"Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в пищевых продуктах"
(утв. Минздравом СССР 10.12.1980 N 2273-80)

Разработаны в лаборатории энзимологии питания Института питания АМН СССР.

Среди особо опасных контаминантов пищевых продуктов, встречающихся в естественных условиях, выделяют группу микотоксинов - вторичных метаболитов микроскопических грибов, отличающихся высокой токсичностью, а в ряде случаев обладающих мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами. В настоящее время известно более 240 видов различных плесневых грибов, которые продуцируют около 100 токсических соединений, являющихся причиной алиментарных микотоксикозов человека и животных.

Высокий интерес специалистов в области гигиены питания к проблеме микотоксинов обусловлен, во-первых, бесспорным доказательством их реальной опасности для здоровья человека; во-вторых, чрезвычайно широкой распространенностью, и, в-третьих, весьма внушительными размерами наносимого ими экономического ущерба.

Среди микотоксинов своими токсическими и канцерогенными свойствами, а также широкой распространенностью выделяются афлатоксины, продуцируемые микроскопическими грибами из рода Aspergillus.

Центральным звеном системы профилактики афлатоксикозов является организация контроля за загрязнением пищевых продуктов афлатоксинами, в цели которого входят, во-первых, установление исходного уровня контаминации ими пищевых продуктов и выявление изменения этого уровня во времени; во-вторых, определение и подтверждение эффективности мероприятий по снижению контаминации афлатоксинами пищевых продуктов; в-третьих, обеспечение постоянной проверки степени контаминации, не допуская превышения установленных предельно допустимых концентраций (ПДК).

Афлатоксины - кристаллические вещества белого цвета, они относительно стабильны к действию тепла и не разрушаются в условиях пастеризации и кулинарной обработки пищевых продуктов. Афлатоксины разлагаются под действием солнечного и УФ-света, а также щелочей и окислителей. Они хорошо растворимы в диметилсульфоксиде, ацетонитриле, ацетоне, спиртах, хлороформе и хлористом метилене, умеренно растворимы в воде (около 20 мг в 1 литре) и практически нерастворимы в гексане, диэтиловом эфире и петролейном эфире. Стандарты афлатоксинов хранят при температуре ниже 0° в виде растворов в смеси бензол-ацетонитрил (98:2) или хлороформе.

Метод включает следующие стадии:

- экстракцию афлатоксинов из образца смесью ацетон-вода;

- очистку экстракта от белков, липидов и пигментов;

- очистку, разделение и количественное определение афлатоксинов с помощью двумерной ТСХ;

- проведение подтверждающих тестов.

Отбор проб производится по ГОСТ 12430-66 (Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе).

1. Мельница лабораторная (типа ЭМ-3А) или кофемолка ЭКМ-3У.

2. Весы технические по ГОСТ 19491-74.

3. Аппарат для встряхивания проб АВУ-6С по ТУ-64-1-2451-78.

4. Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76 (завод "Химлабприбор").

5. Насос водоструйный по ГОСТ 10696-75.

6. Баня водяная с электронагревателем.

7. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833), МРТУ 64-1-1080-63, или диагностическая лампа ОЛД-41.

8. Микрошприц МШ-10 на 10 мкл или калиброванные стеклянные капилляры.

9. Камеры для ТСХ с притертыми крышками, например стеклянные четырехугольные сосуды 195 x 195 x 200 мм завода "Дружная горка".

10. Пластины для ТСХ "Силуфол" размером 15 x 15 см, ЧССР.

11. Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 100 - 250 микрон (силикагель Л, ЧССР).

12. Распылитель стеклянный с грушей.

13. Цилиндры мерные на 100, 250 и 500 мл.

14. Колбы плоскодонные конические на 500 и 1000 мл и круглодонные на 250 мл с НШ 29 и притертой пробкой.

15. Колбы грушевидные с НШ 14,5 на 90 - 100 мл (см. рис. 1 - здесь и далее рисунки не приводятся).

16. Микропипетки на 0,1 мл.

17. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-66.

18. Колбы мерные на 100 мл по ГОСТ 1770-74.

19. Воронки химические диаметром 150 мм по ГОСТ 8613-75.

20. Делительные воронки на 250 или 500 мл по ГОСТ 8613-75.

21. Колбы плоскодонные на 100, 250 и 500 мл по ТУ 48-52.

22. Колонка стеклянная хроматографическая 300 x 15 мм (см. рис. 2).

25. Ацетон по ГОСТ 2603-71.

26. Гексан по ТУ 6-09-3375-73.

27. Бензол по ГОСТ 5955-75.

28. Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-74.

29. Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51 "ХЧ".

30. Эфир диэтиловый медицинский по ГОСТ 6265-52.

31. Вода дистиллированная.

