"ОФС.1.2.4.0014.18. Общая фармакопейная статья. Биологические испытания гонадотропинов"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I")

Настоящая общая фармакопейная статья определяет требования к биологическим методам испытания препаратов гонадотропных гормонов природного происхождения и рекомбинантные гонадотропины, а также на стандартные образцы.

Биологические испытания гонадотропинов основаны на их фармакологическом свойстве стимулировать развитие и функции половых органов. Методы количественного определения и подлинности препарата основаны на способности препаратов гонадотропинов увеличивать массу добавочных половых желез у неполовозрелых крыс-самцов и увеличивать массу матки у неполовозрелых крыс-самок.

Количественную оценку биологической активности проводят, сопоставляя действие гонадотропинов и их стандартных образцов (СО) на половые железы самцов и/или самок крыс. Метод применяют для аттестации стандартных образцов гонадотропинов, при отработке новых производственных технологий, при изучении стабильности, а также для оценки качества лекарственного средства (ЛС). Биологическую активность гонадотропинов определяют в субстанциях и лекарственных формах, приготовленных из этих субстанций.

Испытания проводят на неполовозрелых крысах обоего пола в возрасте 20 - 26 дней, массой тела 29,0 - 36,0 г, рандомизированных по массе на 7 групп, не менее 10 животных в каждой. Шесть групп - опытные, седьмая - контрольная.

При определении биологической активности гонадотропинов одновременно испытывают три дозы СО (малая, средняя и большая), соответствующего конкретному виду гонадотропина, и три дозы ЛС.

Рекомендуемое соотношение доз 1:2. Выбор доз зависит от чувствительности животных. Все рабочие растворы испытуемых ЛС и СО вводят крысам подкожно в холку.

Полученные результаты обрабатывают согласно требованиям ОФС "Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами", подраздел 3.2: "Обработка результатов трехдозовой рандомизированной постановки (на примере биологической активности гонадотропина хорионического)". Для расчетов используют электронные таблицы или специальные биометрические компьютерные программы, например, CombiStats, или аналогичное программное обеспечение.

Значение величины активности субстанций гонадотропинов должно быть не менее величины, приведенной в ОФС. Активность препаратов гонадотропинов должна составлять 80 - 125% от величины, указанной на этикетке.

В случае если полученные значения не удовлетворяют указанным требованиям, необходимо повторение испытания, при этом выполняют одно из двух следующих действий:

- корректировку величины указанной активности ЛС в соответствии с активностью, полученной в первом испытании;

или

- корректировку величин рабочих концентраций ЛС в соответствии с чувствительностью крыс, на которых проводится испытание.

По результатам повторных опытов принимают решение о качестве препарата.

Если в фармакопейных статьях на ЛС гонадотропинов даны иные указания, то следуют им.

Активность хорионического гонадотропина человека (чХГ), полученного из мочи беременных женщин, определяют по увеличению массы комплекса добавочных половых желез у крыс-самцов (семенных пузырьков и предстательной железы) или по увеличению массы матки у крыс-самок, состоящей из тела и двух рогов.

Активность субстанции должна быть не менее 2500 МЕ/мг.

Содержимое ампулы СО хорионического гонадотропина и ЛС чХГ разводят свежеприготовленным фосфатно-альбуминовым забуференным физиологическим раствором pH 7,2 (1) (Примечание 1), исходя из указанной активности (см. "Общую часть"), до концентрации гормона 100 МЕ/мл (основной раствор). В испытании могут быть использованы ориентировочные концентрации СО и ЛС: 1,5; 3,0 и 6,0 МЕ/мл и вводимые объемы от 0,2 до 0,5 мл, если в фармакопейной статье не указано иное.

Свежеприготовленные растворы СО и ЛС чХГ вводят каждому животному в группе один раз в день в выбранном объеме в течение четырех дней в одно и то же время. Животным контрольной группы вводят 0,9% раствор натрия хлорида для инъекций в том же объеме. На пятый день проводят эвтаназию животных и определяют массу тела. Вскрывают брюшную полость, выделяют комплекс половых желез, освобождают от жировой ткани, слегка обсушивают фильтровальной бумагой и взвешивают с точностью до 0,001 г. Далее определяют относительную массу половых желез путем деления их массы на массу тела животного.

Проводят статистическую обработку полученных результатов как указано в разделе "Общая часть".

Содержимое ампулы СО хорионического гонадотропина и ЛС чХГ разводят свежеприготовленным фосфатно-альбуминовым забуференным физиологическим раствором pH 7,2, исходя из указанной активности (см. "Общую часть"), до концентрации гормона 100 МЕ/мл (основной раствор). В испытании могут быть использованы ориентировочные концентрации СО и ЛС: 0,2, 0,4 и 0,8 МЕ/мл. В зависимости от чувствительности животных свежеприготовленные растворы СО и ЛС вводят от 0,2 мл до 0,5 мл на крысу в течение трех дней приблизительно в одно и то же время суток, если в фармакопейной статье не указано иное. Животным интактной группы вводят натрия хлорида раствор 0,9% для инъекций в том же объеме.

