"Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов"
(утв. Протоколом ВАСХНИЛ от 14.05.1986 N 2)

Методические рекомендации подготовили сотрудники лаборатории технологии клеточных культур и питательных сред Всесоюзного ордена Ленина научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко: зав. лабораторией, профессор Л.П. Дъяконов, ст. н. сотр. А.Ф. Конюхов, канд. вет. наук Е.Н. Василевич, ст. ветврач-бактериолог Ю.И. Костина, аспирант О.Ш. Расулев, ст. н. сотр. Всесоюзного научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности Госагропрома СССР (ВНИТИБП) канд. биол. наук Л.А. Коротеева.

Методические рекомендации предназначены для использования в работе НИВИ, НИВС и ветеринарно-диагностических лабораторий.

Утверждены секцией "Биология, иммунология и биотехнология в ветеринарии" Отделения ветеринарии ВАСХНИЛ, протокол N 2 от 14.5.86 г.

Виноградова И.Н. (1973) предлагает следующую классификацию питательных сред, применяемых для бактериологической диагностики:

1. Среды для культивирования: универсальные простые и сложные специальные; для токсинообразования.

2. Среды для выделения и накопления: консервирующие, обогащения и элективные.

3. Среды для идентификации: дифференциальные и элективно-дифференциальные.

Байрак В.А. с соавторами (1980) по назначению выделяют среды обычные, или простые, для выращивания большинства микроорганизмов; специальные - для культивирования микробов, не растущих или плохо растущих на обычных питательных средах; дифференциально-диагностические - употребляемые для определения родовых или видовых особенностей исследуемых бактериальных культур (гемолитических, сахаролитических, протеолитических, редуцирующих и других свойств); селективные - для выделения микробов одного рода или вида из материала, содержащего смесь разных видов микроорганизмов, на которых одни виды хорошо растут, а другие не растут; среды обогащения (накопительные).

Питательные среды применяют для выращивания микробов, выделения их в чистой культуре, изучения ряда свойств микробов и длительного сохранения свежевыделенных и производственных культур (Биргер М.О./ред./, 1982).

Бактерии, как и другие организмы, нуждаются для своего роста в определенных питательных веществах. В состав таких питательных веществ должны входить все те химические элементы, которые необходимы для построения клеточного материала, для активности ферментов и для работы транспортных систем. Кроме того, питательные вещества должны поставлять организму материал, используемый для генерирования биологически полезной энергии (Готтшалк Г., 1982).

Питанием называют использование питательных веществ, необходимых для роста организма (Джавец Э. с соавтор., 1982).

Доноры водорода (H+). Все способные к химическому синтезу организмы нуждаются в источнике энергии, в доноре H⁺ (т.е. веществе, способном к окислению). Кроме того, фотосинтезирующие организмы нуждаются в донорах H⁺ для осуществления фотосинтеза.

Акцепторы водорода. Акцепторы H⁺ необходимы для окислительно-восстановительных реакций, проходящих с образованием энергии. Для аэробов требуется газообразный кислород (O₂). Анаэробы нуждаются в других неорганических веществах (сульфатах, нитритах, карбонатах) или органических соединениях. В последнем случае это любой источник углерода либо образовавшийся после него в процессе катаболизма фрагмент. Однако в отдельных случаях требуется уникальный акцептор водорода, который должен присутствовать в питательной среде. (Джавец Э. с соавт., 1982).

Наиболее полезна, хотя и относительно проста, классификация, основанная на 2-х параметрах - природе источника энергии и природе основного источника углерода. По источнику энергии все организмы делятся на два типа: фотосинтезирующие организмы, способные использовать энергию света и называемые фототрофами, и организмы, нуждающиеся в химических источниках энергии - хемотрофы. Организмы, способные использовать в качестве главного источника энергии углерод CO₂, называются автотрофами, а те которым нужны органические источники углерода - гетеротрофами. На основе этих критериев можно разделить все организмы по типу питания на четыре главных категории:

1. Фотоавтотрофы - используют свет как источник энергии и CO₂ в качестве основного источника углерода. Эта категория включает большинство фотосинтезирующих организмов: высшие растения, водоросли и многие фотосинтезирующие бактерии.

2. Фотогетеротрофы - используют свет в качестве источника энергии и какое-нибудь органическое вещество как основной источник углерода. Сюда относятся некоторые пурпурные и зеленые бактерии.

3. Хемоавтотрофы - используют химический источник энергии и CO₂ в качестве основного источника углерода. Они получают энергию в результате окисления таких восстановленных неорганических веществ, как H₃, , H₂, восстановленные формы серы /H₂S, S, S₂O₃/ или закисное железо. В эту группу входят только представители бактерий.

4. Хемогетеротрофы - используют химический источник энергии и органическое вещество в качестве основного источника углерода. Здесь и углерод и энергия обычно могут быть результатом метаболизма одного и того же органического соединения. К хемогетеротрофам относятся все многоклеточные животные, простейшие, грибы и подавляющее большинство бактерий. Внутри этой очень сложной группы возможны дальнейшие подразделения. Одно из них основано на том, в каком химическом состоянии органический материал поступает внутрь клетки. Осмотрофы (бактерии и грибы) получают питательные вещества в растворенном виде, а фаготрофы (простейшие) могут поглощать твердые частицы пищи путем фагоцитоза.

