"ОФС.1.2.4.0016.18. Общая фармакопейная статья. Тест активации моноцитов"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I")

Настоящая статья описывает методы определения пирогенности лекарственных средств (ЛС), используемых для парентерального применения, с помощью теста активации моноцитов (МАТ).

Моноциты, активированные пирогенными веществами (ПВ) и бактериальными эндотоксинами (БЭ), экскретируют провоспалительные цитокины, концентрацию которых определяют с помощью спектрофотометрического, турбидиметрического, хромогенного или др. методов. Количество ПВ в ЛС определяют с помощью одного из трех методов, описанных в настоящей статье:

Метод A. Количественное испытание.

Метод B. Полуколичественное испытание.

Метод C. Сравнительное испытание с серией ЛС, утвержденной в качестве контрольной.

МАТ может являться альтернативой испытанию на пирогенность, проводимому на животных (кроликах), при условии выполнения валидированных процедур для испытуемого ЛС.

Качественное или количественное определение пирогенных веществ (ПВ), в том числе, бактериальных эндотоксинов (БЭ) и пирогенов небактериальной природы, активирующих моноциты человека или моноцитоподобные клетки, производится путем определения уровня высвобождения эндогенных маркеров, таких, как провоспалительные цитокины (например, фактор некроза , и интерлейкин-6 (IL-6)), которые участвуют в патогенезе лихорадки и вызывают пирогенную реакцию.

ЛС, содержащие ПВ небактериальной природы, дают более выраженную дозозависимую реакцию, чем реакция на БЭ. Поэтому испытание таких ЛС проводят без разведения препаратов и/или в минимальных разведениях.

Максимально допустимое разведение (МДР) испытуемого ЛС представляет собой наибольшее разведение, в котором возможно определение концентрации пирогенов, соответствующее значению предельного содержания ПВ, установленного для данного ЛС. Испытуемое ЛС может быть проверено в одном разведении или серии разведений при условии, что конечная степень разведения не превысит значения МДР.

МДР вычисляют по формуле:

где ПК_ПВ - предельная концентрация ПВ, которая является критерием качества для принятия положительного или отрицательного решения и выражается в эквиваленте единиц эндотоксина (ЭЕЭ) на миллиграмм или миллилитр, или в единицах биологической активности ЛС;

К_ИР - концентрация испытуемого раствора, т.е. концентрация ЛС или действующего вещества, для которого указана ПК_ПВ;

ПО - предел обнаружения концентрации ПВ, соответствующей минимальному пределу обнаружения. Концентрация ПВ, соответствующая минимальному пороговому значению, может быть определена по калибровочной кривой стандарта эндотоксина или серии ЛС, утвержденной в качестве контрольной, и выражается в ЭЕЭ/мл. Один ЭЕЭ стимулирует выделение такого же количества цитокинов, что и одна единица эндотоксина (ЕЭ).

Для вычисления предельной концентрации ПВ используют формулу, приведенную в ОФС "Бактериальные эндотоксины":

где К - пороговая пирогенная доза БЭ, вводимая в течение одного часа (ЕЭ/кг);

М - максимальная терапевтическая доза испытуемого ЛС, вводимая в течение одного часа (выражается в мг/кг, мл/кг или ЕД/кг массы тела человека).

Значения для К представлены в табл. 1 и соответствуют данным ОФС "Бактериальные эндотоксины":

Для ЛС с другими способами введения предельная концентрация БЭ обычно определяются в соответствии с ОФС "Бактериальные эндотоксины".

Пороговое значение эндотоксина (X) вычисляется по формуле:

где - среднее пороговое значение эндотоксина, полученное для 4-х повторов контрольной пробы или реакции холостого раствора (blank solution);

s - стандартное отклонение 4-х повторов контрольной пробы или реакции холостого раствора (blank solution).

Тест активации моноцитов (МАТ) проводят в условиях, не оказывающих влияния на результаты теста и исключающих контаминацию пирогенными веществами.

Испытуемый раствор инкубируют с моноцитами человека, например:

- с гепаринизированной периферической кровью человека, желательно, отобранной не более, чем за 4 ч до испытания;

- с моноцит-содержащей фракцией крови, например, содержащей мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК), выделенные путем центрифугирования в градиенте плотности или иным способом;

- с линией моноцитоподобных клеток (моноцитов) человека.

