"ОФС.1.7.2.0005.15. Общая фармакопейная статья. Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II")

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения иммуногенности коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин путем сравнения с иммуногенностью референс-препарата коклюшной вакцины, откалиброванного в международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандартному образцу. Определение проводят на модели экспериментального менингоэнцефалита при внутримозговом введении иммунизированным мышам заражающей дозы тест-штамма Bordetella pertussis 18323 по методу Kendrick.

Животные. Здоровые мыши с массой тела (11 +/- 1) г чувствительной линии или аутбредные мыши, способные давать адекватный иммунный ответ. Используют мышей одного пола или самцов и самок, равномерно распределенных по группам. В 1 опыте различия массы тела отдельных животных не должны превышать 2 г. Перед проведением испытания за животными проводят наблюдение в течение 3 сут. При гибели более 10% мышей данную партию не используют.

- стандартный образец иммуногенности коклюшной вакцины, калиброванный в МЕ по соответствующему международному стандартному образцу;

- стандартный образец мутности 10 МЕ, калиброванный в международных оптических единицах (МЕ).

Тест-штамм. B. pertussis 18323, хранят в лиофилизированном состоянии. Продолжительность хранения высушенного штамма не должна превышать 10 лет; биологические свойства лиофилизированного тест-штамма проверяют ежегодно.

Среды. Используют среды Борде-Жангу, казеиново-угольный агар (КУА), их модификации или другие среды, адаптированные к коклюшному микробу.

В 1500 мл воды очищенной последовательно растворяют ингредиенты:

- калий фосфорнокислый двузамещенный - 2,25 г,

- калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,75 г,

- калий хлористый - 1,5 г,

- магний сернокислый - 0,075 г,

- натрий хлористый - 7,5 г.

Полученный солевой раствор до внесения следующих ингредиентов должен иметь pH 7,4 - 7,5.

Затем в солевой раствор вносят:

- фильтрат картофельного отвара - 500 мл,

- агар зарубежных фирм "Дифко" (США) или "Мерк" (Германия) - 60 г.

Среду кипятят до полного растворения агара, устанавливают pH 7,1 - 7,2, разливают по (200 +/- 5) мл в стерильные флаконы вместимостью 500 мл и стерилизуют при температуре 110 °C в течение 30 мин. Среду Борде-Жангу хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 3 мес.

Фильтрат картофельного отвара

В 1 л воды очищенной вносят 0,5 кг очищенного мелко нарезанного картофеля и нагревают до кипения. В момент закипания добавляют 40 мл глицерина и кипятят в закрытой посуде до полного разваривания картофеля в течение 1,0 - 1,5 ч. Доводят объем водой очищенной до первоначального уровня и процеживают через двухслойную марлевую салфетку. Картофельный отвар используют свежеприготовленным.

Для получения среды Борде-Жангу с 30% крови содержимое флакона нагревают до температуры 50 - 55 °C, вносят 60 мл дефибринированной крови человека, перемешивают и разливают в чашки Петри. Срок хранения среды с кровью - 10 сут при температуре от 2 до 8 °C.

Примечание

Дефибринированную кровь получают на участках заготовки крови, где ее контролируют на отсутствие возбудителей инфекций, которые передаются при гемотрансфузиях, в соответствии с утвержденными уполномоченными органами РФ "Инструкцией по заготовке и консервированию донорской крови" и "Инструкцией по проведению донорского прерывистого плазмафереза". Срок хранения крови не более 2 сут.

На 1 л среды добавляют:

- гидролизат казеина - (170 +/- 5) мл (берется из расчета, чтобы в готовой среде содержание аминного азота составляло от 150 до 160 мг%),

- дрожжевой диализат - (90 +/- 10) мл,

- калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,

- магний хлористый 6-водный - 0,4 г,

- крахмал растворимый - 1,5 г,

- кальций хлористый - 0,01 г или 1% раствор - 1 мл,

- железо сернокислое 7-водное - 0,01 г или 0,5% раствор - 2 мл,

- медь сернокислая 5-водная - 0,005 г или 0,2% раствор - 2 мл,

- цистеин - 0,03 г или 1,5% раствор - 2 мл,

- агар микробиологический - 30,0 г,

- уголь активированный - 2 г.

Содержание хлоридов в среде должно составлять (0,75 +/- 0,15)%, аминного азота (155 +/- 10 мг%); pH среды доводят до 7,0 - 7,1 с помощью 20% раствора натрия гидроксида.

Среду разливают в матрацы по (250 +/- 10) мл, пробирки по (11 +/- 1) мл и флаконы вместимостью 500 мл по (200 +/- 5) мл, стерилизуют 30 мин при температуре 110 °C и хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 1 мес. Для получения среды с 10% крови содержимое флакона растапливают, охлаждают до температуры 50 - 55 °C, вносят 20 мл дефибринированной крови человека и перемешивают. Срок хранения среды с кровью 10 сут при температуре от 2 до 8 °C.