Главные и минорные биоэлементы. Только небольшое число элементов периодической системы требуется организмам в относительно высоких концентрациях (10^-4 М). Это десять главных биологических элементов, которые наряду с некоторыми из выполняемых ими функций приведены в табл. 1. Углерод, кислород, водород и азот - основные компоненты органических соединений, содержащихся в тканях различных организмов, которые могут использоваться бактериями в форме органических и неорганических соединений. Метаболизм соединений, содержащих углерод, водород, кислород имеет важное значение не только потому, что эти элементы являются основными компонентами клетки, но и потому, что эти соединения служат важными субстратами для получения микроорганизмами энергии. Снабжение водородом и кислородом осуществляется за счет поступающей в клетку воды. Источники углерода многочисленны и разнообразны. На первом месте стоят сахара, многоатомные спирты и кислоты. Углерод является составной частью всех органических соединений, в том числе белков, пептонов, аминокислот. Большинство организмов, которые зависят от органических источников углерода (а, возможно, и все они), нуждаются в очень небольших количествах CO₂, так как это соединение необходимо для биосинтетических реакций.

Азот требуется в больших количествах, поскольку его содержание у бактерий составляет примерно 10% (в расчете на сухую биомассу). Различными микроорганизмами могут быть использованы очень многие, если не все источники азота, включая неорганические и органические его формы (, , N₂, NH₃, NH₂). Метаболизм источника азота обеспечивает главным образом синтез белков, нуклеиновых кислот и полимеров клеточной стенки. В клеточном белке аминокислоты составляют 1 - 5% от всего белка, на основании чего можно приблизительно оценить количество аминокислот, необходимых в качестве факторов роста. Исключение составляет глутаминовая кислота или глутамин, которые количественно играют большую роль в аминокислотном метаболизме и содержание которых в среде должно значительно превышать содержание остальных аминокислот (Перт С.Дж., 1978). Некоторые бактерии, нуждающиеся в нескольких аминокислотах, растут лучше при внесении в среду одной или более аминокислот в форме пептидов. Часто аминокислоты действуют как ингибиторы роста. Антагонизм между аминокислотами при их потреблении наблюдали в следующих группах: 1) фенилаланин, тирозин, триптофан; 2) серин, треонин, аланин, глицин; 3) глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота; 4) валин, лейцин, изолейцин; 5) норлейцин, метионин. Этот антагонизм связан с конкуренцией за общую пермеазу. Для некоторых организмов ферментативный гидролизат казеина становился ингибитором роста при концентрации выше 100 мкг/мл (Перт С.Дж., 1978).

Все питательные среды имеют в своей основе вещества, содержащие азот. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного происхождения - мясо (преимущественно говяжье), рыба, мясо-костная мука, казеин. С таким же успехом применяют для этой цели заменители полноценного мяса - плаценту, кровяные сгустки, а также дрожжи; можно использовать и белки растительного происхождения (соевые бобы, горох, ячмень и т.д.) (Биргер М.О./ред./, 1982).

Сера вносится в среду в форме одного из неорганических веществ, в частности, сульфата или в виде цистеина или метионина. При аэробных условиях цистеин почти нацело превращается в цистин (Перт С.Дж., 1982).

Фосфор обычно вносят в среду в виде неорганических фосфатов. Кроме того, можно использовать органические фосфаты, такие, как глицерофосфат и фосфолипиды (Перт С.Дж., 1982).

Остальные четыре главных биоэлемента - это ионы металлов (K, Mg, Ca, Fe), используемые в качестве кофакторов ферментов, а также компонентов металлокомплексов.

При образовании биомассы микроорганизмов потребность в калии соответствует выходу биомассы и приблизительно составляет 60 г сухой биомассы на 1 г калия. Большая часть калия, вероятно, связана с РНК, так что потребность в калии увеличивается под влиянием тех факторов, которые, подобно скорости роста, ведут к увеличению содержания РНК в биомассе. Потребность в калии может меняться обратно изменению pH. Только один щелочной металл способен заменить собой калий - это рубидий, хотя такая замена снижает максимальную скорость роста. Действие ионов калия может тормозиться ионами аммония (Перт С.Дж., 1982).

Магний является кофактором многих ферментов (например, киназ); присутствует в клеточных стенках, мембранах и эфирах фосфорной кислоты. Экономический коэффициент в расчете на ионы потребленного магния варьирует от 300 до 900 г сухой биомассы в расчете на 1 г магния и обратно пропорционален количеству РНК в биомассе (Перт С.Дж. 1982).

Экзоферменты, такие, как амилазы, протеазы, представляют собой кальцийсодержащие белки, а дипиколинат кальция служит важным компонентом эндоспор. Ионы двух- и трехвалентного железа входят в состав компонентов электропереносящей цепи, таких, как цитохромы и железосеропротеиды. Калий, магний, кальций и железо требуются в относительно больших количествах, и поэтому их соли всегда должны включаться в состав культуральных сред.

Помимо десяти главных биоэлементов, микроорганизмам требуется ряд других элементов, но в малых количествах (табл. 2). Ионы цинка и марганца необходимы всем микроорганизмам. Цинк имеет особенно важное значение, поскольку РНК- и ДНК-полимеразы относятся к цинкпротеидам. У большинства микроорганизмов потребность в ионах натрия и хлора невелика. Большинство патогенных бактерий развивается в средах, содержащих 0,5% хлорида натрия (Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С., 1981). Биологическое значение хлорида натрия состоит в том, что он создает условия изотонии, необходимые для нормального течения всех жизненных процессов в микробной клетке (Синюшина М.Н., Самсонова М.Н., 1981).