На пятый день проводят эвтаназию животных и определяют массу тела. Вскрывают брюшную полость, отделяют матку, освобождают от жировой и соединительной ткани и яичников. Легким нажатием выдавливают жидкость из матки, слегка обсушивают фильтровальной бумагой и взвешивают с точностью до 0,001 г. Далее определяют относительную массу матки путем деления ее массы на массу тела животного.

Проводят статистическую обработку полученных результатов как указано в разделе "Общая часть".

Данный показатель включают в частные фармакопейные статьи для препаратов гонадотропина хорионического, получаемого из мочи беременных женщин.

Отбирают 5 мышей-самок массой тела от 19,0 до 21,0 г, у которых не менее чем за 2 недели до опыта удаляют яичники. Для удаления яичников в поясничной области вдоль позвоночника производят разрез кожи длиной от 1,0 до 1,5 см. Ориентиром нахождения яичников является жир (сальник), просвечивающий сквозь тонкий мышечный слой поясничной мускулатуры. Острыми концами глазного пинцета прокалывают мышечную ткань, захватывают сальник вместе с яичником и верхней частью рога матки и вытаскивают наружу. Рог матки вместе с жиром перевязывают лигатурой, отрезают яичник вместе с яйцеводом и верхней частью рога матки. Накладывают швы на мышечную ткань и кожу. Аналогичным образом удаляют яичник с другой стороны.

Не ранее чем через 14 дней ЛС растворяют в 0,9% растворе натрия хлорида для инъекций до концентрации 100 МЕ/мл и вводят мышам с удаленными яичниками подкожно в холку в объеме 0,25 мл на мышь два раза в день в течение 2 дней.

На четвертый и пятый день у животных опытной группы два раза в сутки берут стеклянной палочкой вагинальные мазки. Затем кончик палочки погружают в каплю воды на предметном стекле и осторожно размазывают. Полученный мазок рассматривают под микроскопом с увеличением 40x для распознавания клеточного состава мазка, который позволяет судить о различных стадиях полового цикла. При необходимости мазок можно окрасить метиленовым синим.

В мазках допускается наличие слизи, должны отсутствовать клетки эпителия (первая стадия полового цикла), а содержание лейкоцитов должно быть более 95%, что свидетельствует об отсутствии эстрогенов в препарате. Если наблюдается иная картина, то необходимо повторное испытание, по результатам которого принимают решение о качестве ЛС.

Определение биологической активности фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в ЛС гонадотропина менопаузного и урофоллитропина, получаемых из мочи, проводят в сравнении с указанной активностью стандартного образца ФСГ + лютеинизирующего гормона (ЛГ), а для рекомбинантных ЛС - с СО рекомбинантного ФСГ (рФСГ).

Биологическую активность ФСГ или рФСГ оценивают по увеличению массы яичников у крыс-самок в возрасте 20 - 26 дней массой тела 29,0 - 36,0 г. Животных рандомизируют по массе на 7 групп не менее 10 животных в каждой. Шесть групп - опытные, седьмая - контрольная.

Содержимое ампулы СО гонадотропина менопаузного или СО рФСГ разводят свежеприготовленным фосфатно-альбуминовым забуференным физиологическим раствором pH 7,2 (1) с чХГ (Примечание 2), исходя из указанной активности ФСГ (см. "Общая часть"), до концентрации гормона 100 МЕ/мл (основной раствор). ЛС разводят таким же образом, исходя из предполагаемой величины активности ФСГ (см. "Общую часть"). Выбор доз зависит от чувствительности животных. Ориентировочные концентрации рабочих растворов СО и ЛС: 1,5; 3,0 и 6,0 МЕ/мл. Объем раствора, вводимый одному животному, варьирует от 0,2 до 0,4 мл, если в нормативной документации не указано иначе.

Свежеприготовленные растворы СО и ЛС вводят крысам в первый день дважды, в остальные - один раз, в одно и то же время суток в течение 4 дней. На пятые сутки проводят эвтаназию животных. У крыс определяют массу тела, вскрывают брюшную полость, отделяют яичники, освобождают от жировой и соединительной ткани, слегка обсушивают фильтровальной бумагой и взвешивают с точностью до 0,001 г. Далее определяют относительную массу яичников путем деления их массы на массу тела животного.

Проводят статистическую обработку полученных результатов как указано в разделе "Общая часть".

Активность ФСГ субстанции гонадотропина менопаузного должна быть не менее 60 МЕ/мг.

