"ОФС.1.2.1.0028.18. Общая фармакопейная статья. Молекулярно-массовое распределение декстранов"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I")

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод изучения молекулярно-массового распределения и определения средней молекулярной массы декстранов 40, 60 и 70. Определение проводят методом гель-фильтрационной хроматографии в соответствии с ОФС "Эксклюзионная хроматография" и согласно условиям, описанным ниже.

Испытуемый раствор. Раствор испытуемого декстрана в подвижной фазе с концентрацией 20 мг/мл.

Маркерный раствор для определения рабочего объема колонки. 5 мг глюкозы и 2 мг CO высокомолекулярного декстрана (M_w ~= 2000 кДа) растворяют в 1 мл подвижной фазы.

Калибровочные растворы. Из отдельных навесок CO декстранов для калибровки с различными молекулярными массами готовят серию калибровочных растворов в подвижной фазе (концентрация декстрана 20 мг/мл), соответствующих калибровочному диапазону для среднемассовой молекулярной массы от 4 до 250 - 270 кДа. Серия калибровочных растворов должна включать в себя не менее 5 растворов, приготовленных с использованием узкодисперсных CO декстранов для калибровки, охарактеризованных по значениям среднемассовой молекулярной массы (M_w) и массы, соответствующей максимуму хроматографического пика (M_макс., M_p).

Раствор для проверки пригодности системы. Раствор CO декстрана 40 для проверки пригодности системы, или CO декстрана 60/70 для проверки пригодности системы, или CO декстрана 70 для проверки пригодности системы (в соответствии с испытуемым декстраном) в подвижной фазе с концентрацией 20 мг/мл.

Условия хроматографического анализа.

Подвижная фаза: 7,1 г/л (50 мМ) раствор натрия сульфата безводного в воде с добавкой 0,2 г/л (0,02%) натрия азида.

Детектирование: дифференциальное рефрактометрическое.

Температура оптического блока детектора: 40 °C.

Хроматографические колонки: три последовательно соединенные хроматографические колонки (длина 300 мм, внутренний диаметр 7,5 - 8 мм), заполненные частицами гидроксилированного полиметакрилата (7 - 17 мкм): две колонки, заполненные частицами диаметром 10 - 17 мкм (размер пор ; предел эксклюзии, определенный по декстрану, ~= 2500 - 4000 кДа), одна колонка, заполненная частицами диаметром 7 - 17 мкм (размер пор ; предел эксклюзии, определенный по декстрану, ~= 60 - 100 кДа).

Скорость потока подвижной фазы: 0,5 - 1,0 мл/мин.

Температура колонок: 25 °C.

Объем вводимой пробы: 50 - 100 мкл.

Время хроматографирования: в 1,1 раза больше времени удерживания пика глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки.

Хроматографируют маркерный раствор для определения рабочего объема колонки, получая не менее 3 последовательных хроматограмм. На хроматограмме должны присутствовать два основных пика: первый пик соответствует высокомолекулярному декстрану, второй пик соответствует глюкозе. Объем элюирования пика высокомолекулярного декстрана (определенный в вершине пика) соответствует "мертвому" объему колонки (V₀), а объем элюирования пика глюкозы соответствует полному объему элюента в колонке (V_t).

Хроматографируют каждый из калибровочных растворов. На каждой полученной хроматограмме аккуратно интегрируют пик декстрана. Каждый пик декстрана, а также пик глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки, делят равноудаленными перпендикулярами на p частей (p >= 60), соответствующих равным объемам элюирования. Разбиение пиков на части и все последующие расчеты молекулярно-массового распределения, согласно представленному ниже алгоритму, выполняют, используя специализированное программное обеспечение в автоматическом режиме.

Для каждой i-ой части пика , соответствующей объему элюирования V_i, измеряют высоту (y_i) от базовой линии хроматограммы и рассчитывают коэффициент распределения (K_i) по формуле (1):

где V₀ - "мертвый" объем (предел эксклюзии) колонки, определенный по пику высокомолекулярного декстрана на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки;

V_t - полный объем элюента в колонке, определенный по пику глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки;

V_i - объем элюирования i-ой части пика декстрана на хроматограммах каждого из калибровочных растворов (или i-ой части пика глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки).