Микроорганизмам с особым типом метаболической активности необходимы Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W, Ni. Молибденпротеиды играют важную роль в азотном обмене и в окислении формиата. Селенит или селенид нужен для образования формиатдегидрогеназы клеток Escherichia coli при анаэробном росте, однако недостаток селена не оказывает влияния на рост указанной бактерии. Кобальт требуется всем микроорганизмам, у которых протекают реакции, зависимые от витамина B₁₂. Медь присутствует в ряде ферментов, переносящих электроны от субстратов к кислороду. В очень редких случаях микроорганизмам требуются вольфрам и никель.

Факторы роста. Однако, многие бактерии лишены способности синтезировать все органические соединения, необходимые для роста, и зависят от наличия в среде определенных факторов роста. Все эти факторы можно объединить в три группы (Готтшалк Г., 1982):

1) Витамины и родственные соединения, требующиеся в малых количествах;

2) Аминокислоты;

3) Пурины и пиримидины.

Общим свойством всех микроорганизмов является потребность в витаминах и родственных соединениях. Чаще наблюдается потребность в таких витаминах, как биотин, парааминобензойная кислота, тиамин, никотиновая кислота и витамин B₁₂. Потребность в факторах роста точно установлена не для всех микроорганизмов. Поэтому микробиологи часто добавляют в среду дрожжевой экстракт и пептон в качестве полноценных и дешевых источников таких факторов (Готтшалк Г., 1982).

Главная цель при подборе среды для выращивания любого микроорганизма состоит в том, чтобы создать сбалансированную смесь необходимых питательных веществ в таких концентрациях, при которых рост будет наилучшим. На первый взгляд может показаться, что нужно сделать среду как можно более богатой, добавив в нее все вещества в большом избытке. Однако, во-первых, в повышенных количествах многие питательные вещества начинают подавлять рост или оказываются токсичными. При высоких концентрациях подобный эффект дают такие органические субстраты, как соли жирных кислот (например, уксусной кислоты) и даже сахара. Подавлять рост могут и некоторые неорганические компоненты, если они окажутся в избытке. Во-вторых, даже если микроорганизм и может расти в среде с высоким содержанием питательных веществ, то в результате метаболической активности растущей популяции среда в конце концов настолько изменится, что условия будут весьма неблагоприятными и популяция станет физиологически аномальной или просто погибнет. Это может быть обусловлено сильным изменением pH, накоплением токсичных органических метаболитов, а в случае строгих аэробов - исчерпанием запасов кислорода. Таким образом, разумно ограничить общий рост культуры, вводя одно из питательных веществ в лимитирующем количестве.

При приготовлении питательных сред целесообразно составить сначала их минеральную основу, содержащую все те питательные вещества, которые можно дать любому организму в неорганической форме. Затем в эту основную среду можно ввести добавки - источник углерода, источник энергии, источник азота и необходимые ростовые факторы. Состав этих добавок, естественно, зависит от потребностей выращиваемого организма.

Среда, в которую входят только определенные химические соединения, называется синтетической.

Основные этапы определения потребностей гетеротрофных бактерий в питательных веществах заключаются в следующем.

1. Бактерии следует выращивать на такой среде (комплексной или синтетической), о которой известно, что она поддерживает их рост.

2. Если начинают выращивать бактерии на комплексной среде, то варьируют концентрации всех компонентов (от нуля до самой большой при которой они находились в исходной среде), чтобы определить их оптимальные концентрации и необходимость для роста или его стимуляции.

3. Определив оптимальные концентрации, сначала заменяют основной сложный компонент среды, поставляющий азот (например, казеин), на полную смесь аминокислот в тех же концентрациях, которые использовали в средах для аналитического определения веществ.

4. Если эта смесь обеспечивает рост бактерий, поочередно варьируют концентрацию каждой аминокислоты от нуля до концентрации, превышающей ту, которая установлена в среде для аналитического определения. Таким образом определяют оптимальную концентрацию каждой аминокислоты в присутствии других. Если же наблюдается ингибирующий эффект, то соответствующую аминокислоту исключают из среды.

5. Заменяют сложный фактор роста, например, дрожжевой экстракт, полным набором известных витаминов и затем варьируют отдельно уровень каждого компонента смеси, как и в случае аминокислот. Если в исходной среде в качестве источника аминокислот и витаминов используют дрожжевой экстракт, то стараются заменить его полной смесью аминокислот с полным набором известных витаминов и затем варьируют в среде уровень каждого компонента отдельно.

6. Если бактерии не растут на полученной таким путем среде, то это можно объяснить тем, что они нуждаются в неидентифицированном факторе роста, или тем, что нарушено соотношение известных факторов роста. Можно также предполагать потребность бактерий в известных факторах роста (пептидах, производных витаминов, жирных кислотах, нуклеотидах, неорганических ионах и др.), которые содержатся в неочищенных компонентах комплексной среды, но отсутствуют в смесях испытываемых синтетических веществ. В этом случае необходимо детально выяснить потребность бактерий в питательных веществах.

7. Если работу начинают с использованием синтетической среды и не наблюдают хорошего роста бактерий на втором этапе, то заменяют источник азота на 10%-ный гидролизат казеина. Если это способствует росту, поступают, как указано на этапе 4; если же интенсивность роста все еще недостаточна, добавляют к среде 1%-ный дрожжевой экстракт. В случае стимуляции роста, поступают, как указано на этапе 5.