32. Кислота серная по ГОСТ 4204-77.

33. Кислота лимонная по ГОСТ 3652-29.

34. Кислота азотная концентрированная по ГОСТ 4461-67.

35. Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76, прокаленный.

36. Натрий хлористый по ГОСТ 4233-66.

37. Свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027-67.

38. Йод кристаллический по ГОСТ 4159-64.

Пробу продукта измельчают в течение 2 мин. в кофемолке (образцы с высоким содержанием жира: арахис, какао-бобы, орехи, семена масличных целесообразно перед измельчением замораживать (сухой лед, жидкий азот и др.)). Берут навеску 25 г измельченного продукта в плоскодонную коническую колбу на 250 или 500 мл, тщательно перемешивают с 25 мл 10-процентного раствора хлористого натрия. Добавляют 100 мл ацетона и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 50 мл фильтрата.

К 50 мл фильтрата добавляют 20 мл 15-процентного раствора уксуснокислого свинца и 30 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют стоять на 10 мин. в темноте. Отфильтровывают образовавшийся осадок через бумажный складчатый фильтр, отбирают 80 мл фильтрата. Переносят в делительную воронку, добавляют 40 мл гексана, встряхивают и после разделения слоев отделяют нижний водно-ацетоновый слой. Верхний гексановый слой отбрасывают. К водно-ацетоновому слою добавляют 30 мл гексана, встряхивают в делительной воронке, верхний гексановый слой отбрасывают. К водно-ацетоновому раствору добавляют 40 мл хлороформа, встряхивают в делительной воронке. После разделения слоев нижний хлороформный слой отделяют, а к верхнему водно-ацетоновому слою добавляют 30 мл хлороформа и 15 мл ацетона. После встряхивания и разделения слоев нижний хлороформный слой отделяют. Объединенные хлороформные экстракты помещают в плоскодонную колбу на 100 мл с притертой пробкой, добавляют 5 - 7 г безводного сернокислого натрия, встряхивают и оставляют на 30 мин. в темноте. Раствор фильтруют через кусочек ваты, помещенный в стеклянную химическую воронку, в грушевидную колбу на 90 - 100 мл с отростком (см. рис. 1). Плоскодонную колбу с сернокислым натрием споласкивают 5 - 10 мл хлороформа и отфильтровывают в ту же грушевидную колбу. На цилиндрическом отростке должна быть проведена метка на уровне 100 мкл, для этого колбу калибруют с помощью микропипетки на 0,1 мл. Хлороформный раствор упаривают на ротационном испарителе в вакууме водоструйного насоса при температуре бани не выше 50° досуха, вещество смывают со стенок хлороформом в калиброванный отросток до метки 100 мкл. Полученный раствор используют для определения содержания афлатоксинов с помощью ТСХ <*> (раствор А).

--------------------------------

<*> При анализе некоторых продуктов хлороформный экстракт может содержать много жировых веществ. Это затрудняет нанесение экстракта на ТСХ-пластинку ввиду расплывания жирового пятна на старте, перегрузки пластинки и ухудшает разделение афлатоксинов. В этом случае целесообразно перед проведением ТСХ дополнительно очистить экстракт на хроматографической колонке с силикагелем (см. рис. 2). На дно колонки помещают маленький комочек ваты, затем безводный сернокислый натрий (толщина слоя 3 - 4 мм), наливают суспензию силикагеля в хлороформе (толщина слоя силикагеля около 20 мм) и сверху насыпают слой сернокислого натрия (15 - 20 мм). В колонку наливают 10 мл хлороформа, дают хлороформу стечь. Когда уровень хлороформа достигнет верхней границы сернокислого натрия, на колонку наносят раствор экстракта в 100 мкл хлороформа, колбу из-под экстракта ополаскивают 2 - 3 мл хлороформа и наносят на ту же колонку. Когда уровень раствора экстракта коснется слоя сернокислого натрия, в колонку наливают 50 мл смеси хлороформ-ацетон (9:1). Хлороформ-ацетоновый раствор собирают в грушевидную колбу с отростком на 90 - 100 мл (см. рис. 1) и упаривают раствор на ротационном испарителе досуха. Вещество смывают со стенок хлороформом в калиброванный отросток до метки 100 мкл. Далее полученный раствор анализируют с помощью ТСХ (раствор А).

Все растворы стандартов хранят в холодильнике при температуре ниже 0°. Срок годности эталонного раствора до одного года, а рабочего раствора до 4 - 5 месяцев. При хранении необходимо следить за тем, чтобы объем растворов не уменьшался за счет испарения растворителя.

