"Экспресс-метод оценки общетоксического и кожно-раздражающего действия парфюмерно-косметической продукции in vitro (на культуре подвижных клеток). Методические рекомендации"
(утв. Минздравом России 29.01.2003 N 29ФЦ/394)

Разработаны НИИ медицины труда РАМН, Всероссийским научно-исследовательским и испытательным институтом медицинской техники Минздрава РФ, Акционерным обществом "БМК-Инвест", Центром Госсанэпиднадзора в г. Москве.

Методические рекомендации одобрены Лабораторным советом Госсанэпидслужбы России (протокол N 1 от 22.01.2002).

Методические рекомендации содержат описание метода тестирования парфюмерно-косметической (ПК) продукции с применением кратковременной суспензионной культуры подвижных клеток (сперматозоидов быка) и определяют порядок проведения испытаний следующих видов ПК продукции: жидкие моющие средства, дезодоранты и депилятории в аэрозольной упаковке, туалетная и парфюмированная вода, духи, одеколон, спиртосодержащие лосьоны.

Методические рекомендации предназначены для скрининговой оценки вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой ПК продукции с учетом общетоксического и кожно-раздражающего действия.

Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.

Методические рекомендации предназначены для учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов ПК продукции и контроль ее качества.

В качестве тест-объекта используется сперма крупного рогатого скота, замороженная в парах жидкого азота. Гранулы замороженной бычьей спермы получают на станциях искусственного осеменения и хранят в сосудах Дьюара, наполненных жидким азотом.

Критерием токсического действия является изменение двигательной активности сперматозоидов под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПК продукции, по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащей токсических веществ. Изменение двигательной активности измеряется показателем подвижности "m" и регистрируется автоматически анализатором токсичности по изменению интенсивности светового потока при движении сперматозоидов через оптический зонд.

Количественная оценка параметра тест-реакции выражается индексом токсичности "It", представляющим собой отношение суммарной двигательной активности сперматозоидов опытной и контрольной проб, выраженное в процентах. Величина индекса токсичности, гарантирующая безопасность ПК изделий, находится в интервале от 70 до 120%. Сравнительная оценка результатов исследования общей токсичности и кожно-раздражающего действия ПК изделий в эксперименте на лабораторных животных и их различных разведений на культуре сперматозоидов послужила основанием для выбора эталонных разведений перечисленных ранее групп ПК изделий с учетом допустимого интервала индекса токсичности.

3.1. Анализатор токсичности АТ-4.

3.2. Сосуд Дьюара типа СДС объемом не менее 25 л и диаметром горла не менее 50 мм.

3.3. Термостат типа ТС-80М-2 (25 - 80 °C).

3.4. Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1 мг, ГОСТ 24104-88.

3.5. Пробирки с притертыми пробками объемом 3 - 5 мл - 10 шт., ГОСТ 1770-74.

3.6. Дозаторы пипеточные на объемы 0,5 мл, 0,2 мл и 0,1 мл, ТУ 2Т2.993.053.

3.7. Мерные колбы с притертыми пробками объемом 50 мл - 2 шт., ГОСТ 1770-74.

3.8. Пинцет анатомический длиной 250 мм.

3.9. Глюкоза, ч., ГОСТ 6038-74.

3.10. Цитрат натрия трехзамещенный, ч., ГОСТ 22280-76.

3.11. Сперма быка, замороженная в жидком азоте, ГОСТ 26030-83.

3.12. Фильтры АФА-ВП-10, ТУ 95-743-80.

4.1.1. Экстракты из испытуемых образцов готовят путем настаивания в дистиллированной воде. Соотношения веса образца и объема модельной среды (дистиллированной воды), а также продолжительность экстракции приведены в таблице 1. Навески ПК продукции взвешивают в сухой чистой колбе, куда затем добавляют требуемый объем модельной среды. В другую колбу наливают модельную среду и обе колбы помещают в термостат на 24 часа при температуре +37 °C. После окончания экстракции растворы охлаждают до комнатной температуры.

4.1.2. После завершения экстракции экстракт подвергают фильтрации через бумажный фильтр с целью удаления взвешенных частиц. Фильтрованию подвергают также и модельную среду.

4.1.3. В качестве фильтра используют бумажный фильтр АФА-ВП-10 диаметром 9 см. Бумажные фильтры должны быть заранее промыты и просушены. Для этого предварительно до эксперимента 10 бумажных фильтров опускают в большой стакан, заполненный 1,5 л дистиллированной воды. Стакан накрывают стеклянной пластинкой и ставят в термостат на 24 часа при температуре +37 °C. Затем дистиллированную воду выливают, а стакан с мокрыми фильтрами ставят обратно в термостат с целью высушивания фильтров до постоянной массы. Достижение постоянной массы контролируют взвешиванием каждого фильтра на аналитических весах.

4.1.4. После фильтрования из модельной среды и экстрактов готовят изотонические растворы, добавляя в них сухие реактивы глюкозы и цитрата натрия (глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, фильтрат - 100 мл).

Для определения индекса токсичности изотонического фильтрата экстракта, далее - опытного раствора, необходимо сравнить его с изотоническим фильтратом модельной среды.

4.2.1. Контрольный и опытный изотонические экстракты не менее чем за час до начала эксперимента по 0,4 мл помещают в пробирки с притертыми пробками и ставят в водяную баню при температуре (40 +/- 1,5) °C.

4.2.2. Приготовление раствора спермы. Оттаивают замороженную сперму в разбавителе. Состав разбавителя: глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, дистиллированная вода - 100 мл. В чистую сухую пробирку наливают 0,4 мл разбавителя и ставят в водный термостат при температуре (40 +/- 1,5) °C. Охлажденным до температуры жидкого азота анатомическим пинцетом извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и быстро опускают в нагретый раствор.

4.2.3. Приготовление тест-системы. В каждую пробирку с модельной средой и опытным экстрактом из ПК изделия приливают по 0,1 мл раствора спермы. Полученную смесь экстрактов и спермы из каждой пробирки переносят в капилляры (минимум по 5 на один образец) и устанавливают в каретку прибора. Проводят измерения согласно инструкции к прибору.

Обработку экспериментальных данных осуществляют вручную или с помощью компьютера по прилагаемой к анализатору токсичности программе.

Для каждого образца вычисляют суммарную двигательную активность S:

Оценка результатов испытаний осуществляется путем сравнения полученных значений индексов токсичности для исследованных образцов и допустимого интервала индекса токсичности.

Индекс токсичности от 70% до 120% указывает на то, что испытуемый образец относится к 4 классу малоопасных соединений согласно классификации ГОСТ 12.1.007-76 и не обладает кожно-раздражающим действием при соблюдении условий применения согласно этикетке. Образец направляется на проведение клинических испытаний на людях-добровольцах.

Во всех остальных случаях результаты свидетельствуют о несоответствии требованиям безопасности, предъявляемым к ПК-продукции. В этой ситуации испытанный образец может быть подвергнут расширенным санитарно-химическим и токсикологическим исследованиям.