"ОФС.1.2.4.0001.15. Общая фармакопейная статья. Биологические испытания инсулина"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I")

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на следующие лекарственные средства: генно-инженерные препараты человеческого инсулина и его аналоги, а также стандартные образцы для этих препаратов.

Биологические испытания основаны на способности инсулина человеческого и его аналогов снижать уровень глюкозы в крови животных и включают:

- определение биологической активности инсулина и его аналогов (показатель "Биологическая активность");

- определение биоидентичности (показатель "Подлинность. Биоидентичность");

- определение пролонгированного действия (показатель "Пролонгированное действие").

Показатель "Биологическая активность" отражает гипогликемическое действие инсулина и его аналогов. Метод, в соответствии с которым выполняют данный показатель, позволяет количественно определить уровень глюкозы в крови животных. Определение биологической активности является обязательным для оценки качества препаратов человеческого инсулина, его аналогов и стандартных образцов при регистрации, изучении стабильности, отработке новых производственных технологий и аттестации стандартных образцов.

Показатель "Биоидентичность" представляет собой упрощенный вариант метода определения биологической активности инсулина и его аналогов и является полуколичественным. Данный тест применяют для подтверждения подлинности препарата с использованием меньшего количества животных, чем при определении биологической активности. Применение показателя "Биоидентичность" возможно только для препаратов инсулина и его аналогов, обращающихся на фармацевтическом рынке не менее пяти лет с момента введения в медицинскую практику, если за этот период отсутствовали претензии к качеству данных препаратов.

Испытания по показателям "Биологическая активность" и "Биоидентичность" основаны на сопоставлении гипогликемического действия испытуемого образца (ИО) с гипогликемическим действием стандартного образца (СО) инсулина или соответствующих СО его аналогов.

"Пролонгированное действие" - показатель качества, который характеризует продолжительность гипогликемического эффекта ИО инсулина и его аналогов во времени.

Испытания по показателям "Биологическая активность" и "Биоидентичность" проводят на кроликах и мышах, содержащихся на стандартном рационе с соблюдением санитарных правил вивария. В опытах используют по две дозы (малую и большую) рабочих растворов ИО и СО, которые вводят подкожно в холку. Эти дозы подбирают в зависимости от чувствительности животных, рекомендуемое соотношение доз 1:2.

При биологических испытаниях инсулина и его аналогов допускается многократное использование животных. После проведенного испытания кроликов можно использовать не ранее чем через 3 недели, а мышей - через 7 дней.

Биологическую активность субстанций инсулина, его лекарственных форм и аналогов определяют одним из 2 методов по снижению концентрации глюкозы в крови:

- кроликов (метод A);

- мышей (метод B).

Испытания проводят на кроликах породы Шиншилла массой не менее 2,5 кг, которых рандомизируют на 4 группы, не менее 6 животных в каждой. За 18 - 20 ч до эксперимента животных лишают корма, а перед началом испытания убирают воду.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов ИО и СО готовят по два рабочих раствора (примечание 1 и 2). Рекомендуемые концентрации рабочих растворов ИО и СО - 1,0 и 2,0 МЕ/мл, если в частных статьях не указаны иные концентрации.

Каждая группа животных получает рабочие растворы ИО и СО в порядке, предусмотренном схемой двойного перекреста (Таблица). Первой и второй группе животных подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,5 мл на животное (дозы малая - s₁ большая - s₂), а третьей и четвертой группе - такой же объем рабочих растворов ИО (малая - u₁ и большая - u₂ доза). Вторую постановку теста ("перекрест") проводят не ранее чем через неделю после первой.

Взятие крови осуществляют трижды: непосредственно перед введением испытуемых растворов и через 1 и 2,5 ч после инъекций СО и ИО. Пробы крови из краевой вены уха, примерно по 50 мкл, отбирают в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл, содержащие 10 мкл раствора гепарина (5000 МЕ/мл). Концентрацию глюкозы в крови животных определяют согласно разделу 4. Из опыта исключают животных, которые отвечают судорогами на введение инсулина и тех, у которых снижение концентрации глюкозы в крови составляет менее 15% по отношению к исходному уровню.