Активность ФСГ урофоллитропина должна быть не менее 90 МЕ/мг.

Определение активности лютеинизирующего гормона (ЛГ) в гонадотропине менопаузном проводят путем сравнения с указанной активностью ЛГ стандартного образца ФСГ + ЛГ (мочевого), а для рекомбинантных ЛС - с активностью СО рекомбинантного ЛГ (рЛГ).

Действие гормона оценивают по увеличению массы матки у крыс-самок или по увеличению комплекса добавочных половых желез у крыс-самцов в возрасте 20 - 26 дней массой тела 29,0 - 36,0 г. Животных рандомизируют по массе на 7 групп, не менее 10 крыс в каждой. Шесть групп - опытные, седьмая - контрольная.

Содержимое ампулы со стандартными образцами ФСГ + ЛГ и рЛГ разводят свежеприготовленным фосфатно-альбуминовым забуференным физиологическим раствором pH 7,2, исходя из указанной активности ЛГ (см. "Общая часть"), до концентрации гормона 100 МЕ/мл (основной раствор).

ЛС природных и рекомбинантных гонадотропинов разводят таким же образом, исходя из предполагаемой величины их активности (см. "Общая часть").

Проводят статистическую обработку полученных результатов как указано в разделе "Общая часть".

Активность ЛГ в субстанции гонадотропина менопаузного должна быть не менее 60 МЕ/мг.

В испытании могут быть использованы ориентировочные концентрации ЛС и СО: 0,2; 0,4 и 0,8 МЕ/мл; вводимые объемы от 0,2 до 0,4 мл соответственно, если в частной статье не указано иное.

Свежеприготовленные растворы ЛС и СО вводят животным один раз в день в течение первых трех дней приблизительно в одно и то же время. На пятый день проводят эвтаназию животных. У крыс определяют массу тела, вскрывают брюшную полость, отделяют матку, освобождают от жировой и соединительной ткани, яичников. Легким нажатием выдавливают из матки жидкость, слегка обсушивают фильтровальной бумагой и взвешивают с точностью до 0,001 г. Далее определяют относительную массу матки путем деления ее массы на массу тела животного.

Проводят статистическую обработку полученных результатов как указано в разделе "Общая часть".

В испытании могут быть использованы ориентировочные концентрации СО и ЛС: 1,5; 3,0 и 6,0 МЕ/мл; вводимые объемы от 0,2 до 0,5 мл, если в частной статье не указано иное.

Свежеприготовленные растворы СО и ЛС вводят крысам-самцам один раз в день в течение четырех дней в одно и то же время. На пятый день проводят эвтаназию животных. У крыс определяют массу тела, вскрывают брюшную полость, вырезают комплекс добавочных половых желез, освобождают от жировой и соединительной ткани, слегка обсушивают фильтровальной бумагой и взвешивают с точностью до 0,001 г.

Далее определяют относительную массу половых желез путем деления их массы на массу тела животного.

Проводят статистическую обработку полученных результатов, как указано в разделе "Общая часть".

Испытание проводят не менее чем на 40 неполовозрелых самках крыс в возрасте примерно 21 дня, различающихся по массе тела не более чем на 10 г.

Определение остаточной лютеинизирующей активности проводят на фоне действия СО сывороточного и хорионического гонадотропинов.

Для этого в первый день испытания всем крысам вводят 50 МЕ СО сывороточного гонадотропина в объеме 0,5 мл, а на четвертый - 25 МЕ СО гонадотропина хорионического в том же объеме. В качестве растворителя используют свежеприготовленный фосфатно-альбуминовый забуференный физиологический раствор pH 7,2.

Через 6 дней после введения гонадотропина хорионического животных распределяют на 4 группы, не менее 10 особей в каждой, и внутривенно вводят испытуемый препарат и СО урофоллитропина или любой СО гонадотропина, содержащий ЛГ. Первая группа получает испытуемый препарат, а остальные - три рабочих разведения СО.

В качестве растворителя СО используют свежеприготовленный фосфатно-альбуминовый забуференный физиологический раствор pH 7,2. Дозы подбирают с учетом чувствительности животных. Готовят три рабочих разведения СО (примерные дозы 0,5; 1,0 и 2,0 МЕ/мл). При соотношении доз 1:2 малая доза СО должна вызывать снижение содержания аскорбиновой кислоты в яичниках у всех животных, в то время как большая доза не должна приводить к максимальному снижению содержания аскорбиновой кислоты у всех крыс, если не указано иное в нормативной документации.

Рабочее разведение испытуемого препарата готовят исходя из того, что соотношение количества МЕ ЛГ к МЕ ФСГ в урофоллитропине должно быть не более чем 1:60. Концентрация ФСГ в рабочем разведении испытуемого препарата должна быть равной 60X, где X - количество МЕ ЛГ в рабочем разведении СО средней концентрации.

