"МР 1.2.2028-05. Методические рекомендации. Использование неинвазивных методов контроля антиокислительного баланса организма в мониторинговых гигиенических исследованиях"
(утв. Роспотребнадзором 17.10.2005)

1. Разработаны ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана под руководством академика РАМН, профессора А.И. Потапова. В разработке методических рекомендаций принимали участие: академик РАМН, профессор В.Н. Ракитский, д.б.н., профессор Т.В. Юдина, к.б.н. М.В. Егорова, к.б.н. М.В. Ларькина.

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 17.10.05.

Неинвазивные методы контроля антиокислительного баланса организма предлагаются для мониторинговых и скрининговых гигиенических исследований, связанных с оценкой действия неблагоприятных факторов среды обитания на формирование неспецифической резистентности организма человека.

Здоровье человека, наряду с социально-экономическими и другими факторами, во многом определяется уровнем функционирования антирадикальной защиты организма, снижение резервов которой непосредственно отражается на состоянии антиокислительного статуса - одного их центральных звеньев в молекулярных механизмах формирования неспецифической резистентности к действию повреждающих факторов среды обитания. В этом плане для целей медико-биологического мониторинга крайне важна оценка функциональных резервов организма, а также возможность выявления отклонений в их состоянии на начальных стадиях.

Ранее в ФНЦ гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана был разработан способ оценки адаптационных возможностей организма, включающий установление уровня интегрального показателя резистентности, позволяющего охарактеризовать отношение интенсивности процессов свободно-радикального окисления (СРО) и антиокислительной активности (АОА) при исследовании неинвазивной биосреды - конденсата альвеолярной влаги (экспирата). Создана шкала оценки АОС по показателю интенсивности радикалообразования, позволяющая выявить глубину отклонений, обосновать направления профилактических мероприятий, в т.ч. с применением комплекса антиоксидантных препаратов.

Данный способ включает применение двух методов: хемилюминесцентного (ХЛ) для оценки интенсивности радикалообразования (ИР) и фотометрического для определения супероксидперехватывающей активности.

В настоящих методических рекомендациях предложен новый подход к оценке антиокислительного баланса, основанный на определении параметров кинетики процесса радикалообразования при исследовании индуцированной перекисью водорода люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) экспирата.

Известно, что СРО основано на механизме цепной реакции, описанной в фундаментальных работах, посвященных ХЛ, при этом одной из реакций, сопровождаемых свечением, является диспропорционирование пероксидных радикалов. Изменение интенсивности ХЛ во времени отражает изменение скорости СРО. Установление параметров кинетики ХЛ позволяет определить как интенсивность радикалообразования, так и оценить проявление антиокислительной активности, мерой которой служит латентный период ХЛ - промежуток времени от момента введения в систему инициатора перекисного окисления (перекиси водорода, двухвалентного железа) до начала вспышки ХЛ.

Отличительной чертой разработанного способа контроля АО-баланса является использование для характеристики антирадикальной защиты отношения (В) двух кинетических показателей индуцированной ХЛ - времени достижения максимального сигнала и спада его наполовину (рис. 1 - здесь и далее рисунки не приводятся). При оценке уровня радикалообразования учитывают величину спонтанной ХЛ, вводя ее значение при расчете индекса активации радикалообразования (А), определяемого как отношение максимальных величин индуцированной и спонтанной ХЛ. Критерием оценки является показатель К = В / А, значения которого, меньшие 1,0, свидетельствуют о нарушении АО-баланса и преобладании процессов радикалообразования, приводящих к формированию функциональных отклонений в организме.

Помимо нового способа контроля приемлем и способ экспрессной оценки АОС.

Предложен метод неинвазивной оценки антиокислительного баланса организма, заключающийся в сборе экспирата и определении в нем показателей, отражающих уровни радикалообразования и антирадикальной защиты, отличающийся тем, что определяют максимальную величину интенсивности индуцированной перекисью водорода хемилюминесценции, максимальную величину спонтанной хемилюминесценции, рассчитывают индекс активации А = И / И_сп, где: И - максимальная величина интенсивности хемилюминесценции, И_сп - величина спонтанной хемилюминесценции, устанавливают время достижения максимальной величины хемилюминесценции и рассчитывают отношение В = Т₁ / Т₂, где Т₁ - время достижения максимальной величины хемилюминесценции, Т₂ - время спада максимальной величины хемилюминесценции наполовину, и коэффициент К = В / А, где: В - отношение времени достижения максимального сигнала к времени спада его наполовину, А - отношение максимальных величин индуцированной и спонтанной хемилюминесценции, и при значении К < 1 определяют нарушение антиокислительного баланса, что подтверждено патентом RU 2206891 С1, приоритет от 16.10.01, выдан 20.06.03.