При вычислении биологической активности в качестве ответа кролика принимают:

- сумму двух концентраций глюкозы в крови через 1 ч и 2,5 ч после инъекции

или

- среднюю величину, на которую снижается концентрация глюкозы в крови в пробах, полученных после введения рабочего раствора СО и ИО инсулина у каждого животного и выражают ее в процентах по отношению к исходной.

Результаты опыта обрабатывают согласно ОФС "Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами", подраздел 3.6 "Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом A и B)".

В опыт берут не менее 40 мышей одного пола массой не менее 20,0 г. Животных рандомизируют по массе на 4 группы не менее 10 животных в каждой.

Внутри группы каждую особь нумеруют по порядку. Во время опыта животным должен быть обеспечен свободный доступ к корму и воде.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИО готовят по два рабочих раствора (Примечания 1, 2). Рекомендуемые концентрации рабочих растворов, например для самок, могут находиться в диапазоне 0,06 - 3,0 МЕ/мл. При испытании некоторых аналогов инсулина возможно использование более низких концентраций рабочий растворов. Например, 0,03 - 0,06 МЕ/мл.

Согласно схеме двойного перекреста (Таблица), мышам первой и второй группы подкожно в холку вводят по 0,1 мл/10 г массы тела животного рабочие растворы СО, а третьей и четвертой - такие же объемы рабочих растворов ИО. Рабочие растворы последовательно вводят каждому животному, в соответствии с нумерацией, через каждые 15 - 20 с. Интервал между введениями рабочих растворов каждой группе животных должен составлять 1 - 2 мин.

Вторую постановку теста (перекрест) проводят через 24 ч после первой.

После инъекции инсулина через 40 +/- 1 мин последовательно в соответствии с номером каждого животного внутри группы из орбитального венозного синуса глаза с помощью стерильного гепаринизированного капилляра берут около 50 мкл крови в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл. Необходимо соблюдать те же временные интервалы, что и при введении растворов. Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

Результаты опыта обрабатывают согласно ОФС "Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами", подраздел 3.6 "Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом A и B)".

Испытание и обработку результатов проводят так же как в подразделах 2.1.1. и 2.1.2 со следующими изменениями:

1. В опыт берут 8 кроликов по 2 в каждой группе (метод A) или 24 мыши по 6 в каждой группе (метод B).

2. Не вычисляют доверительные границы величины биологической активности.

Метод является полуколичественным. Препарат считают прошедшим испытание, если его биологическая активность составляет не менее 56% от ожидаемой.

В опыт берут не менее 18 кроликов одного пола, массой не менее 2,5 кг. Животных рандомизируют по массе на 2 равные группы. За 18 - 20 ч до испытания кроликов лишают корма, оставляя свободный доступ к воде.

Одной группе животных подкожно вводят основной раствор СО, а другой - неразведенный ИО (Примечание 1). Концентрация СО должна быть равна концентрации неразведенного препарата.

Рекомендуемый диапазон доз составляет 0,5 - 0,8 МЕ/кг. Вводимые объемы рассчитывают, исходя из выбранной дозы, массы животного и количества МЕ в образце инсулина/аналога. Например, если, выбрана доза 0,5 МЕ/кг, а масса кролика 3,0 кг, то животному необходимо ввести 1,5 МЕ инсулина, в объеме, который рассчитывается следующим образом. Для инсулина с активностью 100 МЕ в 1 мл (1000 мкл), вводимый объем составляет (1000 мкл/100 МЕ) x 0,5 МЕ/кг x 3,0 кг = 15 мкл. Подобным образом рассчитывают объем, который вводят кролику с учетом массы и активности препарата.