Для роста бактерий необходимы благоприятные осмотические условия и подходящая для данного организма концентрация водородных ионов. Для этого иногда приходится вводить в среду химические добавки. Даже если какая-то среда благоприятна для начального этапа роста, не исключено, что в результате химических изменений, вызываемых метаболизмом самих бактериальных клеток, дальнейшее развитие популяций в этой среде прекратится. Например, в средах, содержащих глюкозу, в результате брожения могут накапливаться органические кислоты, которые будут подавлять рост бактерий. С другой стороны, использование или распад анионных компонентов среды в результате деятельности микробов может привести к подщелачиванию среды. Чтобы не допустить чрезмерных изменений концентрации водородных ионов, в среду часто добавляют буферы или нерастворимые карбонаты, чаще всего используют фосфатные буферы, состоящие из смеси однозамещенного и двузамещенного фосфатов (K₂HPO₄ и KH₂PO₄). Первая из этих солей слабокислая, а вторая - слабощелочная, так что если в растворе они будут содержаться в эквимолярных количествах, то такой раствор будет приблизительно нейтральным (pH = 6,8).

Фосфаты широко используются при приготовлении питательных сред, так как это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне - около нейтрального значения pH, и так как они малотоксичны для организма, кроме того они служат источником фосфора - одного из элементов, необходимых для роста. В высоких концентрациях фосфаты начинают подавлять рост культуры, поэтому толерантность данного микроорганизма ставит предел количеству фосфатного буфера, которое можно использовать в среде. Как правило, бактерии и грибы могут выдерживать до 5 г фосфатов калия на 1 л среды.

Если культура интенсивно продуцирует кислоту, то тех ограниченных количеств фосфатного буфера, которые можно добавлять в среду, оказывается недостаточно для поддержания нужного pH. В таких случаях для нейтрализации кислот по мере их накопления можно добавлять карбонаты в качестве "резервной щелочи". В присутствии ионов водорода карбонат превращается в бикарбонат, а бикарбонат в угольную кислоту, которая спонтанно распадается на CO₂ и воду. Так как H₂CO₃ - кислота чрезвычайно слабая и так как образующаяся при ее распаде CO₂ уходит в атмосферу, добавление в среду карбонатов предотвращает накопление в ней ионов, а значит и свободных кислот. Такие растворимые карбонаты как Na₂CO₃, будучи сильноосновными, не подходят для культуральных сред. Наоборот, нерастворимые карбонаты используются для приготовления многих сред.

В некоторых случаях для поддержания относительно постоянного pH в культуральной среде, нельзя использовать ни буферы, ни нерастворимые карбонаты. Особая трудность возникает, например, если в среде в очень больших количествах образуются кислоты, а добавлять углекислый (нерастворимый карбонат) нельзя. Еще большие затруднения встречаются, когда нужно поддерживать pH в слабощелочных средах, в которых рост бактерий приводит к образованию веществ с основными свойствами. Дело в том, что в области pH от 7,2 до 8,5 фосфатные буферы неэффективны, а других подходящих буферов для этого диапазона pH не существует. Поэтому иногда приходится периодически или непрерывно доводить pH культуры до нужной величины, стерильно добавляя в среду сильную щелочь или кислоту.

Многие организмы лучше развиваются в нейтральных средах или слабокислых, которые можно создать с помощью подходящих буферов.

Нередко в процессе стерилизации питательных сред выпадает осадок. Особенно часто это происходит, если среда содержит относительно высокие концентрации фосфатов (образуются нерастворимые комплексы фосфатов с некоторыми катионами, особенно с кальцием и железом). Обычно это не сказывается на питательной ценности среды, но осадок может затруднить наблюдение за развитием микроорганизмов или количественную оценку их роста. Образование осадка можно избежать, если отдельно стерилизовать концентрированные растворы солей кальция и железа, а затем добавлять их к уже простерилизованной и охлажденной среде. Эту трудность также можно обойти, добавив в среду небольшое количество вещества, которое образует с этими металлами растворимый комплекс (хелат) и предотвращает тем самым образование ими нерастворимого комплекса с фосфатами. Чаще всего для этого используют этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в концентрации около 0,01%.

Главные факторы, влияющие на стабильность среды - это природа его компонентов; способность взаимодействовать их друг с другом; температура, особенно во время стерилизации нагреванием; pH среды, кислород, свет.

Аминокислоты, в частности, триптофан, глутамин и аспарагин являются наиболее лабильными, и по этой причине их нельзя стерилизовать нагреванием, а используют для стерилизации ультрафильтрование. Глутамин полностью разлагается до при нагревании в водном растворе до 100 °C и pH = 7,0 и выдерживании при таких условиях в течение 3-х часов, даже при 37 °C разложение глутамина идет с заметной скоростью. Цистеин в присутствии кислорода быстро превращается в цистин, растворимость которого значительно ниже (около 0,2% при 20 °C), чем у цистеина. Однако с точки зрения питательной ценности цистеин и цистин взаимозаменяемы.

Из водорастворимых витаминов тиамин, рибофлавин, пиридоксин больше всего подвержены распаду. При доступе кислорода и 37 °C растворенный в воде тиамин окисляется в течение недели приблизительно на 50% и теряет биологическую активность. Он распадается при автоклавировании в течение 5 мин. при 121 °C. Рибофлавин разрушается в процессе автоклавирования при 121 °C в течение 1 ч. при pH = 7,0, но при кислых значениях pH он более устойчив. Рибофлавин светочувствителен и под действием комнатного рассеянного света при 32 °C может разрушиться за 1 ч. на 50%, однако имеются данные и о менее интенсивном разложении рибофлавина - на 13% за 157 ч. Чувствительностью к свету обладают также фолиевая кислота и пиридоксин, но они теряют активность в меньшей степени, чем рибофлавин.

