условиях испытания не обладает ингибирующим (антимикробным) действием. В этом случае испытание проводят стандартными методами.

Если в посевах положительного контроля наблюдают рост микоплазм, а в посевах испытуемого материала рост отсутствует или значительно слабее, считают, что испытуемый материал обладает ингибирующим (антимикробным) действием, которое следует устранить.

Обнаружение микоплазм микробиологическим методом состоит из следующих этапов:

1. Испытуемый образец вносят по 0,5 мл в каждую из 10 пробирок с полужидкой питательной средой, содержащей 0,3% агара (среда Каган полужидкая). Допускается использование свежеприготовленной полужидкой питательной среды с температурой 36 - 38 °C. Посев производят прокалыванием всего столбика питательной среды концом пипетки, выпуская равномерно ее содержимое при продвижении пипетки в толще среды от дна к ее поверхности.

2. Посевы инкубируют в течение 14 сут при температуре (37 +/- 1) °C.

3. При проведении испытания на присутствие микоплазм в качестве положительного контроля может быть использован тест-штамм M. arginini G230 в количестве 10 - 100 КОЕ или один из тест-штаммов, использованных при оценке ростовых свойств.

Испытанию подлежат образцы, вызывающие помутнение питательной среды, обладающие ингибирующим действием, а также сыворотки крови животных, трипсин и другие вспомогательные материалы.

Методика включает посев испытуемого образца в жидкую питательную среду (среда Каган жидкая) для накопления микоплазм, предварительное инкубирование в течение 5 - 7 сут с последующим посевом в полужидкую питательную среду, содержащую 0,3% агара и инкубирование в течение 14 сут.

Обнаружение микоплазм микробиологическим методом с предварительным инкубированием состоит из следующих этапов:

1. Вносят 10,0 мл испытуемого образца в 100 мл жидкой питательной среды, инкубируют в течение 5 - 7 сут при температуре (37 +/- 1) °C.

При испытании сыворотки крови животных вносят 100 мл испытуемого образца в 300 мл жидкой питательной среды, смесь инкубируют в течение 5 - 7 сут при температуре (37 +/- 1) °C. В случае испытания ограниченного количества материала (сыворотки крови приматов, человека и др.) используют меньшее количество испытуемого образца, сохраняя указанное соотношение.

2. Проводят посев на 5 - 7 сут от начала испытания. Вносят по 0,5 - 1,0 мл смеси в каждую из 10 пробирок с полужидкой средой, содержащей 0,3% агара.

3. Инкубируют в течение 14 сут при температуре (37 +/- 1) °C.

4. При проведении испытания в качестве положительного контроля может быть использован тест-штамм M. arginini G230 в количестве 10 - 100 КОЕ или один из тест-штаммов, использованных при оценке ростовых свойств среды.

5. В качестве отрицательного контроля одновременно инкубируют образцы всех используемых питательных сред.

Учет результатов испытания по обеим схемам проводят путем визуального просмотра засеянных пробирок в прямом проходящем свете на уровне глаз при достаточной освещенности на 3, 7, 10 и 14 сут, сравнивая посевы с отрицательными контрольными образцами. На 14 сут проводят окончательный учет результатов.

На полужидкой среде наличие роста микоплазм оценивают по обнаружению в зоне посева колоний микоплазм в виде беловатых полупрозрачных округлых образований, зернистости, тонкой паутинки или светлых облачков.

Рост микоплазм на жидкой питательной среде характеризуется незначительным помутнением и опалесценцией питательной среды.

При необходимости, для подтверждения наличия микоплазм используют плотную питательную среду, содержащую 1,3% агара (среда Каган плотная). Посев производят на чашки Петри по 0,5 - 1,0 мл из жидкой среды или зоны роста на полужидкой среде и инкубируют в течение не более 7 - 8 сут при температуре (37 +/- 1) °C. Учет результатов на плотной питательной среде проводят путем исследования засеянных чашек Петри в световом микроскопе при увеличении ок.10^x, об.20^x или ок.10^x, об.40^x.

Рост микоплазм на плотной питательной среде характеризуется формированием характерных колоний 0,1 - 0,3 мм в диаметре, в форме "яичницы-глазуньи", как правило, с плотным приподнятым центром и ажурной периферией или равномерно зернистые.

При отсутствии характерного роста микоплазм на питательных средах считают, что контаминация микоплазмами не обнаружена и испытуемый образец удовлетворяет требованиям испытания.

Обнаружение характерного роста микоплазм на питательных средах свидетельствует о контаминации испытуемого образца микоплазмами и образец считается не соответствующим требованиям испытания.

Испытание считается недействительным, если обнаружен нетипичный, вызывающий сомнения рост микоплазм или обнаружен рост посторонних микроорганизмов в отрицательном контроле или ростовые свойства питательной среды неудовлетворительны, а также при отсутствии роста микоплазм в положительном контроле или, напротив, при обнаружении роста микоплазм в отрицательном контроле. В случае признания испытания недействительным проводят повторные испытания.

Обнаружение в клеточных культурах труднокультивируемых на питательных средах видов микоплазм может проводиться цитохимическим экспресс-методом, основанным на способности флюорохромов связываться и окрашивать ДНК микоплазм и клеток. Получение клеточного монослоя на стекле, фиксирование, окрашивание клеток специфическим флюоресцирующим красителем Hoechst-33258 (Bisbenzimide), ДАР I или аналогичным и микроскопирование в люминесцентном микроскопе позволяют получать результаты исследования немедленно или на 3 - 5 сутки испытания.