Взятие крови проводят непосредственно перед инъекцией, а также через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 ч после нее. Процедура взятия крови описана в разделе 2.1.1. (метод A). Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

За контрольную временную точку принимают момент времени, в котором через 4,5 - 6 ч после инъекции средняя концентрация глюкозы в крови животных, получивших основной раствор СО, приблизится к 100 +/- 15% от исходного уровня. В этой точке для каждого кролика рассчитывают индивидуальную концентрацию глюкозы в крови в процентах относительно исходного уровня для данного животного.

Лекарственное средство считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке у животных, получивших его, средняя относительная концентрация глюкозы в крови, рассчитанная из индивидуальных концентраций, достоверно ниже, чем у животных, получивших основной раствор СО. Достоверность различия проверяют с помощью критерия Стьюдента при доверительной вероятности P = 0,95.

Результаты опыта обрабатывают согласно ОФС "Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами", подраздел 3.8 "Обработка результатов испытания на пролонгированное (удлиненное) действие лекарственных препаратов инсулина и его аналогов".

Для определения концентрации глюкозы в плазме кроликов и мышей рекомендуется применять глюкозооксидазный метод с использованием многоканального фотоэлектроколориметра.

После каждого взятия крови пробы центрифугируют в течение 5 мин при температуре 5 °C и при величине относительного центробежного ускорения (ОЦУ), равной 1500 g (Примечание 3). От каждой пробы отбирают, например, по 10 мкл плазмы и переносят в микрокювету плоскодонного 96-луночного планшета, который можно хранить при температуре от 6 до 8 °C до окончания испытания.

Перед определением концентрации глюкозы в каждую микрокювету с плазмой добавляют по 240 мкл готового энзимо-хромогенного набора, например, реактива "GLUCOSE Liquicolor" или аналогичного. Планшеты инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C не менее 20 мин.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 492 нм. В качестве раствора сравнения используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (100 мг %), входящий в состав готового энзимо-хромогенного набора.

Концентрацию глюкозы (c) в крови рассчитывают по формуле:

A - оптическая плотность пробы;

A₀ - оптическая плотность глюкозы в растворе сравнения.

Примечание 1

Приготовление основных растворов СО и ИО инсулина или его аналога.

Навеску СО инсулина растворяют в 0,2 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты до полного растворения субстанции, а затем добавляют растворитель для получения раствора с концентрацией инсулина 100 МЕ/мл. В качестве растворителя используют 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной, разведенной в 33,3 раза раствором натрия хлорида 0,9% для инъекций.

Основной раствор следует хранить при температуре от 2 до 8 °C. Замораживание не допускается. Раствор должен быть прозрачным.

При определении биологической активности субстанции инсулина основной раствор готовят таким же образом, что и основной раствор СО. Разведение субстанции проводят, исходя из величины биологической активности инсулина с учетом фактического содержания влаги.

Применение других растворителей возможно, при наличии указания на их использование в нормативной документации на аналоги инсулина. Основные и рабочие растворы аналогов инсулина готовят, как указано, если в нормативной документации на препарат, не указаны иные концентрации и условия.

Примечание 2

Приготовление рабочих растворов ИО и СО. Рабочие растворы, для получения требуемых концентраций СО и ИО, готовят из основных растворов непосредственно перед испытанием, добавляя соответствующие объемы того же растворителя, который был использован для приготовления основных растворов СО и ИО.

При определении биологической активности в лекарственных препаратах инсулина, представляющих суспензию, ИО осторожно взбалтывают и отбирают 1,0 мл, к которому для полного растворения суспензии добавляют 0,2 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты. В случае, если исходная концентрация ИО равна 100 МЕ/мл, то полученный раствор будет иметь концентрацию 83,3 МЕ/мл. В дальнейшем раствор используют для приготовления рабочих растворов ИО.

Примечание 3

Расчет скорости вращения ротора центрифуги.

Величина ОЦУ зависит от радиуса ротора центрифуги и скорости его вращения. Скорость вращения v (об/мин) ротора для обеспечения необходимой величины ОЦУ (в данном случае 1500 g) вычисляют по следующей формуле:

r - радиус ротора центрифуги;

11,18·10^-6 - константа