Сахара тоже способны до некоторой степени разлагаться при автоклавировании в присутствии неорганических солей и органических соединений, что часто сопровождается окрашиванием в коричневый цвет. Глюкозиды с фуранозидными группами, например сахароза, при кислых значениях pH и при нагреве гидролизуются, что во многих случаях не оказывает пагубного действия на культуру, однако для поддержания постоянных условий этого следует избегать. Чистые растворы сахаров обычно устойчивы к автоклавированию.

Из неорганических солей соли аммония следует автоклавировать при pH ниже 7,0, иначе некоторая часть аммиака улетучивается. В средах определенного химического состава основные потери ионов магния, калия, аммония, натрия и фосфата в форме ионов могут происходить при осаждении недостаточно хорошо растворимых солей: смешанной фосфорнокислой соли магния и аммония, фосфорнокислой соли магния и калия, фосфорнокислой соли магния и натрия. В течение нескольких первых часов после приготовления раствора осаждение может и не происходить. По этой причине соль магния нужно автоклавировать отдельно от фосфатов. Растворимость сульфата кальция составляет примерно 0,2%, а фосфатная соль слабо растворима. В средах, не содержащих комплексообразующих агентов, фактически все ионы железа способны выпасть в осадок, создавая недостаток железа в среде, если не проводят сильного подкисления раствора. Фильтры Зейтца могут абсорбировать ионы железа и создавать таким образом дефицит по железу. Естественные среды содержат обычно аминокислоты и другие соединения, хелатирующие микроэлементы. Многие минимальные среды, рекомендованные в литературе, имеют тот недостаток, что не содержат комплексообразующих агентов, предотвращающих осаждение железа и других микроэлементов. Для жизни облигатных аэробов необходим кислород. Аэробные микроорганизмы хорошо растут на поверхности агара на чашках или в тонком слое жидкой среды. В неперемешиваемых жидких культурах рост обычно происходит только у поверхности, а в глубине создаются анаэробные условия, и рост там невозможен. Поэтому для получения больших популяций в жидких культурах среду необходимо аэрировать. С этой целью в лабораториях используют различные устройства для встряхивания, которые аэрируют среду, непрерывно перемешивая ее.

Многие строгие анаэробные микроорганизмы весьма чувствительны к молекулярному кислороду и быстро гибнут при контакте с ним. Поэтому соприкосновение таких культур с воздухом должно быть сведено к минимуму или полностью исключено. Анаэробные условия создаются путем наслаивания вазелинового или парафинового масла (уменьшается диффузия кислорода из воздуха), введения в среду кусочков печени, фарша и других веществ (окислителей кислорода, находящегося в среде) и регенерацией среды (освобождение питательной среды от кислорода путем прогревания ее в кипящей водяной бане и последующего быстрого охлаждения) перед посевом микробов.

1. Необходимо тщательно промывать посуду водой и обязательно проверять на нейтральность.

2. Следует строго соблюдать порядок внесения ингредиентов и момент внесения в соответствии с инструкциями и прописью. В противном случае могут выпасть осадки.

3. Определение pH питательной среды (колориметрическим способом с помощью компаратора Михаэлиса, либо потенциометрически с помощью потенциометра). Устанавливая pH среды, следует делать это осторожным внесением щелочи или кислоты, не допуская перещелачивания или закисления. Внесение кислоты при перещелачивании ухудшает качество среды. Внесение щелочи при избытке кислоты может послужить причиной образования осадков после стерилизации.

4. Следует иметь в виду, что при установлении реакции среды подщелачиванием едким натром, pH после кипячения и стерилизации падает на 0,2, а при изготовлении сред с настоем печени, витамин-B комплексом, pH снижается на 0,3 - 0,4. Поэтому при изготовлении среды устанавливают pH на 0,2 - 0,4 выше заданного, кипятят, пока не понизится на 0,2 - 0,2, снова проверяют pH, исправляют в случае необходимости и тогда уже среду подвергают стерилизации в автоклаве. Учитывая, что <...> в этом случае pH может измениться (на 0,1 - 0,2), обязательно проверяют pH после стерилизации.

Если глюкоза или другой сахар входит в состав среды, имеющей pH 7,9 - 8,1, то во избежание гидролиза углевода (сопровождается резким закислением среды до pH 6,0 - 5,0) растворы сахаров стерилизуют отдельно и вносят в среду стерильно перед посевом.

5. Осветление питательных сред. Для обеспечения прозрачности питательных сред в некоторых случаях рекомендуется предварительная стерилизация гидролизатов при различных зонах pH с последующей фильтрацией выпадающих осадков. Однако к этому приему лучше прибегать в тех случаях, когда не удается добиться прозрачности сред при изготовлении их из хорошо отстоявшихся (не подвергшихся стерилизации) гидролизатов, экстрактов и т.д., а также осветления можно добиться с помощью яичного белка или кровяной сыворотки. Для этого на каждые 1 - 2 л среды, остуженной до 50 °C, прибавляют белок одного куриного яйца или 25 - 30 мл кровяной сыворотки. Яичный белок нужно предварительно хорошо размешать с двойным объемом холодной воды. Среду хорошо размешивают и кипятят 10 - 15 мин. (Биргер М.О.).

При изготовлении питательного агара необходимо вносить агар-агар при нейтральной реакции. Агар-агар, растворяемый при кислой реакции, после автоклавирования среды не застынет. Агар-агар лучше вносить в момент изготовления среды, а не добавлять его в стерильный бульон и снова подвергать стерилизации. Во избежание ухудшения качества среды следует стремиться к сокращению времени тепловой обработки (варка, стерилизация).