Гидролизат казеина:

- казеин (сухой) - 2000 г,

- хлористоводородная кислота концентрированная - 1000 мл,

- вода очищенная - 500 мл.

Степень расщепления белка - не менее 93%. Аминный азот 850 - 1000 мг%, общий азот 910 - 1080 мг%, натрия хлорид 4 - 6%. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 110 °C. Среду используют свежеприготовленной (при добавлении 0,5% хлороформа срок хранения 1 год при температуре от 2 до 8 °C).

Дрожжевой диализат:

- дрожжи хлебопекарные - 1000 г,

- вода очищенная - 1000 мл,

- хлороформ - 4 мл.

- Аминный азот - не менее 0,54 мг/мл. Срок хранения 3 мес при температуре от 2 до 8 °C.

1% раствор гидролизата казеина

Гидролизат казеина - 10 мл (аминный азот 8,5 - 10,0 мг/мл), натрий хлористый - 6,0 г (до концентрации хлоридов 0,6%), вода очищенная - до 1000 мл. С помощью 20% раствора натрия гидроксида pH доводят до (7,1 +/- 0,2), Среду стерилизуют 15 мин при температуре 121 °C. Срок хранения 6 мес. Каждую серию гидролизата казеина проверяют на безвредность путем внутримозгового введения 5 мышам по 0,03 мл. Животные должны оставаться живыми и здоровыми в течение 3 сут.

Мышей распределяют в группы по 18 - 20 животных в каждой: по 3 группы для испытуемого и референс-препаратов. Одновременно для контроля вирулентности заражающего штамма B. pertussis 18323 (определение LD₅₀ культуры) из этой же партии животных формируют 4 группы по 10 мышей в каждой.

Необходимо соблюдать принцип случайного распределения животных по группам, случайными должны быть и расположение клеток на полках, и порядок введения разрешающей дозы.

Готовят по 3 пятикратных разведения испытуемого и референс-препаратов. В качестве растворителя используют 0,9% раствор натрия хлорида, pH (7,1 +/- 0,2). В интервале используемых разведений каждого образца должна содержаться средняя эффективная доза ED₅₀.

В ампулу с референс-препаратом вносят стерильный растворитель из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалась 1 МЕ (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 1).

Образец испытуемой вакцины разводят в 14 раз (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 2). Если полученное в опыте значение ED₅₀ испытуемой вакцины будет больше значений использованных доз, необходимо изменить разведение I (например, 1:10). Последующие 2 разведения делают по вышеприведенной схеме.

Приготовленные разведения вакцины и референс-препарата хранят при температуре от 2 до 8 °C и используют в течение не более 4 ч.

Каждой мыши в каждой группе внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл одного из разведений испытуемой вакцины или референс-препарата. К моменту введения заражающей дозы не менее 94% иммунизированных мышей должно остаться в живых и без признаков заболевания. Если гибель животных превышает указанную величину, то опыт не подлежит учету.

Бактериальную суспензию B. pertussis 18323, используемую для заражения, готовят из 20 - 24-часовой культуры второго - третьего пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу, с кровью человека или КУА с кровью человека или на других, адаптированных к коклюшному микробу средах.

Выросшую культуру контролируют путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Микробные клетки B. pertussis 18323 должны быть морфологически однородны. Посторонняя микрофлора должна отсутствовать.

Готовят бактериальную суспензию микробных клеток с концентрацией, соответствующей 10 МЕ по стандартному образцу мутности (разведение 1_А). Все дальнейшие разведения микробной суспензии делают в 1% растворе гидролизата казеина, содержащего 0,6% раствор натрия хлорида, pH (7,1 +/- 0,2).

Полученную суспензию разводят последовательно так, чтобы получить заражающую дозу, содержащую 100000 микробных клеток (рабочая суспензия) в объеме 0,03 мл (100 - 1000 LD₅₀). Из рабочей суспензии готовят разведения 1/10, 1/50, 1/250 и 1/1250 для определения LD₅₀ тест-штамма и проверки жизнеспособности микробов в суспензии (табл. 3).

Из пробирки 8 сразу после приготовления разведения делают посев по 0,1 мл на 3 чашки Петри со средой Борде-Жангу или КУА с кровью с целью подсчета количества содержащихся в ней живых клеток, выраженного в колониеобразующих единицах (КОЕ). Культуру помещают в термостат с температурой (36 +/- 0,5) °C на 3 - 4 сут. Для определения количества КОЕ в 30 мкл проводят подсчет выросших колоний на 3 чашках и полученное значение делят на 10. В 0,03 мл разведения из пробирки 8 должно быть не более 50 КОЕ.

При разведении и в процессе заражения суспензию хранят в холодной водяной бане (вода со льдом). Продолжительность работы с микробной суспензией не должна превышать 2,5 ч с момента приготовления смыва культуры.

