Фармакопейная статья "Вакцина лептоспирозная концентрированная инактивированная жидкая. ФС.3.3.1.0014.15"
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том III")

Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину лептоспирозную концентрированную инактивированную жидкую, суспензию для подкожного введения, представляющую собой смесь инактивированных формальдегидом концентрированных культур лептоспир 4 серогрупп (Leptospira interrogans Icterohaemorrhagiae copenhageni, L. interrogans Grippotyphosa grippotyphosa, L. interrogans Pomona mozdoc, L. interrogans Sejroe sejroe).

Вакцина предназначена для профилактики лептоспироза и вызывает развитие специфического иммунитета продолжительностью до 1 года,

Все этапы производства вакцины должны гарантировать соблюдение установленных надлежащих правил, а также качество лекарственного препарата, гарантирующее его безопасность для человека.

Технология производства вакцины лептоспирозной концентрированной инактивированной жидкой предусматривает приготовление питательной среды Терских с кроличьей сывороткой, приготовление полусинтетической среды с альбумином сыворотки крови человека; высев на питательную среду и накопление концентрированной микробной массы штаммов 4 серогрупп лептоспир; сведение стандартизованной микробной массы в вакцину; розлив и упаковку препарата. Производственные штаммы лептоспир должны расти на питательной среде Терских с кроличьей сывороткой и полусинтетической питательной среде с альбумином сыворотки крови человека; быть подвижными; обладать типичными культуральными, морфологическими и антигенными свойствами; быть специфичными в реакции микроагглютинации (РМА) с иммунной сывороткой и иммуногенными для золотистых хомячков.

В качестве консерванта используется формальдегид.

На стадиях производства вакцины проводят определение роста лептоспир, чистоты культуры, подвижности лептоспир, концентрации микробной массы, подлинности, стерильности, специфической стерильности, безвредности, токсичности, специфической активности и содержания формалина.

Описание. Бесцветная слегка опалесцирующая жидкость с осадком, легко разбивающимся при встряхивании.

Подлинность. Вакцина должна вызывать у золотистых хомячков образование специфических антител, выявляемых в РМА со штаммами лептоспир 4 серогрупп (L. interrogans Icterohaemorrhagiae copenhageni, L. interrogans Grippotyphosa grippotyphosa, L. interrogans Pomona mozdoc, L. interrogans Sejroe sejroe) в титре не менее чем 1:100.

Методика проведения испытания описана в разделе "Специфическая активность".

Прозрачность. Показатель оптической плотности препарата должен быть не менее 0,03. Определение проводят фотометрическим методом. Испытуемый образец тщательно перемешивают, помещают в кювету с толщиной слоя 3 мм и измеряют оптическую плотность при длине волны 315 нм по сравнению с водой очищенной.

Механические включения. Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

pH. От 7,2 до 7,6. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия". Для испытания используют содержимое 5 образцов.

Извлекаемый объем. Не менее номинального. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения".

Время седиментационной устойчивости. Суспензия не должна расслаиваться в течение 5 мин. Определение проводят в соответствии с ОФС "Лекарственные формы для парентерального применения".

Размер частиц. Должна свободно проходить в шприц через иглу N 0840. Определение проводят в соответствии с ОФС "Лекарственные формы для парентерального применения".

Формальдегид. Не более 0,03%. Определение проводят колориметрическим методом в соответствии с ОФС "Количественное определение формальдегида в иммунобиологических лекарственных препаратах".

Стерильность. Должна быть стерильной. Определение проводят в соответствии с ОФС "Стерильность" методом прямого посева.

Специфическая стерильность. Не должна содержать живых лептоспир. Определение проводят путем высева по 0,2 мл вакцины в 3 бактериологические пробирки с 7 мл фосфатно-сывороточной среды Терских.

Состав среды Терских (на 1 л):

- натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,85 г;

- калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,25 г;

- вода очищенная - 950 мл;

- сыворотка крови кролика нормальная инактивированная - 50 мл.

Пробирки с посевами инкубируют при температуре () °С в течение 20 сут. Затем делают из выделенных культур мазки по методике, указанной в разделе "Специфическая безопасность".

Просматривают не менее 30 полей зрения в темном поле микроскопа при увеличении 200^x. В посевах не должны обнаруживаться живые (подвижные) лептоспиры. При обнаружении живых лептоспир хотя бы в 1 посеве препарат считают не выдержавшим испытание.

Аномальная токсичность. Должна быть нетоксичной. Вакцину вводят животным по 0,5 мл: белым мышам внутрибрюшинно, морским свинкам - подкожно. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность".

Специфическая безопасность. Должна быть безопасной, не содержать живых лептоспир.