Метод обнаружения микоплазм с использованием индикаторной клеточной культуры (клеточная культура Vero) основан на внесении испытуемого образца в клеточную культуру, получение клеточного монослоя на стекле, фиксирование, окрашивание специфическим флюоресцирующим красителем ДНК и микроскопирование в люминесцентном микроскопе. В качестве индикаторной может быть использована производственная клеточная культура или другая клеточная культура чувствительная к микоплазмам. Выбранная индикаторная клеточная культура считается подходящей, если позволяет обнаруживать 10 - 100 КОЕ микроорганизмов тест-штамма M. arginini G230 или M. orale, M. hyorhinis, A. laidlawii. Культивирование индикаторной клеточной культуры проводится без использования антибиотиков.

Испытание клеточных культур адаптированных к суспензионному культивированию, вирусных штаммов, вирусных сборов, и других вирусных суспензий на присутствие микоплазм проводят с использованием индикаторной клеточной культуры, как правило, после нейтрализации вируса специфической иммунной сывороткой, не обладающей ингибирующим действием в отношении микоплазм. Также может быть использована клеточная культура не чувствительная к размножению вируса.

Испытание на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры проводят в асептических условиях, выполняя следующие операции.

1. В стерильную чашку Петри (диаметр 90 мм) помещают предварительно подготовленное предметное стекло и вносят 20 - 23 мл суспензии клеточной культуры Vero в питательной среде Игла МЕМ или ДМЕМ в концентрации не более 10⁵ кл/мл и добавляют не более 5% сыворотки крови плодов коровы, предварительно прошедшей контроль на стерильность и отсутствие контаминации микоплазмами.

2. Вносят 1,0 мл испытуемого образца в чашку Петри с клеточной суспензией культуры Vero и инкубируют в течение 3 - 5 сут при температуре (36 +/- 1) °C в атмосфере с (5,0 +/- 0,5)% CO₂ до формирования 50 - 70% монослоя. Образование монослоя наблюдают в световом микроскопе при увеличении ок.10^x, об.20^x.

3. По достижении 50 - 70% клеточного монослоя культуральную жидкость сливают, осторожно промывают стекло фосфатным буферным раствором (pH 7,2 - 7,4), используя не менее 100 мл.

4. Помещают предметное стекло на 30 - 35 мин в 96° этиловый спирт.

5. Спирт сливают и сушат предметное стекло с клеточным монослоем на воздухе.

6. Окрашивают предметное стекло с клеточным монослоем рабочим раствором красителя Hoechst-33258 в защищенном от света месте при температуре (36 +/- 1) °C в течение 30 - 35 мин.

7. Краситель сливают, предметное стекло с монослоем промывают стерильной водой очищенной, используя не менее 100 мл, подсушивают на воздухе и просматривают в люминесцентном микроскопе.

Учет результатов испытания на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры (цитохимическим методом) проводят путем исследования приготовленных на стекле препаратов в люминесцентном микроскопе. Микоплазмы преимущественно выявляются по границам клеток и в межклеточном пространстве в виде мелкой ярко светящейся зернистости на фоне темной, не имеющей свечения цитоплазмы. Микроскопически микоплазмы выглядят как однородно окрашенные тела сферической формы диаметром 0,1 - 0,3 мкм, в виде парных, цепочечных, нитевидных образований с яркой зеленоватой флюоресценцией.

При учете результатов положительными контрольными образцами могут служить готовые контрольные препараты или контаминированные микоплазмами культуры клеток, а отрицательными - клеточные культуры, в которых микоплазмы не выявлены или готовые контрольные препараты. Сравнительные исследования микроскопической картины испытуемого образца с микроскопическими картинами положительного и отрицательного контроля позволяют идентифицировать флюоресценцию микоплазм - контаминантов испытуемого материала.

При отсутствии характерной для микоплазм флюоресценции считают, что контаминация микоплазмами не обнаружена и испытуемый образец удовлетворяет требованиям испытания.

Обнаружение характерной для микоплазм флюоресценции свидетельствует о контаминации испытуемого образца микоплазмами и образец считается не соответствующим требованиям испытания.

Результаты испытания будут считаться недостоверными, если в образцах положительного контроля микоплазмы не обнаружены, а обнаружены в отрицательном контроле. В случае получения сомнительных результатов следует проводить повторные испытания.

Примечания

1. Приготовление красителя Hoechst-33258 (Bisbenzimide)

А. Приготовление концентрированного раствора. В 100 мл стерильной воды очищенной растворяют 5,0 мг красителя. Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 °C не более 1 года.

Б. Приготовление основного раствора. К 100 мл стерильной воды очищенной добавляют 0,5 мл концентрированного раствора красителя и перемешивают. Раствор готовят перед использованием.

В. Приготовление рабочего раствора. Основной раствор красителя смешивают с раствором Хенкса без индикатора в соотношении 1:9 и немедленно используют для окраски испытуемых образцов. Рабочий раствор хранению не подлежит.

2. Подготовка люминесцентного микроскопа.

Проводят подготовку люминесцентного микроскопа к работе согласно Руководству по эксплуатации. Просматривают препараты в люминесцентном микроскопе при увеличении ок.10^x, об.90^x (масляная иммерсия) или об.70^x/85^x (водная иммерсия).

3. Подготовка предметных стекол. Предметные стекла промывают в проточной водопроводной воде в течение 10 - 15 мин, затем кипятят 5 - 7 мин в воде очищенной, протирают стерильной салфеткой и помещают на 1 сут в смесь Никифорова (смесь равных объемов 96° этилового спирта и эфира для наркоза). Стекла извлекают из смеси Никифорова с помощью пинцета, протирают стерильной салфеткой и стерилизуют в течение (30 +/- 2) мин при температуре (120 +/- 2) °C.