В агар-агаре могут встречаться ингибиторы роста. Они удаляются при промывке агар-агара (Матвеев М.И. (ред.) 1973).

6. Фильтрование питательных сред. Жидкие и полужидкие питательные среды фильтруют через фильтровальную бумагу, предварительно смоченную водой, или фильтровальное полотно, агаровые среды - через ватно-марлевый фильтр. Вата предварительно замачивается в воде и отжимается.

7. Разливка питательных сред в пробирки, флаконы, колбы, матрасы, бутыли.

Мясная вода (мясной экстракт) является полуфабрикатом-основой для приготовления многих бактериологических сред: мясопептонного бульона, агаров различных концентраций и др. Она содержит белки, углеводы, витамины, минеральные вещества. Для приготовления мясной воды лучше всего использовать говяжье мясо высших сортов от молодых животных (высокие питательные свойства, прозрачность). Мясная вода из мяса старых животных плохо фильтруется, имеет серый цвет, дает большой осадок, токсинообразование на средах из такой воды ниже.

Приготовление: 1. Мясная вода готовится в разных концентрациях. Для этого берут следующие соотношения мясного фарша и воды:

Во всех случаях на выкипание добавляется 10% воды.

Мясную воду можно готовить двумя способами:

1-й способ: мясной фарш нужно варить сразу же, нагревая его до кипения. За это время фарш уваривается, уменьшается в объеме, особенно это заметно при приготовлении мясной воды 1:1. Фарш до варки размешивается с трудом, после варки свободно. При этом вес мяса уменьшается на 30 - 40%, главным образом за счет вытеснения воды, ранее связанной с белками. Фарш из красного становится серым. После этого варить еще один час.

Для определения готовности мясной воды нужно профильтровать небольшое ее количество через бумажный фильтр, если жидкость готова, то мясная вода будет прозрачная.

2-й способ: мясной фарш заливается мясной водой и экстрагируется в течение 18 - 24 часов при +4 °C. Варить как описано выше.

Отстоявшуюся прозрачную часть мясной воды темно-золотого цвета (1:1) или соломенно-желтого (1:2 или 1:4) фильтруют через полотняный или складчатый бумажный фильтр. В этой воде после автоклавирования обычно не выпадает осадок и такую воду можно сразу затаривать с необходимой концентрацией пептона и хлористого натра, что удобно при последующем приготовлении сред.

Готовую мясную воду разливают в стерильные бутыли с ватно-марлевыми пробками на 3/4 емкости.

Стерилизуют при 121 °C (1 атмосфера) 30 мин.

В результате стерилизации в мясной воде снижается количество витаминов. Этого можно избежать, сохраняя мясную воду нестерильно, добавив в виде консервантов хлороформ или соляную и уксусную кислоты.

Хлороформ добавляют к мясной воде с pH 6,2 - 6,5 в количестве 1%, если pH иной, то его доводят соляной кислотой.

Соляная кислота добавляется в количестве 0,7 мл (уд. в. 1,19) на 100 мл мясной воды. pH мясной воды после добавления кислоты 1,9. Процент образующейся соли после нейтрализации - 0,5%, и мясопептонный бульон полностью обеспечивается необходимым количеством хлорида натрия

Уксусная кислота добавляется в количестве 1,4 мл на 100 мл мясной воды (уд. в. 1,0055), что дает pH = 3,71 с содержанием хлористого натра после нейтрализации 2,0%.

Мартеновский пептон - это пептон частичного переваривания. Он получается путем неполного гидролиза белков стенок свиных желудков, ферментами желудочных желез, главным образом, пепсином в присутствии соляной кислоты. Этот гидролиз ведется в условиях, близких к перевариванию белков в желудке организма животных. Он характеризуется наличием сильно кислой реакции: pH = 2,23 (1,3 - 2,5). Такая кислотность способствует набуханию белков, благодаря чему облегчается действие протеолитических ферментов и в связи с этим ускоряется процесс гидролитического расщепления белка. Кроме того указанная кислотность является благоприятной для перевода неактивного пепсиногена в активный протеолитический фермент - пепсин, оптимальное значение pH для которого 1,5 - 2,5 при 40 °C. Пепсин легко расщепляет мышечные белки, а также альбумины и глобулины.

Продукты гидролиза белка пепсином часто называют пептонами. Пептоны - смесь более или менее сложных полипептидов, в состав которых входят также свободные аминокислоты, в частности триптофан.

Гидролиз при помощи ферментов (пепсина) отличается большей мягкостью, чем кислотный, что сохраняет лабильные факторы роста.

Для приготовления Мартеновского пептона берут свежие (парные) свиные желудки с мускулистыми упругими стенками, без содержимого, с большим количеством слизи, без катаральных явлений. Желудки, пропитанные желчью, отбрасываются. Отбор желудков лучше делать утром, когда животных забивают натощак.

Переваривание можно считать законченным, когда фарш станет гомогенным, осадок незначительным, серого цвета и надосадочная жидкость приобретает соломенно-желтый цвет. При этом у нее должны быть следующие показатели, характеризующие химический состав пептона:

1. Получение фарша. Желудки складывают слизистой внутрь, тщательно очищают от жира, вытирают сухой чистой тряпкой и проверяют наличие катаральных явлений, металлических предметов.

Для получения фарша можно использовать и мороженные желудки, но им дают сначала оттаять при комнатной температуре и после этого обрабатывают как свежие.

