"ОФС.1.7.2.0040.18. Общая фармакопейная статья. Определение специфической (аллергенной) активности аллергенов и аллергоидов методом кожных проб"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II")

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на определение специфической (аллергенной) активности аллергенов и аллергоидов методом кожных проб и кандидатов в стандартные образцы (СО) активности аллергенов.

Метод основан на способности кожи человека, сенсибилизированного к определенному аллергену, реагировать на введение этого аллергена развитием местной аллергической реакции немедленного типа (волдырь, гиперемия - накожные пробы) или замедленного типа (папула, гиперемия - внутрикожные пробы).

Кожные пробы проводятся согласно программе проведения исследований на ограниченной группе лиц врачами-аллергологами в аллергологическом кабинете или аллергологическом отделении больницы.

При оценки специфической активности препаратов формируют основную и контрольную группы лиц в возрасте от 18 до 60 лет.

Основная группа - пациенты, чувствительные к исследуемому аллергену (пациенты с аллергологическими заболеваниями различной этиологии в стадии ремиссии).

Основную группу формируют с учетом анамнестических данных и клинических проявлений заболевания, а также по предварительным результатам кожного тестирования:

- оценка специфической активности аллергенов (5 - 10 чел.) - пациенты, имеющие повышенную чувствительность к тестируемому аллергену (от "+" до "++++");

- оценка специфической активности и остаточной аллергенности аллергоидов (5 - 10 чел.) - пациенты, имеющие повышенную чувствительность к одноименному аллергену (не менее "+++" или "++++");

Контрольная группа (5 чел.) - практические здоровые лица или лица, не имеющие повышенной чувствительности к оцениваемому аллергену.

Испытуемая серия препарата аллергена.

Отрицательный контроль:

- тест-контрольная жидкость <*> - фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий фенол, при оценке специфической активности аллергена;

- разводящая жидкость <*> - фосфатно-солевой буферный раствор - при оценке специфической активности аллергоидов.

Положительный контроль - 0,01% раствор гистамина <**>.

- Препарат сравнения - одноименный аллерген при оценке специфической активности аллергоида.

- Стерильные одноразовые скарификаторы.

- Стерильные одноразовые инъекционные иглы.

- Шприцы одноразовые вместимостью 1 или 2 мл.

- Спирт этиловый 70%.

- Вата медицинская гигроскопическая.

Примечания

<*> - выпускаются в комплекте с препаратом;

<**> - приготовление 0,1% раствора гистамина: к 0,01 г гистамина дигидрохлорида добавляют 10 мл воды для инъекций и перемешивают (раствор годен в течение 1 года при температуре 2 - 8 °C).

<***> - приготовление 0,01% раствора гистамина: к 1 части 0,1% раствора гистамина дигидрохлорида добавляют 9 частей 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций и перемешивают (раствор годен в течение 6 час с момента приготовления).

Кожные пробы с препаратами аллергенов, отрицательным и положительным контролем ставят на внутренней поверхности предплечья, отступив на 5 см от лучезапястного сустава.

При накожном тестировании аллергены и аллергоиды применяют в номинальной концентрации. Препараты аллергенов, отрицательный и положительный контроли набирают в маркированные стерильные шприцы вместимостью 1 или 2 мл и наносят по 1-ой капле (примерно по 0,1 мл испытуемой и контрольных проб) на расстоянии 30 - 40 мм друг от друга. Для каждой пробы используют отдельную иглу, ланцет или скарификатор.

Кожные пробы с аллергоидом проводят одновременно с одноименным аллергеном в равнозначных концентрациях.

Прик-тест/тест-уколом - через капли нанесенных образцов (испытуемой и контрольных проб) производят укол в кожу на глубину 1,0 - 1,5 мм (инъекционными иглами, укороченными или с ограничением глубины укола, или иглами для прик-теста (ланцетами)). При использовании инъекционных игл прокалывают кожу под углом 45° так, чтобы не выступила кровь; затем иглу вынимают, слегка приподнимая кожу.

Скарификация - через капли нанесенных образцов (испытуемой и контрольных проб) проводят параллельно две царапины длиной 5 мм с расстоянием 1 - 2 мм между ними (стерильными скарификаторами или инъекционными иглами).

Проводится оценка специфической активности грибковых и бактериальных аллергенов. Концентрация аллергена должна быть не более 1250 PNU/мл.

Аллерген, отрицательный и положительный контроли набирают в маркированные туберкулиновые стерильные шприцы <**> и вводят внутрикожно по 0,02 мл на расстоянии 40 - 50 мм друг от друга. При этом, кожу растягивают и вводят иглу под углом 45° срезом вниз. Срез иглы должен полностью погрузиться в кожу. После введения 0,02 мл препарата и контролей должна образоваться папула диаметром 1 - 3 мм.

Примечание

<**> из шприца необходимо удалять пузырьки воздуха, т.к. появление волдыря при внутрикожном введении можно принять за положительную реакцию; нарушение техники проведения внутрикожных проб, например, внутрикожное введение более 0,02 мл раствора, приводит к развитию ложноположительных реакций.

Кожную реакцию учитывают через 20 мин. Полученные результаты каждого измерения интерпретируют согласно схеме, приведенной ниже (табл. 1).

Результаты учитывают через 20 мин и 24 ч, измеряя размеры инфильтрата (папулы) и гиперемии в мм. Результаты регистрируют согласно прилагаемым табл. 2 и 3.

Реакция кожи на гистамин (положительный контроль) должна быть положительной, при отрицательной реакции - результаты кожных проб у испытуемого лица не учитывают.

Реакция кожи на тест-контрольную и разводящую жидкости должна быть отрицательной, при положительной реакции - результаты кожных проб у испытуемого лица не учитывают.

Препараты аллергенов будут считаться специфически активными, при выявлении положительных кожных проб не менее чем у 3-х из 5-ти обследованных лиц основной группы. В контрольной группе на испытуемый препарат не должно быть зарегистрировано ни одной положительной реакции.

При регистрации положительных реакций у меньшего количества лиц основной группы проводят постановку кожных проб дополнительно еще на 5 пациентах. Положительные реакции должны быть выявлены не менее, чем у 5 из 10 лиц основной группы.

Препараты не будут считаться специфически активными, если положительные кожные реакции зарегистрированы менее, чем у 5-ти из 10-ти лиц основной группы или, если выявлена хотя бы одна положительная кожная реакция у лиц контрольной группы.

Аллергенная активность аллергоидов будет считаться сниженной, когда в условиях одномоментной постановки с одноименным аллергеном при равнозначной концентрации по белковому азоту будут зарегистрированы кожные реакции не менее, чем у 3 из 5 или у 5 из 10 обследованных лиц с выраженностью реакции в 1,5 и более раза меньше по размеру волдыря, чем на одноименный аллерген.

В случае, когда зарегистрирована отрицательная кожная реакция на аллергоид, за величину, характеризующую снижение аллергенности последнего, принимают количественное выражение размера волдыря на аллерген (например, если размер волдыря на аллерген равен 3 мм, то остаточная аллергенность аллергоида снижена в 3 раза).

Для кандидатов в СО отбираются серии аллергенного экстракта или готового препарата в виде водно-солевого раствора. Кандидаты в СО должны быть стерильны и нетоксичны, охарактеризованы по содержанию белкового азота, при этом исходная концентрация кандидата в СО не должна превышать 16000 PNU/мл.

Примечание

<***> СО предназначены для определения аллергенной активности, методами конкурентного иммуноанализа с использованием аллергенспецифических IgE-антител. Аллергенную активность первой серии СО определяют методом кожных проб, последующей - методом конкурентного иммуноанализа в сравнении с предыдущей серией или Международным стандартным образцом (МСО).

Аллергенную активность кандидатов в СО определяют прик-тестом согласно требованиям к проведению кожных проб, изложенным выше. Кандидат в СО аллергена тестируется не менее, чем в 3-х разведениях у каждого пациента. Одновременно должны быть проведены пробы с отрицательным и положительным контролем.

Основная группа (10 чел.) - пациенты, у которых выраженность кожной реакции на одноименный аллерген соответствует размеру волдыря - 7 - 9 мм.

Контрольная группа (5 чел.) - практические здоровые лица или лица, не имеющие повышенной чувствительности к оцениваемому аллергену.

Кожную реакцию (прик-тест) учитывают через 20 мин., измеряя ортогональные (максимальный и минимальный) диаметры (D). Полученные значения суммируют и делят на 2. Вычисляют среднее арифметическое и коэффициент вариации для каждого их 3-х разведений аллергена (N = 10).

С помощью программы MS Excel или другой подходящей программы, позволяющей вычислять R² и уравнение, строят график зависимости выраженности реакции (диаметра волдыря) от выбранных разведений аллергена в логарифмах. Восстанавливают перпендикуляр до пересечения с графиком из точки со значением D равным 8 мм (ось Y); затем опускают перпендикуляр на ось X (логарифм разведений) и определяют соответствующее разведение аллергена (рисунок). Конкретное значение разведения вычисляют с помощью уравнения, описывающего график, где "y = 8".

Аллергенную активность препарата выражают в единицах аллергенной активности (ЕАА). В качестве активности 100 000 ЕАА принимается значение то разведение аллергена, которое вызывает развитие кожной реакции у сенсибилизированных лиц (основная группа) в виде волдыря размером 8 мм.

1. См. "п. Критерии приемлемости кожных проб".

2. Коэффициент вариации (CV) - не более 20%, коэффициент детерминации или величина достоверности аппроксимации (R²) - не менее 0,95.