Гепаринизированную периферическую кровь человека разводят культуральной средой (% (v/v)) или 0,9% раствором натрия хлорида до концентраций от 2 до 50%. В испытании используют МКПК или линии моноцитоподобных клеток в культуральной среде с добавлением плазмы донора или сыворотки крови группы IV (AB) с концентрацией клеток в суспензии 0,1 - 1,0·10⁶ клеток/мл. При использовании линий моноцитоподобных клеток сыворотку группы крови IV (AB) можно заменить на бычью эмбриональную сыворотку, инактивированную нагреванием. Культуру клеток готовят при температуре 37 +/- 1 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO₂.

Культура клеток, используемая для выделения маркеров ПВ, должна быть функционально стабильной. Реакцию выделенного маркера сравнивают с реакциями на стандартный эндотоксин или на серию ЛС, утвержденную в качестве контрольной. Реакцию выбранного маркера калибруют с использованием соответствующего стандарта.

Стеклянная и пластиковая посуда, используемая в испытании, не должна содержать пирогенных веществ в количествах, определяемых в тесте, и не оказывать влияние на ход реакции. Всю стеклянную посуду и другую аппаратуру, устойчивую к нагреванию, депирогенизируют в сухожаровом шкафу при температуре 250 °C не менее 30 мин в соответствии с валидированной процедурой.

Источниками клеток для МАТ являются цельная кровь или мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК).

Используют цельную кровь, полученную от индивидуальных доноров, или пулы цельной крови, а МКПК выделяют, как из крови, полученной от индивидуальных доноров, так из пулов цельной крови.

Доноры крови должны проходить обследование в соответствии с действующими нормативными правовыми документами.

Пулы цельной крови или компонентов крови (например, МКПК) должны:

- состоять из порций крови как минимум от 4-х индивидуальных доноров, желательно от восьми или более доноров;

- формироваться путем отбора из каждой донации примерно равных объемов крови или равного количества клеток в приблизительно одинаковом объеме крови.

Для квалификации объединенных пулов клеток в течение 4 ч с момента сбора крови строят кривые дозозависимости пула с использованием стандартных растворов (СО) стандарта эндотоксина не менее, чем в 4-х разведениях, выполненных в соответствии с принципом геометрической прогрессии, например, в диапазоне от 0,01 ЕЭ/мл до 4 ЕЭ/мл. Полученные кривые должны отвечать критериям приемлемости калибровочной кривой. Источники клеток, предназначенные для использования в МАТ, например, цельная кровь человека или компоненты крови, такие, как МКПК или линии моноцитоподобных клеток, могут быть криоконсервированными. Пулы криоконсервированных клеток получают объединением перед замораживанием, или объединением единичных криоконсервированных донорских порций сразу же после оттаивания.

Пулы криоконсервированных клеток должны:

- состоять из порций крови минимум от 4-х индивидуальных доноров, предпочтительно от восьми или более доноров;

- формироваться путем отбора из каждой донации примерно равных объемов крови или равного количества клеток в приблизительно одинаковом объеме крови.

Квалификацию криоконсервированной цельной крови или клеток проводят сразу же после оттаивания (или объединения, в случае необходимости), а полученные дозозависимые кривые для криоконсервированной крови или клеток должны соответствовать критериям приемлемости теста. Для успешного выполнения МАТ используют непрерывно культивируемую клеточную линию моноцитов человека. Для оптимизации метода могут использоваться клоны клеточной линии. Клетки хранят в асептических условиях и регулярно контролируют на заражение микоплазмами. Дополнительно постоянно проверяют подлинность клеток (например, время удвоения, морфологию и функцию) и стабильность клеточной линии.

Функциональную стабильность клеточной линии оценивают при наблюдении за ее состоянием в процессе повседневных испытаний с учетом количества пассажей. Критериями функциональной стабильности являются рост, максимальная реакция в испытании, "фоновый шум" и экспрессия рецептора. Экспрессию рецептора проверяют с помощью специфических лигандов, например, липополисахарида (ЛПС) для Toll-подобного рецептора 4 (TLR4), липотейхоевой кислоты (LTA) для Toll-подобного рецептора 2 (TLR2), синтетического бактериального липопротеина для TLR2-TLR1 или синтетического бактериального липопротеина для TLR2-TLR6.

Для обеспечения прецизионности и достоверности эксперимента проводят предварительные испытания, в которых проверяют соблюдение критериев для калибровочной кривой, отсутствие взаимодействия растворов в ходе испытания, способность методики обнаруживать БЭ и ПВ, отличные от БЭ, отсутствие влияния испытуемых растворов на систему обнаружения (реактивы, оборудование, посуду и расходные материалы).

Для построения калибровочной кривой готовят не менее 4-х концентраций растворов стандарта эндотоксина. Проводят испытание, используя не менее 4-х повторов каждой концентрации раствора.