Показаниями к использованию метода являются:

- необходимость оценки антиокислительного баланса с целью выбора адекватных курсов коррекции антиокислительного статуса при проведении индивидуальных обследований;

- проведение мониторинговых и скрининговых гигиенических обследований различных контингентов с целью установления возможного негативного воздействия ряда антропогенных факторов на организм;

- формирование групп риска для проведения комплекса профилактических мероприятий;

- оценка эффективности применения лечебных и профилактических мероприятий по коррекции нарушений антиокислительного баланса.

Противопоказаний нет. Следует учитывать возможность искажения результатов при обследовании лиц, потребляющих большое количество жиров или принимающих медикаментозные средства, способные влиять на концентрацию липидов. Перед обследованием даются соответствующие инструкции.

Допускается использование других приборов и оборудования, разрешенных к применению в установленном порядке с аналогичными техническими характеристиками.

Неинвазивный контроль антиокислительного баланса организма базируется на кинетических закономерностях индуцированной хемилюминесценции экспирата, позволяющих оценить интенсивность процессов радикалообразования и антирадикальной защиты организма.

Выполнение метода предусматривает следующие основные этапы:

- отбор проб экспирата у обследуемого контингента;

- установление количественных параметров кинетики хемилюминесценции;

- оценку состояния антиокислительного баланса.

Приемы и техника проведения анализа, на которых базируются методические рекомендации, разработаны впервые и защищены авторскими свидетельствами об изобретении и патентами (SU 1811608 A3, RU 2206891 С1).

Отбор проб экспирата производят в модернизированный поглотитель Полежаева, помещенный в емкость со смесью льда и хлористого натрия для более полной конденсации. Влагу отбирают в течение 20 - 25 мин. при нефорсированном дыхании до достижения объема 1,0 - 1,5 мл. Конденсат переводят в полиэтиленовые пробирки для микропроб, плотно закрывают и при необходимости хранения помещают в морозильное отделение бытового холодильника. Образцы экспирата могут сохраняться в замороженном виде в защищенном от света месте в течение года.

Анализ проб проводят после отбора проб или после размораживания. Повторное замораживание проб не допускается.

8.1. Фосфатный буферный раствор: 0,85 г калия хлористого (115 мМ) и 0,272 г калия фосфорно-кислого однозамещенного (20 мМ) растворяют в 100 мл дистиллированной воды. С помощью рН-метра при непрерывном перемешивании раствора устанавливают рН буферной смеси (7,3 - 7,4), при необходимости добавляя 0,1 н раствор HCl для уменьшения pH или NaOH для увеличения значения рН.

8.2. Раствор перекиси водорода 10%-й готовят каждые 2 ч из 30%-й перекиси водорода соответствующим разведением дистиллированной водой и хранят в снежной бане в темноте.

8.3. Раствор люминола: 3 мг люминола добавляют в сильнощелочную среду (1/3 гранулы гидроксида натрия, растворенные в 10 мл дистиллированной воды) и доводят объем до 50 мл. Раствор имеет рН 7,3 - 7,4.

В термостатируемую при 37 °С темновую камеру хемилюминометра помещают кювету с 1 мл фосфатного буфера и 50 мкл раствора люминола, в течение 10 - 20 с регистрируют фоновое свечение, после чего в кювету добавляют 0,2 мл исследуемой пробы и в течение 1 - 2 мин. при непрерывном перемешивании измеряют интенсивность спонтанной хемилюминесценции. Затем, не вынимая кювету из темновой камеры, вводят 0,2 мл раствора перекиси водорода в качестве активирующего агента - и немедленно, также при непрерывном перемешивании, начинают регистрацию изменений интенсивности хемилюминесценции, отмечая максимум и продолжая снятие показаний до момента снижения максимальной величины не менее чем наполовину.

Регистрацию интенсивности хемилюминесцентного свечения производят в зависимости от возможностей аппаратуры - на ПК ЭВМ, на самописец или же, фиксируя значения интенсивности в журнале через каждые 5 с. В последнем случае необходимо по полученным значениям построить кривую хемилюминесценции - график зависимости интенсивности хемилюминесценции от времени для каждого из исследуемых образцов.