Пластинку "Силуфол" размером 15 x 15 см размечают тонкими карандашными линиями (см. рис. 3а). В правом нижнем углу пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят с помощью микрошприца или стеклянного калиброванного капилляра 20 мкл раствора экстракта - раствора А. Наносить раствор следует постепенно, не допуская размывания стартового пятна более 4 - 5 мм. В правом верхнем и левом нижнем углах на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят по 2 мкл рабочего раствора стандартов афлатоксинов. Пластинку помещают в камеру для ТСХ, в которую предварительно наливают смесь бензол-эфир-гексан (1:2:1), уровень растворителя должен быть на 1 см ниже нанесенных пятен. Развитие хроматограммы проводят в первом направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки, затем пластинку извлекают из камеры и сушат 5 мин. в темноте. Высушенную пластинку поворачивают на 90° по часовой стрелке и помещают в камеру для ТСХ, в которую предварительно наливают смесь хлороформ-ацетон-бензол (9:1:1) <*>. Проводят развитие пластинки во 2-ом направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки, затем пластинку извлекают и сушат 5 мин. в темноте. Рассматривают пластинку в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флуоресценции пятнам стандартов афлатоксинов, свидетельствует о возможном присутствии афлатоксинов в пищевом продукте.

--------------------------------

1-ый тест

Стеклянную пластинку 20 x 20 см заливают 5 - 10-процентным раствором йода в эфире, после испарения эфира пластинку с тонким слоем йода помещают над ТСХ-пластинкой на расстоянии 0,5 - 1,0 см и подвергают ее воздействию паров йода в течение 20 - 30 сек. Затем пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Сохранение цвета и интенсивности флуоресценции пятен стандартов и соответствующих им пятен экстракта подтверждает возможное наличие афлатоксинов в пищевом продукте.

2-ой тест

При проведении операций подтверждения ориентировочно оценивают количество афлатоксина в пятне экстракта путем сравнения интенсивности его флуоресценции со стандартом.

Если в экстракте обнаружены афлатоксины, то необходимо провести количественное определение. Пластинку "Силуфол" размером 15 x 15 см размечают тонкими карандашными линиями согласно рис. 3б. В правом нижнем углу пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят с помощью микрошприца 20 мкл экстракта (раствор А). В левом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев наносят 2 мкл рабочего раствора стандартов афлатоксинов. В правом верхнем углу на расстоянии 1, 2 и 3 см от верхнего края пластинки и 1,5 см от правого края пластинки наносят соответственно 2,0, 4,0 и 6,0 мкл раствора стандартов афлатоксинов. ТСХ проводят в условиях, аналогичных пункту 1.3.2. После ТСХ пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Сравнивая интенсивность флуоресценции разных количеств стандартов афлатоксинов на пластинке с интенсивностью флуоресценции соответствующих пятен экстракта, определяют количество нанограмм (нг) афлатоксина в пятне экстракта.

Содержание афлатоксинов в продукте рассчитывают по формуле:

Для анализа берут 100 мл жидкого молока или 10 г сухого молока, или 50 г масла, или 50 г сыра. Навеску масла растапливают и переносят в колбу для экстракции, сыр перед взятием навески измельчают с помощью терки. Анализируемый образец помещают в плоскодонную коническую колбу на 500 мл с притертой пробкой и добавляют водный раствор лимонной кислоты и хлористого натрия согласно таблице.

К полученной смеси добавляют 300 мл ацетона и встряхивают в течение 30 мин. на аппарате для встряхивания. Смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр на 500 мл, отбирают 275 мл фильтрата.

Экстракт переносят в плоскодонную коническую колбу на 1000 мл, добавляют 20 мл 15-процентного водного раствора уксуснокислого свинца и 200 мл воды, встряхивают и оставляют в темноте на 10 - 15 мин. Затем добавляют 10 мл насыщенного раствора сернокислого натрия, встряхивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр на 500 мл. Отбирают 350 мл фильтрата и переносят в делительную воронку на 500 мл, добавляют 100 мл гексана и встряхивают. После разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают, к нижнему водно-ацетоновому слою добавляют 50 мл гексана, встряхивают в делительной воронке. После разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают, к нижнему водно-ацетоновому слою добавляют 100 мл хлороформа, встряхивают в делительной воронке. Нижний хлороформный слой отделяют, водно-ацетоновый слой повторно экстрагируют 50 мл хлороформа в делительной воронке. Объединенные хлороформные экстракты сушат безводным сернокислым натрием (5 - 10 г) в течение 30 мин. Высушенный экстракт фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в круглодонную колбу на 250 мл с НШ 29. Упаривают на ротационном испарителе до объема 10 - 20 мл. Содержимое колбы переносят в грушевидную колбу на 90 - 100 мл с калиброванным отростком (см. рис. 1) и упаривают досуха на ротационном испарителе. Вещество смывают со стенок колбы в калиброванный отросток хлороформом до отметки 100 мкл.