2. После получения фарша приготовление пептона ведут двумя способами:

1-й способ (ручной). 1) Фарш расфасовывают по бутылям; 2) Заливают подкисленной и подогретой до +45 °C водой, тщательно перемешивают и ставят в термостат при +45 °C +50 °C; 3) Перемешивание фарша в течение первых суток производят каждые два часа.

При ручном способе переваривание длится 18 - 32 часа. Если же переваривание проводится при +37 °C, то оно еще больше удлиняется.

Переваривание считается законченным при наличии гомогенного серого осадка в небольшом количестве, плохо оседающем при взбалтывании, соломенно-желтого цвета надосадочной жидкости и соответствующих химических показателях.

2-й способ (механический). Фарш закладывают в полиэтиленовые баки емкостью 40 л, заливают подкисленной и подогретой до +48 - 50 °C водой, ставят на турбомаги при +45 °C. Так как турбомаги меньше по диаметру, чем баки и их нужно отцентрировать по отношению к магниту, то баки нужно оставлять на подставках несколь<...> высоты (около 0,5 см). Для перемешивания 30,0 л пептона Мартена достаточно иметь магнит длиной 6,5 см; на 10,0 л - 2,5 см.

Применение механического перемешивания дает возможность получить пептон быстрее, с более стабильными показателями и освобождает от применения ручного труда.

Нейтральный пептон

Отстоявшийся кислый Мартеновский пептон декантируют (отсасывают сифоном, не забирая осадка), подогревают на медленном огне до 60 - 80 °C и нейтрализуют 10- или 20%-ным едким натром до pH = 5,6 - 6,0. Кипятят 10 - 20 мин. Дают отстояться 2 - 3 часа в теплом месте. Образуется осадок. Фильтруют через вату или полотно. Разливают в бутыли по 3/4 емкости. Стерилизуют при 110 - 112 °C 30 мин.

При получении перевара по Хоттингеру используется ферментативный гидролиз с помощью добавления фарша поджелудочной железы (свежего или мороженного), или панкреатина, как очищенного, так и неочищенного. Поджелудочная железа выделяет сок с pH = 7,8 - 8,4, в состав которого входят ферменты: трипсин (расщепляет белок), амилаза (углеводы), нуклеаза (нуклеиновые кислоты), липаза (жиры). Трипсин расщепляет около 60% пептидных связей, а при предварительном легком кислотном воздействии до 70%, а также амидные и эфирные связи. Он реагирует с отрицательными ионами белка.

Ферментативный гидролиз мягче кислотного, поэтому при его использовании происходит неполный гидролиз, сохраняются лабильные факторы роста.

Показателем начавшегося гидролиза является положительная нингидринная реакция, выявляющая появление свободных аминокислот.

Показателем окончания гидролиза является превращение мясного фарша в гомогенную серую массу, фильтрат принимает соломенно-желтый цвет, перевар легко фильтруется, прекращается нарастание аминного азота, наблюдается отрицательная биуретовая реакция и положительная реакция на триптофан.

Степень гидролиза в готовой среде характеризуется количеством общего, аминного азота и триптофана. В зависимости от их содержания различаются триптические перевары глубокого <...> и неполного расщепления.

Применение триптических переваров имеет ряд преимуществ при приготовлении бактериологических питательных сред по сравнению со средами приготовленными на мясной воде: 1. Химический состав их более постоянен, чем приготовленных на мясной воде; 2. Наличие в переварах значительного количества аминокислот, которые создают большую буферность, а, следовательно, и стабильность pH; 3. Приготовление сред на переварах Хоттингера является более выгодным, так как из одного и того же количества мяса получается бульона в 5 - 10 раз больше чем из мясной воды.

Способ приготовления: 1. Экстракт мясного фарша (1:1).

Размешать при +4 - 10 °C на 12 - 18 часов оставить экстрагироваться.

2. После экстрагирования (утром) добавить столько же воды, т.е. 100 мл. Таким образом, получается экстракт 1:2. Подогреть до +50 °C (не выше) и подщелачивать 20%-ным едким натром до pH = 8,0 - 8,1. При добавлении щелочи нужно тщательно перемешать фарш, чтобы не произошло комкования, которое мешает перевариванию.

3. Приготовление фарша поджелудочной железы. Поджелудочная железа тщательно очищается от жира и пленок и двукратно измельчается на мясорубке, для консервации добавляется 0,5% хлороформа. Приготовленная таким образом железа хранится в холодильнике при -4 °C под резиновой пробкой, использовать ее можно через 2 - 3 дня после приготовления. Необходимое для добавления количество фарша делят на три части, первые две большие.

4. Приготовление панкреатина. Необходимое количество панкреатина перед добавлением тщательно размешивают с водой и делят на три части, как и фарш поджелудочной железы.

5. В перевар с температурой около 50 °C и pH 8,0 - 8,1 закладывается первая часть панкреатина или фарша поджелудочной железы. Отмечается время переваривания.

6. Через 30 мин. проверяется pH (отсутствие сдвига pH указывает на то, что поджелудочная железа или панкреатин недостаточно активны и нужно увеличить их количество).

7. Через 30 мин. эта манипуляция повторяется.

8. Через 1,5 часа с начала переваривания проверяется количество аминного азота. Оно должно быть равным 200,0 - 300,0 мг %. Если нет, то еще добавляется фарш или панкреатин.

9. В течение всего времени переваривания нужно тщательно следить за температурой. Она не должна быть выше +50 °C, т.к. инактивируется фермент, и не ниже +40 °C, т.к, будет брожение.

Весь процесс переваривания длится около 4-х часов и количество аминного азота должно дойти до 450,0 - 500,0 мг %, но не более 530,0 мг %.