Аналогичным образом для пиков каждого из калибровочных декстранов и глюкозы по формуле (1) рассчитывают коэффициент распределения K_макс., соответствующий вершине пика. Используя подходящее программное обеспечение строят зависимость полученных значений K_макс. (ось абсцисс) от заявленной молекулярной массы в максимуме пика (M_макс.) каждого из декстранов, использованных для калибровки, и глюкозы (ось ординат). Полученную зависимость аппроксимируют уравнением вида (2). Используя значения K_i, рассчитанные по уравнению (1) для соответствующих частей пиков калибровочных декстранов и глюкозы, вычисляют значения M_i, а затем, значения M_w по уравнениям (2) и (3).

где p - число частей, на которые поделен хроматографический пик;

y_i - высота i-ой части пика над базовой линией;

M_i - молекулярная масса i-ой части пика;

- расчетное значение среднемассовой молекулярной массы.

Рассчитанные значения для калибровочных декстранов и глюкозы сравнивают с паспортными значениями. При необходимости, используя подходящие программное обеспечение и алгоритм аппроксимации калибровочной кривой нелинейным методом наименьших квадратов (например, методом Гаусса-Ньютона), выполняют итерационный подбор коэффициентов b₁ - b₅ в уравнении (2), добиваясь выполнения условий пригодности калибровки (см. раздел "Проверка пригодности системы и калибровки").

Хроматографируют раствор для проверки пригодности системы и рассчитывают значение среднемассовой молекулярной массы декстрана по уравнениям (2) и (3), как описано выше.

Рассчитывают среднемассовую молекулярную массу 10% высокомолекулярной фракции декстрана по уравнению (4):

n определяется из выражений (5) и (6):

где p - число частей, на которые поделен хроматографический пик;

y_i - высота i части пика над базовой линией;

M_i - молекулярная масса i части пика.

Рассчитывают среднемассовую молекулярную массу 10% низкомолекулярной фракции декстрана по уравнению (7):

n определяется из выражений (8) и (9):

где p - число частей, на которые поделен хроматографический пик;

y_i - высота i части пика над базовой линией;

M_i - молекулярная масса i части пика.

Хроматографическая система и калибровка считаются пригодными, если:

- относительное стандартное отклонение для значений V₀, V_t и отношения , рассчитанное по серии последовательных хроматограмм (n >= 3) раствора для определения рабочего объема колонки не превышает 1%;

- фактор асимметрии, рассчитанный для пика глюкозы, не превышает 1,3;

- рассчитанные значения отличаются от соответствующих сертифицированных значений M_w в пределах +/- 5% для каждого стандартного образца декстрана, а расчетное значение M_w глюкозы составляет 180 +/- 2 Да. При этом среднее значение отклонения декстранов, рассчитанное из модулей индивидуальных отклонений, не должно превышать 3%;

- полученное значение среднемассовой молекулярной массы декстрана для проверки пригодности системы лежит в пределах от 39000 до 47000 Да в случае CO декстрана 40 для проверки пригодности; от 67000 до 75000 Да в случае CO декстрана 60/70 для проверки пригодности и от 65000 до 74000 Да в случае CO декстрана 70 для проверки пригодности;

- полученное значение среднемассовой молекулярной массы 10% высокомолекулярной фракции декстрана для проверки пригодности системы лежит в пределах от 110000 до 135000 Да в случае CO декстрана 40 для проверки пригодности; от 190000 до 230000 Да в случае CO декстрана 60/70 для проверки пригодности и от 180000 до 240000 Да в случае CO декстрана 70 для проверки пригодности;

- полученное значение среднемассовой молекулярной массы 10% низкомолекулярной фракции декстрана для проверки пригодности системы лежит в пределах от 6000 до 9000 Да в случае CO декстрана 40 для проверки пригодности; от 7000 до 11000 Да в случае CO декстрана 60/70 для проверки пригодности и от 7000 до 11000 Да в случае CO декстрана 70 для проверки пригодности;

Хроматографируют испытуемый раствор, определяют значение среднемассовой молекулярной массы (M_w) по уравнениям (2) и (3) и значения M_w для 10% высокомолекулярной и 10% низкомолекулярной фракций декстрана по уравнениям (4) - (6) и (7) - (9) соответственно.