"Экспресс-метод оценки токсичности проб воздуха по водорастворимым компонентам с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота. Методические рекомендации"
(утв. Минздравом РФ 30.05.2003 N 29ФЦ/2688)

Разработаны: Новосибирским НИИ гигиены, Федеральным Центром Госсанэпиднадзора РФ, Центром Госсанэпиднадзора Медицинского Центра Управления Делами Президента РФ, Центром Госсанэпиднадзора г. Москвы, Центром Госсанэпиднадзора в Воронежской области, Всероссийским научно-исследовательским и испытательным институтом медицинской техники Министерства здравоохранения Российской Федерации, Закрытым акционерным обществом Фирма "БМК-ИНВЕСТ".

Методические рекомендации предназначены для токсикологических испытаний проб воздуха, содержащего водорастворимые токсичные химические вещества. Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами для оценки токсичности проб воздуха различного происхождения. Присутствие в воздухе водонерастворимых токсичных веществ данной методикой не оценивается.

Методические рекомендации содержат описание экспресс-метода и определяют порядок проведения токсикологических испытаний проб воздуха с целью обеспечения безопасности человека.

Методические рекомендации предназначены для учреждений и организаций, занимающихся токсикологической оценкой потенциально опасной продукции, воздушной среды (атмосферного воздуха, воздуха жилых и служебных помещений, воздуха рабочей зоны) и осуществлением санитарно-эпидемиологического надзора.

2.1. Порядок разработки, экспертизы, утверждения, издания и распространения нормативных и методических документов системы санитарно-эпидемиологического нормирования. Р1.1.001-1.1.005-96.

2.2. Методические указания по осуществлению государственного санитарного надзора за устройством и содержанием жилых зданий. N 2295-81. Утверждено Минздравом СССР 24.02.81.

2.3. ГОСТ Р 8.568-97. Аттестация испытательного оборудования. Основные положения.

2.4. Биотестирование продукции из полимерных и других материалов. Методические указания МУ 1.1.037-95.

2.5. ГОСТ Р ИСО 10993.5-99. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro.

3.1. Тест-объект - объект изучения, исследования каким-либо способом, методом. По состоянию тест-объекта можно судить о свойствах его среды обитания (естественной или искусственной).

3.2. Тест-функция - изучаемая деятельность или изучаемое свойство клетки или клеток, каким-либо способом, методом.

3.3. Контрольный образец (раствор) - среда, приготовленная в установленном порядке, токсичность которой принята за основу при контроле опытного образца. Контрольный образец служит для установления степени токсичности.

3.4. Опытный образец (раствор) - среда, приготовленная в установленном порядке и подлежащая контролю.

3.5. Рабочий образец - контрольный или опытный образец с внесенным в него тест-объектом.

3.6. Индекс токсичности - величина, отражающая степень токсичности опытного образца, представляющая собой отношение величины тест-функции или результата ее преобразования для опытного образца к величине тест-функции или результату ее преобразования для контрольного образца.

3.7. Испытательное оборудование - средство испытаний, представляющее собой техническое устройство для воспроизведения условий испытаний.

Принцип методики состоит в переводе водорастворимых токсичных химических веществ, содержащихся в воздухе, в жидкую фазу и оценке ее токсичности на клеточном тест-объекте. В качестве тест-объекта выбрана кратковременная суспензионная культура подвижных клеток млекопитающих - сперма крупного рогатого скота. В качестве тест-функции взята зависимость количества подвижных клеток от времени. Индекс токсичности определен как:

Сперма быка, замороженная в жидком азоте, производится в соответствии с ГОСТ 26030-83 на станциях искусственного осеменения. Хранится и транспортируется в сосудах Дьюара, наполненных жидким азотом. Срок хранения неограничен.

Анализатор токсичности типа АТ (далее - анализатор) представляет собой испытательное оборудование, изготовленное в соответствии с Приложением 1. Принцип работы анализатора основан на подсчете подвижных сперматозоидов с использованием объектива микроскопа, компьютера, программ распознавания подвижных клеток, управления и вычисления индекса токсичности. Устройство термостатирования обеспечивает нахождение растворов при постоянной температуре (40 +/- 1,5) °C, а устройство перемещения кювет обеспечивает проведение испытаний в автоматическом режиме. Для приготовления растворов используется блок пробоподготовки, представляющий собой сухой термостат с набором гнезд для пробирок. Анализатор токсичности реализует методику контроля по контрольному образцу потребителя. В качестве кювет для помещения образцов используются капилляры, изготовленные в соответствии с Приложением 1. Аттестация анализатора проводится согласно ГОСТ Р 8.568-97.

5.1. Камера-генератор.

5.2. Поглотительный сосуд Рихтера.

5.3. Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1 мг.

5.4. Сосуд Дьюара типа СДС объемом не менее 25 л и диаметром горловины не менее 50 мм - 2 шт.

5.5. Анализатор токсичности типа АТ (Приложение 1, рекомендуемое).

5.6. Комплект кювет (Приложение 1, рекомендуемое).