Для проведения испытания используют золотистых хомячков массой () г. Трем животным однократно внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл вакцины. Наблюдение за животными ведут в течение 20 сут. К концу срока хомячков обескровливают декапитацией. Кровь используют для получения иммунной сыворотки и исследования ее в РМА при определении специфической активности вакцины. После обескровливания животных проводят их вскрытие и затем пастеровской пипеткой делают посев коркового слоя почек в бактериологические пробирки со средой Терских.

Вскрытие животных и забор материала для посева проводят при строгом соблюдении правил асептики. Посевы инкубируют в течение 7 сут. в термостате при температуре () °С. Затем отбирают 0,02 мл микробной взвеси и просматривают не менее 30 полей зрения в темном поле микроскопа при увеличении 200^x. При обнаружении роста лептоспир хотя бы в 1 посеве вакцину считают не выдержавшей испытание.

Специфическая активность. Препарат должен обладать специфической иммуногенной активностью - вызывать у золотистых хомячков образование специфических антител, выявляемых в РМА со штаммами лептоспир 4 серогрупп в титре не менее чем 1:100; защищать не менее 3 из 4 животных от заражения вирулентной культурой L. interrogans Icterohaemorrhagiae copenhageni. Трем золотистым хомячкам массой () г однократно внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл вакцины. Через 20 сут. после иммунизации животных обескровливают декапитацией. Кровь собирают во флаконы (пробирки) и инкубируют в термостате в течение 30-40 мин при температуре () °С, затем выдерживают в холодильнике при температуре () °С в течение 24-48 ч. Полученную иммунную сыворотку отбирают в стерильные пробирки и исследуют в РМА для выявления специфических антител к штаммам лептоспир 4 серогрупп, входящих в состав вакцины.

Проведение РМА. РМА ставят в лунках полистиролового планшета. В лунки с A1 по A4 вносят по 0,2 мл анализируемой сыворотки, разведенной 1:25 0,9% раствором натрия хлорида. В лунки с В1-В4 по F1-F4 вносят по 0,1 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Разведение сыворотки осуществляют автоматической пипеткой в направлении лунок от A к F (в вертикальном ряду), перенося по 0,1 мл каждого разведения в следующую в ряду лунку, получая таким образом разведения сыворотки с 1:25 до 1:800.

В качестве антигенов используют 7-12-суточные культуры лептоспир 4 серогрупп (L. interrogans Icterohaemorrhagiae copenhageni, L. interrogans Grippotyphosa grippotyphosa, L. interrogans Pomona mozdoc, L. interrogans Sejroe sejroe), выращенные на среде Терских. При нанесении 0,02 мл культуры каждой серогруппы на предметное стекло количество лептоспир должно быть не менее 100-150 клеток в поле зрения микроскопа при увеличении 200^x.

После разведения сыворотки в каждый ряд лунок от A1 до F1, от A2 до F2, от A3 до F3 и от A4 до F4 вносят по 0,1 мл культуры лептоспир соответствующей серогруппы. После добавления антигенов получают разведение сывороток от 1:50 до 1:1600 в каждом вертикальном ряду. Одновременно проводят контроль культур: в 4 лунки (H1, H2, H3, H4) вносят по 0,1 мл 0,9% раствора натрия хлорида и по 0,1 мл живой культуры лептоспир каждой серогруппы в отдельности. Планшет выдерживают в течение 1 ч при температуре () °С. Из лунок планшета с определенной серогруппой отбирают по 0,02 мл смеси сыворотки и культуры лептоспир, наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют в темном поле зрения при увеличении 200^x.

Результаты реакции оценивают по условной "трехкрестовой системе":

+ - 1/3 лептоспир агглютинированы;

++ - от 1/3 до 2/3 лептоспир агглютинированы;

+++ - более 2/3 или все лептоспиры агглютинированы;

контроль - агглютинация отсутствует, все клетки лептоспир находятся в свободном состоянии и полностью подвижны.

Положительной РМА с живыми культурами лептоспир 4 серогрупп считается реакция не менее чем на "+".

Тест активной защиты. Четырем золотистым хомячкам массой () г однократно внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл вакцины. Через 20 сут. 4 иммунизированных и 4 неиммунизированных (контрольных) животных заражают внутрибрюшинно вирулентной культурой L. interrogans Icterohaemorrhagiae copenhageni с содержанием 100-150 лептоспир в поле зрения микроскопа (200^x) в объеме 1 мл. Наблюдение за животными ведут в течение 7 сут.

В контрольной группе не менее 3 животных должны заболеть или погибнуть, 3 из 4 иммунизированных и зараженных животных не должны заболеть или погибнуть. Если выживают и гибнут менее 3 иммунизированных и зараженных животных соответственно, испытание повторяют. При получении аналогичных результатов вакцину считают не выдержавшей испытание.

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты".

Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8 °С.