10. Через 4 часа добавляется 1,5 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л перевара, затем кипячение 10 - 15 минут. Прибавление кислоты прерывает процесс ферментации, а уксусная кислота еще и придает среде буферные свойства.

11. В горячем виде перевар фильтруется через полотняный фильтр и расфасовывается.

12. После остывания (на следующий день) добавляется 1% хлороформа и стерилизуется при 120 °C.

Способ приготовления: 1. Мясной фарш расфасовывают по бутылям, добавляют воду, тщательно перемешивают.

2. Смесь подщелачивают до pH = 8,0. На 1 л смеси расходуется около 13,3 мл 10%-ного едкого натра.

3. В смесь добавляют 10% фарша поджелудочной железы или 0,5 - 1% панкреатина в 45 ед. и 1,5 мл хлороформа.

4. Бутыли закрывают резиновыми пробками, хорошо перемешивают.

5. После перемешивания открывают пробку и выпускают образовавшиеся газы (в первые трое суток пробку нельзя закрывать плотно, иначе ее вырвет газами).

6. Ставят для переваривания при +45 °C.

7. Перемешивание производят как можно чаще, желательно каждые 2 час.

8. На следующий день проверяют pH, который должен снизиться до 7,0. Добавляют щелочи до pH = 8,0.

9. В течение последующих 2-х суток перемешивание нужно производить через 3 - 4 часа. Ночью перемешивают не менее 2 - 3 раз, затем реже.

10. Затем перемешивают 2 раза в сутки.

В течение первых трех суток нужно тщательно следить за pH и при снижении его подщелачивать. Всего на переваривание 1 литра смеси уходит около 40 мл 10%-ного едкого натра.

11. Полное переваривание заканчивается в течение 5 - 8 суток. Мясной фарш превращается в гомогенный сероватый порошок, над которым при правильном переваривании отстаивается верхний слой прозрачной жидкости соломенно-желтого цвета. К этому времени pH стабилизируется (7,4 - 7,1) и количество триптофана начинает падать. Если при стоянии выпадает белый осадок (тирозин), то это является признаком хорошего переваривания. Перевар должен еще до полной готовности постоять дней 20 при +4 °C, а потом его можно употреблять для приготовления сред. За это время происходит медленное нарастание аминного азота и оседание осадка, благодаря чему его можно декантировать, объем надосадочной жидкости будет больше.

12. Затем, как и к перевару неполного расщепления, добавляется 1% хлороформа. Хранить при +4 °C.

Печень богата гликогеном, глюкозой, желчными пигментами, витаминами, ферментами и т.д. При приготовлении печеночного экстракта большая часть этих веществ переходит в раствор, и среды, приготовленные на печеночном экстракте, в питательном отношении являются обогащенными по сравнению со средами, приготовленными на мясной воде.

Печеночный экстракт употребляется для изготовления мясо-пептонно-печеночного бульона и агара.

Пропись:

Нарезанную кусками печень залить дистиллированной или водопроводной водой и экстрагировать в течение 15 часов. Затем варить 15 - 20 мин. После отстаивания фильтровать через полотняный фильтр. Стерилизовать при 120 °C 30 мин.

После стерилизации печеночный экстракт имеет темно-коричневый цвет с зеленоватым металлическим оттенком и небольшим рыхлым осадком темного цвета. Перед употреблением осадок отфильтровывается через вату.

Готовится точно так же, как и печеночный экстракт.

200 г прессованных пекарских дрожжей размалывают на мелкие кусочки, суспендируют в 1 л дистиллированной воды, кипятят при постоянном перемешивании, пока не сойдет пена. Затем многократно фильтруют через бумажный фильтр до тех пор, пока фильтрат не станет прозрачным. Автоклавируют при 115 °C 30 мин.

Определение свободного триптофана часто используют как тест на полноту ферментативного гидролиза. Так, по мере расщепления белков мяса при изготовлении переваров Хоттингера содержание триптофан возрастает, по окончании гидролиза - сначала стабилизируется, затем начинает падать в связи с частичным разрушением этой аминокислоты.

Метод дает завышенные результаты для питательных сред, но удобен для сравнительных исследований в процессе гидролиза.

Реактивы:

- 1%-ный раствор хлорамина Б (хлорамин Б содержит 26 - 29% свободного хлора), 1 г сухого хлорамина растворяют в 99 мл воды и фильтруют. Раствор готовят перед применением.

- ледяная уксусная кислота.

Ход определения

В пробирку вносят 1 мл испытуемого раствора (питательной среды или 2%-ного раствора гидролизата), добавляют 4 мл дистиллированной воды, 1 мл ледяной уксусной кислоты и титруют из бюретки 1%-ным раствором хлорамина. При этом появляется розовая окраска. По мере добавления хлорамина она усиливается до красной, и, пройдя наиболее интенсивную стадию, переходит в желтую или грязно-бурую (конец титрования). Обычно переход происходит от одной капли хлорамина, в связи с чем при появлении окрашивания его следует приливать по одной капле, тщательно встряхивая.

Расчет:

где X - количество триптофана, мг %

A - количество хлорамина, пошедшее на титрование, мл

100 - пересчет на 100 мл испытуемого раствора

Определение содержания аминного азота в питательных средах см. в "Методических рекомендациях по физико-химическому и биологическому контролю белковых гидролизатов для бактериологических питательных сред" (Простяков А.П., Рогожин С.П., Фоменко А.С. и др.), МСХ СССР, ВНИИТИБП, ВГНКИ ветпрепаратов МСХ СССР, М., 1983.