5.7. Химическое оборудование:

- пробирки с притертыми пробками объемом 1 - 2 мл - 10 шт.;

- дозаторы пипеточные на объемы 1 мл, 0,2 мл и 0,1 мл;

- мерные колбы с притертыми пробками объемом 50 мл - 2 шт.;

- колбы с притертыми пробками объемом 500 мл - 2 шт.

5.7. Пинцет анатомический длиной 250 мм.

6.1. Вода дистиллированная, ГОСТ 12.4.021.

6.2. Глюкоза ч., ГОСТ 6038-74.

6.3. Цитрат натрия трехзамещенный ч., ГОСТ 22280-76.

6.4. Сперма быка, замороженная в жидком азоте, ГОСТ 26030-83.

7.1. Для проведения испытаний производится отбор проб воздуха и получение испытуемого раствора. Испытуемым раствором является вода с поглощенными и растворенными в ней летучими химическими веществами, выделяющимися из исследуемых материалов или содержащимися в воздушной среде.

7.2. Отбор проб воздуха для испытаний по данной методике следует производить до отбора проб воздуха с использованием поглотительных растворов, отличных от воды.

7.3. Опытный раствор получают в результате отбора пробы воздуха из камеры-генератора с образцами исследуемого материала или из экспериментального помещения, а также из окружающей воздушной среды. Пробу воздуха объемом 30 л отбирают со скоростью 0,6 л/мин. последовательно в два поглотительных прибора с пористой пластинкой N 1, заполненных 5 мл дистиллированной воды каждый. После отбора поглотительные растворы сливаются. Для дальнейшего анализа отбирается 8 мл раствора. В камерах-генераторах моделируются условия, требуемые для проведения санитарно-химических испытаний в соответствии с действующими СанПиН, МР, МУ и другой нормативной документацией.

8.1. Для определения индекса токсичности сравнивают опытный и контрольный растворы. В качестве контрольного раствора выбрана глюкозо-цитратная среда (глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, дистиллированная вода - 100 мл). Контрольная среда одновременно является разбавителем для оттаивания замороженной спермы. Опытным раствором является испытуемая среда, приготовленная в соответствии с п. 7, доведенная до изотонии сухими реактивами глюкозы и цитрата натрия (глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, испытуемый раствор -100 мл). Контрольный и опытный растворы по 0,4 мл помещают в пробирки с притертыми пробками и ставят в устройство термостатирования.

8.2. Оттаивают замороженную сперму. Для этого дозируют в пробирку разбавитель согласно паспорту на сперму быка и помещают ее в устройство термостатирования. Охлажденным до температуры жидкого азота анатомическим пинцетом извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и опускают ее в пробирку с нагретым разбавителем. Через каждые 1 - 2 минуты содержимое пробирки перемешивают легким встряхиванием. Через 5 - 6 минут в пробирке образуется маточная суспензия сперматозоидов.

8.3. Приготавливают рабочие, контрольный и опытный образцы. В пробирки с контрольным и опытным растворами помещают по 0,1 мл маточной суспензии сперматозоидов.

8.4. Рабочие образцы переносят в кюветы. Для уменьшения случайной ошибки для каждого рабочего образца используют выборку из 3 - 5 кювет. Кюветы устанавливают в кюветодержатель, который помещают в анализатор токсичности. Нажатием кнопки "СТАРТ" запускают процесс регистрации зависимости количества подвижных клеток от времени для рабочих контрольного и опытного образцов. Процессы, происходящие в кюветах, могут контролироваться визуально на мониторе.

Анализатор осуществляет усреднение по выборкам рабочих контрольных и опытных образцов, вычисляет индекс токсичности и коэффициенты вариации для выборок рабочих, контрольных и опытных образцов. Если c <= 0,25 для каждой из выборок, то переходят к оценке результатов испытаний. При c > 0,25 хотя бы для одной из выборок испытания повторяют, начиная с п. 8.1.

1.1. Анализатор токсичности типа АТ (далее - анализатор) представляет собой испытательное оборудование, предназначенное для оценки токсичности образцов воздуха с применением клеточного тест-объекта.

2.1. Принципиальная схема анализатора должна соответствовать приведенной на рис. 1 (здесь и далее рисунки не приводятся). Анализатор содержит кюветы (капилляры) 1, каретку 2, привод 3, блок термостатирования 4, источник излучения 5, призму 6, микрообъектив 7, систему ввода информации 8, контроллер 9, компьютер 10, монитор 11, принтер 12, блок пробоподготовки 13.

Конструктивное исполнение анализатора обеспечивает одновременное оценивание количества подвижных клеток суспензии рабочего образца и визуальное наблюдение за клетками суспензии на мониторе.

3.1. Длина волны излучения - 0,63 мкм.

3.2. Мощность излучения не более 0,1 мВт.

3.3. Время одного наблюдения от 10 до с шагом 1 с.

3.4. Время перемещения капилляра с образцом не более 2 с.

3.5. Время обратного хода каретки не более 15 с.

3.6. Отклонение температуры проб и рабочих образцов от установленного значения +/- 0,5 °C в диапазоне установки температур (35 - 45) °C с шагом 1 °C.

3.7. Основные размеры кюветы должны соответствовать приведенным на рис. 2.