Контрольный уровень высвобожденного маркера без добавления раствора стандарта эндотоксина должен быть доведен до минимально возможного.

Для калибровочной кривой должны выполняться два критерия приемлемости:

- регрессионная зависимость ответов (соответственно преобразованных при необходимости) от логарифма концентрации БЭ должна быть статистически значима (P = 99%);

- регрессионная зависимость ответов от логарифма концентрации БЭ должна быть линейна (P = 95%). При анализе S-образной кривой с помощью четырехпараметрического метода, она не должна значимо отличаться от теоретической (ОФС "Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами", подраздел 3.9).

Для подтверждения отсутствия влияния испытуемого раствора на результаты определения ПВ проводят предварительную валидацию методики. Валидацию необходимо проводить при любых изменениях, влияющих на результаты испытания. Используя соответствующий растворитель, делают ряд разведений ЛС в геометрической прогрессии таким образом, чтобы они не превышали МДР испытуемого ЛС.

Для Метода A (количественный метод) готовят такие же разведения испытуемого ЛС, к которым прибавляют БЭ в концентрации, равной или близкой к середине калибровочной кривой.

Для Метода B (полуколичественный метод) готовят разведения, равные удвоенному значению предела обнаружения (ПО).

Испытания полученных серий разведений проводят одновременно в одном эксперименте. Для вычисления концентрации эндотоксина, выраженной в ЭЕЭ, используют калибровочную кривую для каждого раствора. Вычисляют среднее значение полученной концентрации БЭ в растворе, содержащем добавленный стандарт эндотоксина. Для этого из установленной средней концентрации эндотоксина, содержащего добавленный стандарт эндотоксина, вычитают среднюю концентрацию эндотоксина в растворе ЛС (при его наличии).

Результаты считают удовлетворительными, если при испытании измеренная концентрация БЭ после добавления стандарта эндотоксина в испытуемый раствор, составляет 50 - 200% от известной концентрации БЭ.

Если испытание не отвечает данному критерию, переходят к Методу C.

При использовании Метода C раствор ЛС испытывают в трех концентрациях:

- наибольшая концентрация ЛС (без разведения или наименьшее разведение), при которой наблюдается максимальное высвобождение выбранного маркера;

- двукратное разведение концентрации ЛС;

- концентрации ЛС в разведении ниже двукратного, например, 4-кратное.

Концентрация испытуемого ЛС, при которой наблюдается наибольшее высвобождение маркера, может зависеть от особенностей донора клеток/крови, а также серии клеток. Поэтому необходимо проводить валидацию методики в отношении используемых клеток в трех независимых испытаниях с использованием в каждом из них клеток от различных доноров.

Дальнейшие испытания могут быть продолжены в случае, если при минимальном разведении раствора A регистрируется максимальное высвобождение количества соответствующего маркера из клеток большинства доноров, а также при тестировании с этими клетками растворов B и C, полученными при 2-кратном и 4-кратном разведении раствора A (табл. 2).

Три разведения, используемые в исследовании, не должны превышать МДР; кратности разведения для этих трех растворов обозначаются как f₁, f₂ и f₃. После валидации методики выполняются стандартные испытания с объединенными клетками от индивидуальных доноров, или с единичным пулом, или с клетками от 1 пассажа линии моноцитоподобных клеток человека.

В предварительных испытаниях также подтверждают способность выбранной методики обнаруживать провоспалительные или пирогенные вещества, отличные от БЭ. Для этого можно использовать архивные образцы, в которых наличие ПВ, отличных от БЭ, было определено в ранее проведенных исследованиях на основании положительных реакций в испытании "Пирогенность" на кроликах или по развитию побочных эффектов у человека. При отсутствии таких серий ЛС в предварительные испытания должна быть включена валидация используемой методики с применением специфических лигандов для Toll-подобных рецепторов, например, пептидогликанов, липотейхоевых кислот или синтетических бактериальных липопротеинов.

После подбора оптимального разведения раствора испытуемого ЛС для дальнейшего исследования проводят проверку его влияния на результаты методики измерения маркера (например, методом иммуноферментного анализа). Различия в определяемых концентрациях различных серий разведений стандарта выбранного маркера в присутствии и отсутствии испытуемого ЛС должны находиться в диапазоне +/- 20%.

В методе A концентрацию ПВ вычисляют с помощью калибровочной кривой стандарта эндотоксина.

Метод A включает сравнение исследуемого препарата со стандартной кривой "доза - реакция эндотоксина". Концентрация ПВ в испытуемом ЛС не должна превышать величину ПК_ПВ.