Первой группе крыс вводят рабочее разведение испытуемого препарата в объеме 0,5 мл на животное, а второй, третьей и четвертой группе - рабочие разведения СО в малой, средней и большой концентрации соответственно в том же объеме.

Точно через 4 ч после введения рабочих растворов испытуемого препарата и СО крыс подвергают эвтаназии. Вскрывают брюшную полость, извлекают яичники, освобождают от жировой и соединительной ткани и немедленно взвешивают.

Далее яичники от каждой крысы гомогенизируют отдельно в течение 2 мин в свежеприготовленном 2,5% растворе метафосфорной кислоты (Примечание 3) при температуре 4 °C и доводят объем до 7,0 мл тем же раствором. Гомогенат отстаивают 30 минут при той же температуре, затем в течение 5 мин центрифугируют (2500 g; 4 °C). При необходимости надосадочную жидкость пропускают через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Концентрацию аскорбиновой кислоты в пробах определяют спектрофотометрическим методом. Для этого непосредственно перед измерением оптической плотности для каждой пробы готовят раствор, смешивая 2 мл раствора натрия ацетата pH 7,0 (Примечание 4), 3 мл воды для инъекций и 2 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (Примечание 5). Затем 2 мл полученного раствора добавляют к 2 мл надосадочной жидкости, перемешивают и через 30 мин измеряют оптическую плотность при длине волны 520 нм.

Для оценки полученных результатов строят стандартную кривую. В качестве стандарта используют раствор аскорбиновой кислоты. Для этого определяют оптическую плотность серии разведений аскорбиновой кислоты в примерном диапазоне концентраций от 0,1 до 4,0 мг/мл. В качестве растворителя используют свежеприготовленный раствор метафосфорной кислоты с концентрацией 25 г/л.

Значения оптической плотности, полученные в результате измерения проб испытуемого препарата и СО, сравнивают со стандартной кривой аскорбиновой кислоты. Определяют ее содержание в каждой пробе и выражают в миллиграммах на 0,1 г яичника. Вычисляют среднее значение и дисперсию.

Средняя концентрация аскорбиновой кислоты в яичниках крыс, получивших испытуемый препарат, должна быть не меньше, чем средняя концентрация аскорбиновой кислоты в яичниках животных, получивших среднюю дозу рабочего разведения СО (P = 0,95). Статистическую обработку проводят с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок (ОФС "Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами", подраздел 1: "Определение активности препарата биологическими методами").

Примечания:

Приготовление фосфатно-альбуминового забуференного физиологического раствора, pH 7,2 (1). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 5,4 г динатрия гидрофосфата и 3,8 г натрия хлорида, растворяют в 100 мл воды. В полученный раствор прибавляют 0,5 г бычьего сывороточного альбумина посредством нанесения последнего на поверхность раствора без перемешивания. После полного растворения альбумина раствор хорошо перемешивают, избегая вспенивания, и доводят объем раствора водой до метки 500,0 мл. Измеряют pH. При необходимости непосредственно перед использованием pH раствора доводят до 7,2 с помощью 10% раствора фосфорной кислоты разведенной или 8,5% раствора натрия гидроксида.

Приготовление фосфатно-альбуминового забуференного физиологического раствора, pH 7,2 (1), с гонадотропином хорионическим. В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 5,4 г динатрия гидрофосфата и 3,8 г натрия хлорида, растворяют в 100 мл воды. В полученный раствор прибавляют 0,5 г бычьего сывороточного альбумина при нанесении его на поверхность раствора без перемешивания. После полного растворения альбумина раствор хорошо перемешивают, избегая вспенивания, прибавляют гонадотропин хорионический из расчета не менее 70 МЕ/мл, если в частной статье не указано иное, и доводят объем раствора водой до метки. Измеряют pH. При необходимости непосредственно перед использованием pH раствора доводят до 7,2 с помощью 10% раствора фосфорной кислоты разведенной или 8,5% раствора натрия гидроксида.

Приготовление 2,5% раствора метафосфорной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 25,0 г метафосфорной кислоты, добавляют 100 мл воды и перемешивают до растворения. Доводят объем раствора водой до метки.

Приготовление раствора натрия ацетата, pH 7,0. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 45,3 г натрия ацетата, добавляют 100 мл воды и перемешивают до растворения. Доводят объем раствора водой до метки. Измеряют pH. При необходимости доводят pH раствора до 7,0 с помощью 30% уксусной кислоты.

Приготовление раствора 2,6-дихлорофенолиндофенолята натрия. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 50 мг 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, добавляют 80 мл воды, перемешивают до растворения, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют.