"ОФС.1.8.2.0001.15. Общая фармакопейная статья. Иммунодиффузия в геле"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II")

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод, используемый для определения подлинности (видоспецифичности) лекарственных препаратов.

Принцип метода иммунодиффузии в геле заключается в том, что в результате реакции антигена с антителом, взятых в эквивалентном соотношении, образуется преципитат в виде линий преципитации.

Подлинность (видоспецифичность) подтверждается образованием линии преципитации с антигенами сыворотки, содержащей только видоспецифичные белки (например, при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека с сывороткой, преципитирующей белки крови человека).

Обработанную спиртом стеклянную пластину размером 26 x 75 мм или 90 x 120 мм или стеклянную чашку Петри диаметром 100 мм (в соответствии с указаниями нормативной документации) помещают строго горизонтально на предметный столик. Расплавленный агар (температура (50 +/- 5) °C) наносят на стеклянную пластину (или стеклянную чашку Петри) в количестве, достаточном для формирования слоя толщиной 2,4 - 2,6 мм (например, на стекло размером 26 x 75 мм необходимо нанести 5,5 - 6,0 мл). Стеклянную пластину (или стеклянную чашку Петри) на 30 - 40 мин помещают во влажную камеру эксикатора с небольшим количеством воды для застывания агара.

В застывшем агаровом геле по трафарету готовят лунки для реагентов (рис. 1), используя трубки-пробойники, изготовленные из латуни или нержавеющей стали, с заточенным концом со стороны внутреннего диаметра (2 - 3 мм) или используют стандартные штампы. Расстояние между внешними краями лунок должно быть равно 5 - 6 мм. Агаровые пробки из лунок аккуратно удаляют с помощью поперечно-срезанной пастеровской пипетки, не допуская отслаивания геля от стекла.

1 - сыворотка, преципитирующая видоспецифичные белки (например, белки крови человека при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека);

2 - стандартный реагент (например, контрольная сыворотка крови человека при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека);

3, 4, 6 - сыворотки, преципитирующие иные белки (например, белки крови лошади, свиньи, крупного рогатого скота при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека);

5 - отрицательный контроль (0,9% раствор натрия хлорида);

7 - исследуемый препарат.

Лунки заполняют испытуемыми образцами в соответствии со схемой (рис. 1) в объеме, не превышающем объем лунки (объем вносимых образцов указывают в нормативной документации).

Стеклянную пластину (или стеклянную чашку Петри) с агаровым гелем помещают во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч или при температуре (5 +/- 3) °C в течение 48 ч.

Учет результатов анализа проводят визуально путем выявления линий преципитации. Подтверждением специфичности иммунодиффузии является наличие линии преципитации стандартного реагента и соответствующей сыворотки, преципитирующей видоспецифичные белки. Например, при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека должны выявляться линии преципитации сыворотки, преципитирующей белки крови человека, с исследуемым препаратом и с контрольной сывороткой крови человека (рис. 2).

1 - сыворотка, преципитирующая белки крови человека;

2 - контрольная сыворотка крови человека (стандартный реагент);

3 - сыворотка, преципитирующая белки крови лошади;

4 - сыворотка, преципитирующая белки крови свиньи;

5 - отрицательный контроль (0,9% раствор натрия хлорида);

6 - сыворотка, преципитирующая белки крови крупного рогатого скота;

7 - исследуемый препарат.

Примечание

1. Приготовление агарового геля. В химический стакан вместимостью 1000 мл вносят 12,5 г агара, добавляют 500 мл 0,9% раствора натрия хлорида и оставляют для набухания геля в течение 1 ч при комнатной температуре. Стакан с содержимым помещают в кипящую водяную баню и выдерживают до полного расплавления агара. Объем раствора геля доводят 0,9% раствором натрия хлорида до метки и перемешивают. Раствор агара фильтруют через марлю (2 - 3 слоя) и разливают во флаконы. Расплавленный агар должен быть прозрачным. Срок годности охлажденного агарового геля 1 мес при температуре хранения (5 +/- 3) °C. Допустимо применение агарового геля иного состава в соответствии с указаниями в нормативной документации.