После валидации методики готовят растворы, приведенные в табл. 2. Клетки от каждого из 4-х доноров, единичного пула или от первого пассажа линии моноцитоподобных клеток человека инкубируют в 4-х повторностях с каждым из растворов.

Раствор A - раствор испытуемого ЛС в наименьшем разведении, для которого концентрация эндотоксина находится в пределах от 50 до 200%.

Раствор B - раствор испытуемого ЛС в 2-кратном разведении, не превышающем значение МДР.

Раствор C - раствор 2-кратного разведения раствора B, не превышающее значение МДР.

Раствор D - раствор A в выбранном разведении, к которому добавлен стандарт эндотоксина. Конечная концентрация БЭ в анализируемом растворе должна быть близкой среднему значению калибровочной кривой концентраций стандарта эндотоксина (положительный контроль испытуемого ЛС - R₃).

Раствор R₀ - отрицательный контроль; стандарт эндотоксина не добавляется.

Растворы R₁ - R₄ - растворы стандарта эндотоксина, используемые для построения калибровочной кривой, в тех же концентрациях, которые использовались при проведении анализа "Проверка достоверности критериев калибровочной кривой" (положительный контроль).

Учет результатов. Результаты, полученные после проведения метода A, должны соответствовать двум критериям калибровочной кривой (раздел "Критерии приемлемости калибровочной кривой").

Определяемая концентрация эндотоксина, полученная путем вычитания из величины концентрации эндотоксина раствора D величины концентрации эндотоксина в растворе A, должна находиться в диапазоне 50 - 200%. Независимо от способа получения моноцитов (индивидуальный донор, пул доноров, клеточная линия) для вычисления концентрации эндотоксина в растворах A, B и C каждой из четырех повторностей используется калибровочная кривая стандарта эндотоксина R₁ - R₄.

Испытуемое ЛС отвечает требованиям нормативной документации по результатам проводимых испытаний с помощью МАТ, если средняя концентрация ЕЭЕ, измеренная во всех четырех повторностях испытания растворов A, B и C с учетом разведений и концентраций, меньше ПК_ПВ, установленного для ЛС.

В методе B концентрацию ПВ определяют при сравнении испытуемого ЛС с растворами стандарта эндотоксина. Исходный раствор стандарта эндотоксина готовят из вторичного стандарта, аттестованного относительно международного стандартного образца.

Для получения положительного результата при выполнении испытания концентрация ПВ в испытуемом ЛС должна быть меньше, чем ПК_ПВ. Для принятия решения о положительном или отрицательном результате испытания используют ответ, полученный для раствора A, если не предусмотрено иное.

Используя валидированную методику испытания, проводят ее в 4-х повторностях, для чего готовят растворы, указанные в табл. 3, которые добавляют в 4-х повторностях к клеткам от каждого из 4-х доноров или с единичным пулом или от первого пассажа линии моноцитоподобных клеток человека, а затем инкубируют их в оптимальных условиях.

Раствор A - раствор ЛС в разведении, обозначенном в таблице как f, при котором было проведено испытание на мешающие факторы.

Раствор B - раствор ЛС в разведении, обозначенном в таблице как f₁, не превышающем МДР. Кратность раствора конкретного ЛС выбирается в результате анализа данных валидации, например, МДР/2.

Раствор C - раствор ЛС в разведении, обозначенном как f₂, не превышающем МДР. Кратность раствора конкретного ЛС выбирается в результате анализа данных валидации, например, МДР.

Раствор D - положительный контроль ЛС. Раствор A с добавлением стандарта эндотоксина 2 x ПО используемой системы (как определено в предварительном испытании).

Раствор E - положительный контроль ЛС. Раствор B с добавлением стандарта эндотоксина 2 x ПО используемой системы.

Раствор F - положительный контроль ЛС. Раствор C с добавлением стандарта эндотоксина 2 x ПО используемой системы.

Раствор R₀ - отрицательный контроль.

Раствор R₁ - стандарт эндотоксина 0,5 x ПО используемой системы.

Раствор R₂ - стандарт эндотоксина 1 x ПО используемой системы.

Раствор R₃ - стандарт эндотоксина 2 x ПО используемой системы.

Раствор R₄ - стандарт эндотоксина 4 x ПО используемой системы.