Если в испытании используют высокочувствительную к коклюшным антигенам линию мышей, то заражающую дозу тест-штамма 18323 следует уменьшить до содержания 100 - 1000 LD₅₀ в объеме 0,03 мл.

Мышам, иммунизированным испытуемой вакциной и референс-препаратом, через 14 - 17 сут интрацеребрально вводят по 0,03 мл рабочей суспензии живой культуры тест-штамма B. pertussis 18323 (пробирка 4) путем прокола лобной кости в точке, расположенной в 2 мм от средней линии и на 2 мм выше глаза. Для заражения используют туберкулиновые шприцы с ценой деления 0,01 мл, используя иглу N 27, имеющую короткий срез и муфту; длина свободного конца иглы от края муфты до среза должна составлять от 3 до 4 мм. Для определения величины LD₅₀ разведения заражающей дозы (пробирки 5, 6, 7, 8) вводят контрольным мышам соответствующих групп интрацеребрально по 0,03 мл.

Мышей, погибших в течение 3 сут после заражения, исключают из опыта (неспецифическая гибель); в каждой клетке оставляют по 16 мышей.

За зараженными животными наблюдают 14 сут с ежедневной регистрацией их гибели. В день учета результатов (14-е сут) в число погибших включают также всех парализованных мышей.

Вычисление величины LD₅₀ (табл. 4) культуры тест-штамма производят по формуле Кербера:

где: D_N - максимальная из испытуемых доз;

- логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе);

Li - отношение числа животных, погибших при введении данной дозы культуры, к общему числу животных, которым эта доза была введена;

- сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.

lg LD₅₀ = lg 10⁴ - lg 5·(2,2 - 0,5) = 4,0 - 0,699·1,7 = 2,8117

LD₅₀ = 648 микробных клеток.

В заражающей дозе (10⁵ микробных клеток) содержится 648 = 154 LD₅₀

Расчет иммуногенной активности испытуемого препарата проводят по методу Вильсона и Вустера с использованием таблиц Национального института здоровья США (для n = 16) или статистическим методом с помощью программы Probit-analysis. Для проведения расчета в таблице Вильсона-Вустера (табл. 5) по вертикальной оси отмечают величину, равную сумме выживших мышей от всех 3 доз препарата (A), по горизонтальной оси - разницу между числом мышей, выживших от наибольшей и наименьшей доз, взятых в опыт (B). В месте пересечения прямых, проведенных от соответствующих величин A и B, находят ED₅₀ (верхняя цифра) и ее стандартные отклонения, выраженные в процентах (нижние цифры). Найденное значение соответствует ED₅₀ для средней иммунизирующей дозы, равной 100 мл. Для определения величины ED₅₀ в опыте, найденную в таблице величину ED₅₀ делят на 100 и умножают на значение средней иммунизирующей дозы в данном опыте. Результаты опыта считают достоверными, если стандартное отклонение средней иммунизирующей дозы не ниже 64% и не выше 157% от найденного значения ED₅₀.

Примеры расчета количества МЕ в 1 мл по методу Вильсона и Вустера приведены в табл. 6.

Средняя иммунизирующая доза референс-препарата, выраженная в мл (0,0033 мл), содержит 0,1 МЕ (табл. 6). При определении ED₅₀ референс-препарата используют значение средней иммунизирующей дозы, выраженное в МЕ.

Количество МЕ в 1 мл вакцины определяют по формуле:

Доверительный интервал значения иммуногенности (МЕ/мл) препарата рассчитывают по формулам:

где R - количество МЕ в 1 мл препарата;

R_мин - нижний предел доверительного интервала;

R_макс - верхний предел доверительного интервала;

K - доверительный коэффициент.

где S₁ = (lg ED₅₀)_макс. - lg ED₅₀ для более иммуногенного препарата при избранном уровне существенности различия - 95 или 99%;

S₂ = lg ED₅₀ - (lg ED₅₀)_мин. для менее иммуногенного препарата.

Для примера:

K = 1,6

Отсюда:

Таким образом, в 1 мл вакцины содержится 9,0 МЕ с доверительным интервалом от 5,6 до 14,4 МЕ.

Если в первом опыте активность препарата не соответствует установленным требованиям, опыт повторяют. В этом случае при вычислении количества МЕ в 1,0 мл препарата учитывают результаты всех достоверных опытов (не более 3). Используют расчет средней геометрической (Xгеом.) величины значения по формуле:

где П_x - произведение усредняемых величин;

n - число определений.

Критерии достоверности теста:

- ED₅₀ референс-препарата и испытуемой вакцины лежит в интервале между наибольшей и наименьшей иммунизирующими дозами;

- LD₅₀ не превышает 1000 микробных клеток;

- заражающая доза микробных клеток содержит не менее 100 и не более 1000 LD₅₀;

- в 0,03 мл разведения из пробирки 8 содержится не более 50 КОЕ.