Одновременно проводят контрольные измерения с добавлением в кювету вместо исследуемой пробы аналогичного количества (0,2 мл) буферного раствора.

По полученным кривым хемилюминесценции, соответствующим образцам или контрольным пробам (рис. 1), устанавливают следующие показатели.

Параметры интенсивности хемилюминесценции:

- средний уровень спонтанного свечения образца - И_сп;

- максимальное значение сигнала индуцированной хемилюминесценции, фиксируемое сразу после введения инициатора (перекиси водорода) - И_макс.

Параметры кинетики хемилюминесценции:

- время от введения инициатора до достижения максимальной интенсивности хемилюминесценции - Т₁;

- время, необходимое для спада интенсивности индуцированной хемилюминесценции на половину максимальной величины - Т₂.

Значения показателей выражают в единицах измерения, одинаковых для сопоставляемых параметров: в единицах показаний хемилюминометра, в секундах или в миллиметрах по диаграммной ленте самописца.

Далее по параметрам интенсивности хемилюминесценции рассчитывают индекс активации радикалообразования (А) как отношение индуцированного сигнала хемилюминесценции к спонтанному:

где:

И_макс - максимальное значение сигнала индуцированной хемилюминесценции;

И_сп - уровень спонтанного свечения образца;

устанавливают отношение кинетических параметров:

где:

Т₁ - время от введения инициатора до достижения максимальной интенсивности хемилюминесценции;

Т₂ - время спада интенсивности хемилюминесценции на половину максимальной величины;

рассчитывают значение критерия оценки антиокислительного баланса:

где:

В - отношение времени достижения максимального сигнала к времени спада его наполовину;

А - отношение максимальных величин индуцированной и спонтанной хемилюминесценции.

Все параметры как определенные по кривой формирования хемилюминесценции, так и рассчитанные, выражают в относительных единицах к соответствующим параметрам контрольной (холостой) пробы.

Характеристика антиокислительного статуса в целом включает ряд параметров, значение каждого из которых носит самостоятельный информативный характер (табл. 1). На схеме (рис. 2) приведена последовательность проведения диагностики антиокислительного баланса. Возможные заключения и рекомендации представлены на той же схеме и в табл. 2.

Нарушения неспецифической резистентности организма по состоянию антиоксидантного статуса могут быть установлены экспрессным способом на основании интегрального показателя интенсивности радикалообразования, определяемого как светосумма индуцированной хемилюминесценции экспирата, и установленной эмпирической зависимости между показателями свободнорадикального окисления - интенсивностью радикалообразования и супероксидперехватывающей активностью.

Светосумма (S) рассчитывается путем измерения площади под кинетической кривой сигнала хемилюминесценции (кв. мм) при регистрации его на самописце или сложения показаний интенсивности хемилюминесценции (в ед. показаний хемилюминометра) за определенный выбранный период времени (1 - 2 мин.), достаточный для спада хемилюминесцентного сигнала.

Светосумма индуцированной хемилюминесценции исследуемой (ИР_пр) - или холостой (ИР_хол) пробы рассчитывается как

где:

ИР_сп - интенсивность спонтанного свечения исследуемой (или холостой) пробы за тот же период.

За основной показатель интенсивности радикалообразования (ИР) принимают отношение светосуммы индуцированной хемилюминесценции исследуемой и холостой проб:

где:

ИР_пр - светосумма индуцированной хемилюминесценции исследуемой пробы;

ИР_хол - светосумма индуцированной хемилюминесценции холостой пробы.

Экспресс-оценку проводят в соответствии со шкалой оценки антиокислительного статуса, представленной в табл. 3.

При интерпретации результатов особое внимание должно быть обращено на обследуемых с повышенными значениями показателя ИР, что указывает на истощение защитных резервов организма, требующее подбора и применения комплекса мер профилактики, включающего антиоксидантную коррекцию.

Условные обозначения: А - индекс активации радикалообразования; В - индекс кинетических показателей формирования индуцированной антиокислительной хемилюминесценции.