Учет результатов. Результаты, полученные после проведения испытания методом B, учитываются в том случае, если полученное среднее значение моноцитов на добавление растворов от R₀ до R₄ постепенно увеличивается. Среднее значение реакции на R₀ может быть равно среднему значению реакции на R₁. Независимо от способа получения моноцитов (индивидуальный донор, пул доноров, клеточная линия), средний ответ на раствор R₂ должен быть больше положительного порогового значения. Результаты ниже этого положительного порогового значения рассматриваются как отрицательная реакция. Если среднее значение ответа на R₁ или R₂ превышает пороговое значение, то значения реакции испытуемого раствора должны быть отрицательными и, таким образом, выдерживать испытание.

Средние значения отрицательных результатов для растворов испытуемого ЛС (A, B и C) и растворов с добавленным стандартом эндотоксина (D, E или F соответственно) сравниваются с данными реакции R₃ для определения концентраций ПВ, выраженных в процентах от ожидаемых значений и концентрация ПВ в испытуемом ЛС меньше предельного содержания пирогенов для данного источника клеток в том случае, если раствор испытуемого ЛС, выбранный для оценки соответствия/несоответствия при минимальном его разведении дает отрицательные результаты и определяемая концентрация добавленного в растворы стандарта эндотоксина находится в диапазоне от 50 до 200%.

При использовании метода C проводится сравнение испытуемого ЛС с серией ЛС, утвержденной в качестве контрольной. Контрольная серия выбирается в соответствии с обоснованными и утвержденными критериями. Данное испытание проводят в том случае, когда испытуемое ЛС оказывает выраженное мешающее действие, но не может быть разведено в диапазоне МДР для устранения этого действия, так как данное ЛС содержит (или предполагается, что содержит) пирогенные примеси, отличные от БЭ. Реакции на такие ПВ протекают быстрее и могут быть более выраженными, чем ответы на БЭ. В связи с этим такие испытания необходимо проводить в диапазоне разведений, которые включают и минимальное разведение. Процедура теста описана ниже и включает пример сравнения испытуемой серии с контрольной.

Используя валидированную методику испытания, готовят растворы, указанные в табл. 4, добавляют их в 4-х повторностях к клеткам от каждого из доноров, или пулом, или от первого пассажа линии моноцитоподобных клеток человека, затем инкубируют.

Растворы A, B и C - разведения контрольной серии ЛС с кратностью разведения f₁, f₂, f₃, определенные в испытании на мешающие факторы.

Растворы D, E и F - разведения испытуемого ЛС с кратностью разведений f₁, f₂, f₃, определенные для контрольной серии в испытании на мешающие факторы.

Раствор G - раствор стандарта эндотоксина, при котором наблюдается четкий положительный ответ (положительный контроль жизнеспособности клеток).

Раствор R₀ - растворитель, используемый для разведения испытуемого ЛС (отрицательный контроль).

Учет результатов. Все результаты должны быть получены на клетках, у которых раствор G и хотя бы один из растворов A, B или C, вызывают ответ, превышающий минимальный уровень высвобождения маркера (раствор R₀). Для каждого источника клеток (индивидуального донора, пула доноров, клеточной линии) используют дозозависимую кривую и вычисляют средние ответы растворов A - F.

С этой целью готовят в двух повторностях четыре концентрации стандарта маркера, разведенного в геометрической прогрессии, и отрицательного контроля. Затем вычисляют среднюю величину реакции моноцитов на растворы A - F. Суммируют среднюю величину реакции моноцитов на растворы A, B и C и средние ответы на растворы D, E и F. Делят сумму средних ответов на растворы D, E и F на сумму средних ответов на растворы A, B и C. Испытуемое ЛС отвечает требованиям испытания для данного источника клеток, если полученное значение соответствует определенному критерию приемлемости, не превышающему 2,5.

При использовании клеток от индивидуальных доноров ЛС должно соответствовать требованиям МАТ настоящей статьи для клеток от каждого из 4-х различных доноров.

В случае, если ЛС выдерживает испытание с клетками 3-х доноров, а клетки 4-го донора исключены, поскольку не отвечают критериям проведения испытания или имеют положительную реакцию, то испытание продолжают с клетками от других 4-х доноров, которые не использовались в первом испытании.

Испытуемое ЛС выдерживает испытание с клетками 7 из 8 различных доноров, так как в этом случае допускается только 1 положительная реакция при использовании клеток от 8 доноров.

Если источник моноцитов представляет клетки, объединенные от ряда индивидуальных доноров, испытуемое ЛС должно соответствовать требованиям МАТ с испытанием первого пула клеток. При использовании линии моноцитоподобных клеток человека ЛС должно выдерживать испытание с первым пассажем линии клеток.

Для более точного количественного определения уровня содержания ПВ методы A, B и C могут выполняться с использованием других разведений испытуемого ЛС, не превышающих МДР.