"ОФС.1.2.4.0017.18. Общая фармакопейная статья. Определение специфической активности препаратов эритропоэтина"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I")

Настоящая общая фармакопейная статья определяет основные требования к методике определения специфической активности препаратов рекомбинантного эритропоэтина с использованием нормоцитемических мышей и распространяется на субстанции и лекарственные формы эритропоэтина.

Биологический метод определения специфической активности в условиях in vivo основан на способности эритропоэтина стимулировать эритропоэз у нормоцитемических мышей. Активность препарата сравнивают с активностью стандартного образца (СО) эритропоэтина и выражают в международных единицах (МЕ). Рассчитанная специфическая активность должна быть от 80 до 125% от заявленной активности, доверительный интервал (P = 0,95) в диапазоне от 64 до 156%. Специфическую активность и доверительный интервал рассчитывают методом параллельных линий с помощью программного обеспечения.

В качестве СО эритропоэтина может быть использован международный стандартный образец для количественного определения специфической активности, стандартный образец Европейской Фармакопеи, а также СО, откалиброванный в Международных единицах (МЕ).

Испытания проводят с использованием мышей линий B6D2F1, F1(CBA*C57BL) или линии Balb/c весом от 18 - 24 г. Использование беспородных мышей не позволяет получить необходимую точность результатов испытания.

Мышей предварительно взвешивают, если совокупность экспериментальных объектов однородна (разница не более, чем +/- 0,5 г), их распределение в группы проводят случайным образом, животных распределяют в 6 клеток, по 8 особей в каждую. Если разница более, чем +/- 0,5 г, но не более +/- 2 г, животных вначале распределяют на группы, с колебаниями массы тела не более +/- 0,5 г, помещая каждую группу в отдельную клетку. Затем из каждой весовой группы по одному животному помещают в одну из 6 клеток (по количеству вводимых растворов), пока в клетке не будет 8 особей. Животным в каждой из 6 клеток наносят определенную метку (пикриновой кислотой или выстриганием шерсти) в зависимости от дозы (табл. 1).

Примечания:

Приготовление разведений стандартных и испытуемых образцов проводят в соответствии со следующей процедурой или в соответствии с указаниями, приведенными в нормативной документации. Готовят разведения стандартных и испытуемых образцов 80, 40 и 20 МЕ/мл.

Испытуемый раствор (a). Испытуемый препарат разводят фосфатно-альбуминовым забуференным физиологическим раствором pH 7,2 (1) до концентрации 80 МЕ/мл (ориентируясь на данные, указанные в сертификате анализа).

Испытуемый раствор (b). Смешивают равные объемы испытуемого раствора (a) и фосфатно-альбуминового забуференного физиологического раствора pH 7,2 (1) до получения концентрации 40 МЕ/мл.

Испытуемый раствор (c). Смешивают равные объемы испытуемого раствора (b) и фосфатно-альбуминового забуференного физиологического раствора pH 7,2 (1) до получения концентрации 20 МЕ/мл.

Стандартный раствор (a). Стандартный образец эритропоэтина восстанавливают в соответствии с инструкцией по применению, разводят в фосфатно-альбуминовом забуференном физиологическом растворе pH 7,2 (1) до получения концентрации 80 МЕ/мл.

Стандартный раствор (b). Смешивают равные объемы стандартного раствора (a) и фосфатно-альбуминового забуференного физиологического раствора pH 7,2 (1) до получения концентрации 40 МЕ/мл.

Стандартный раствор (c). Смешивают равные объемы стандартного раствора (b) и фосфатно-альбуминового забуференного физиологического раствора pH 7,2 (1) до получения концентрации 20 МЕ/мл.

Каждому животному в одной из 6 клеток подкожно вводят по 0,5 мл одной дозы (одно из разведений испытуемого препарата или стандартного образца). Затем животных распределяют в 8 новых клеток по одному животному с определенной дозой. Таким образом, в каждой клетке должны содержаться мыши, получившие все шесть растворов (3 испытуемых и 3 стандартных).

Отбор крови у лабораторных животных

Через 96 ч после введения препаратов у животных из ретроорбитального синуса отбирают образцы крови (200 - 300 мкл) в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой дикалиевой или трикалиевой соли и определяют количество ретикулоцитов методом проточной цитофлуориметрии.

Учет результатов испытания с помощью проточного цитофлуориметра

Образцы крови окрашивают флуоресцентным красителем, например, 5 мкМ раствором акридинового оранжевого, в соотношении 1:500 (1000 мкл 5 мкМ раствора акридинового оранжевого и 2 мкл отобранной крови). Пробирки помещают в проточный цитофлуориметр и проводят подсчет ретикулоцитов.

Примечания:

Приготовление 0,001 М раствора акридинового оранжевого (флуоресцентный краситель). 3,7 мг акридинового оранжевого вносят в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в 0,9% растворе натрия хлорида, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 °C в течение 6 мес.

Приготовление 5 мкМ раствора акридинового оранжевого (флуоресцентный краситель). 0,5 мл 0,001 М раствора акридинового оранжевого вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки 0,9% раствором натрия хлорида и перемешивают. Используют только свежеприготовленный раствор. Раствор используют свежеприготовленным, непосредственно перед использованием.

Процедура разведения образцов, используемые дозы и флуоресцентный краситель могут быть изменены, о чем должно быть указано в нормативной документации.