Для коррекции нарушений антиокислительного баланса применяют антиоксиданты широкого профиля, что позволяет снижать уровень радикалообразования, однако в очень незначительной степени влиять на супероксидперехватывающую активность как многокомпонентную функциональную систему. Одним их путей повышения антирадикальной активности, обладающим и более устойчивым во времени эффектом, является сбалансированное питание. Наиболее адекватные способы коррекции антиоксидантного баланса включают достижение сбалансированности микроэлементного состава внутренней среды организма, тесно связанного с состоянием свободнорадикального окисления при антиоксидантно-нутриционной поддержке организма.

К положительному эффекту разработки следует отнести:

- создание неинвазивного метода контроля, позволяющего оценить состояние одной их важнейших составляющих гомеостаза организма;

- относительную простоту выполнения способа при его высокой информативности;

- достаточную точность при формировании групп риска;

- выявление преимущественного характера нарушения про- и антиоксидантного равновесия (преобладание усиленного радикалообразования, недостаток емкости антиоксидантной защиты, одновременные отклонения этих двух показателей);

- возможность выбора оптимального пути коррекции нарушений антиокислительного статуса и динамической оценки его состояния по данным лабораторного контроля в диагностических целях и мониторинговых исследованиях.

Для подтверждения эффективности предлагаемого метода представлены результаты двух способов - по интегральному показателю интенсивности радикалообразования (первый способ) и по основным параметрам кинетики хемилюминесценции (второй способ) на примере обследования 16 школьников 8 - 10 лет Тазовской школы-интерната из региона Крайнего Севера (п-ов Ямал).

Отбор образцов экспирата проводили в соответствии с п. 6, определение параметров хемилюминесценции - по п. 8, интенсивность радикалообразования - по п. 9. Результаты определения параметров хемилюминесценции и сопоставительная оценка антиокислительного баланса организма школьников приведены в табл. 4 и 5.

Оценка как по первому, так и по второму способу показала, что из 16 обследованных антиокислительный статус не изменен в двух случаях, у остальных 14 человек констатировано усиление прооксидантных процессов, срыв адаптационных механизмов, что является основанием для включения в группу риска и проведения лечебно-профилактических мероприятий.

Условные обозначения: И_сп - интенсивность спонтанной хемилюминесценции; И_макс - максимальное значение индуцированной хемилюминесценции; Т₁ - время достижения максимального значения сигнала хемилюминесценции; Т₂ - время спада максимального значения наполовину; А - индекс активации радикалообразования; Т - отношение временных параметров Т₁ и Т₂; ИР - интенсивность радикалообразования (светосумма).

Показатели сопоставительной оценки:

1 - отсутствие нарушений в системе про- и антиоксидантного равновесия;

2 - нарушение АО-баланса, показание к включению в группу риска:

2.1 - активизация прооксидантных процессов в организме;

2.2 - снижение емкости антиоксидантной защиты;

2.3 - срыв адаптационных механизмов (изменение двух сторон СРО) показание к проведению лечебно-профилактического курса;

3 - нарушения АО-баланса, обусловленные высоким (низким) исходным уровнем радикалообразования:

3.1 - возможное острое заболевание;

3.2 - возможно протекание хронического процесса.

Рекомендуется углубленное клинико-диагностическое обследование.

Контроль по второму способу позволил более детально подойти к оценке антиокислительного статуса, а именно:

- выявить случаи нарушения антиокислительного баланса (25% от общего числа обследуемых), характерные для протекания острых или хронических процессов и рекомендовать углубленное медицинское обследование;

- установить характер нарушения про- и антиоксидантного равновесия у обследованных (преобладание усиленного радикалообразования, недостаток емкости антиоксидантной защиты, одновременные отклонения этих двух показателей) для выбора оптимального пути коррекции антиокислительного статуса.

В первом способе оценивается только одна из двух составляющих свободнорадикального окисления - интенсивность радикалообразования. Оценка антиокислительного баланса базируется на эмпирических зависимостях, полученных при обобщении данных по значительным контингентам обследованных разных климатических зон, возрастов, социально-экономических условий в соответствии с разработанной шкалой (табл. 3).

При втором способе отношение двух составляющих свободнорадикального окисления оценивается по одновременно реально полученным показателям состояния интенсивности радикалообразования и емкости антиоксидантной защиты в изучаемой биосреде на момент исследования (табл. 2).

Использование первого способа целесообразно при скрининговых исследованиях для выделения групп риска и проведении комплекса профилактических мероприятий. Для мониторинговых исследований более оптимален второй способ как более полный и информативный при оценке действия факторов среды обитания.