"МР 1.1.0119-17. 1.1. Общие вопросы. Гигиена, токсикология, санитария. Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора-люминометра типа "Биотокс-10"). Методические рекомендации"
(утв. Роспотребнадзором 22.12.2017)

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве" Роспотребнадзора.

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22.12.2017.

3. МР 1.1.0119-17 введены взамен МР N 01.038-08 "Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста".

1.1. Методические рекомендации содержат описание метода токсикологического тестирования парфюмерно-косметической (далее - ПК) продукции с применением в качестве тест-объекта (биосенсора) реактива люминесцентных бактерий "Эколюм" или иных препаратов бактериальной люциферазы и определяют порядок проведения испытаний следующих видов ПК продукции (далее - методические рекомендации, методика):

продукция косметическая гигиеническая моющая;

жиросодержащие косметические средства;

продукция косметическая жидкая, не содержащая спирт;

гели косметические;

продукция декоративной косметики на эмульсионной основе;

продукция косметическая для окрашивания, осветления, химической завивки и выпрямления волос;

продукция косметическая на носителях;

пилинги, скрабы, эксфолианты;

интимная косметика;

парфюмерная и косметическая спиртосодержащая продукция;

дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке и не в аэрозольной упаковке;

продукция декоративной косметики порошкообразная и компактная, тальк, присыпки, зубные порошки;

кремы косметические для ухода за кожей лица, тела, волосами, ногтями, губами, кожей вокруг глаз;

продукция декоративной косметики на жировосковой основе;

средства для маникюра и ухода за ногтями;

мыло туалетное твердое;

соли для ванн, сухие средства для ванн;

зубные пасты;

средства гигиены полости рта жидкие;

средства для домашнего отбеливания зубов;

средства индивидуальной защиты дерматологические (далее - ДСИЗ) (например: защитные средства гидрофильного, гидрофобного, комбинированного действия, от воздействия низких температур, ветра, от воздействия ультрафиолетового излучения диапазонов A, B, C, от воздействия биологических факторов; очищающие средства; регенерирующие, восстанавливающие средства).

1.2. Методические рекомендации предназначены для оценки общетоксического и раздражающего действия вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой ПК продукции.

Методика может быть применена для скрининговой оценки ПК продукции в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.

1.3. Методические рекомендации предназначены для учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов ПК продукции, контроль ее качества и оценки соответствия, а также для органов и организаций, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор.

2.1. В качестве тест-объекта используются препараты "Эколюм" лиофилизированных люминесцентных бактерий или иных препараты бактериальной люциферазы. Методика основана на определении изменения интенсивности бактериальной биолюминесценции при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

2.2. Критерием токсического действия является измерение с помощью прибора "Биотокс-10" интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПК продукции по сравнению с раствором, не содержащей токсических веществ, или эталонной пробой. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

При изучении токсикологических свойств ПК продукции и ее химических ингредиентов люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на высшие животные, метод Драйзе, культуры клеток человека.

Токсическое действие исследуемой пробы определяется по ингибированию интенсивности ее биолюминесценции за 30 мин (в экспрессном варианте - 5 мин) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности "T".

2.3. Индекс токсичности "T", равный отношению T = 100 x (I₀ - I)/I₀, где I₀ и I соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с бактериальным препаратом.

Методика допускает три пороговых уровня индекса токсичности:

1 уровень - допустимая степень токсичности образца индекс токсичности T меньше 20;

2 уровень - образец токсичен индекс T равен или больше 20 и меньше 50;

3 уровень - образец сильно токсичен индекс токсичности T равен или более 50.

Выбор эталонных разведений определялся результатами сравнительной оценки исследования общей токсичности и кожно-раздражающего действия ПК продукции в эксперименте на лабораторных животных и определения индекса токсичности перечисленных групп ПК продукции с учетом выше указанного допустимого интервала индекса токсичности.

3.1. Измерительный прибор - люминометр типа "Биотокс-10" с набором кювет на 1,5 мл.

3.2. Лиофилизированная культура микроорганизмов "Эколюм" или иных препаратов бактериальной люциферазы, ТУ 2639-236-00209792-01.

3.3. Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1-2011, высокого класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

3.4. pH-метр любой марки с набором электродов.

3.5. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474.

3.6. Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру от -18 до 4 °C.

3.7. Пробирки с притертыми пробками объемом 3 - 5 мл, ГОСТ 1770-74.

3.8. Дозаторы лабораторные по ГОСТ 28311. Цилиндры вместимостью 25, 50 мл, второго класса точности, ГОСТ 1770.

3.9. Воронки делительные на 100 мл, типа ВД-1-100.

3.10. Фильтры АФА-ВП-10, ТУ 95-743-80 или обеззоленные типа ФОБ, ТУ 6-09-1678.

3.11. Стаканчики для взвешивания диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148.

3.12. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

3.13. Кислота соляная, ГОСТ 3118.

3.14. Натрия гидроокись, ГОСТ 4328.

3.15. Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174.

3.16. Спирт этиловый, химически чистые, ТУ 6-091710.

3.17. Кислота серная, ГОСТ 4204.

3.18. Термометр, предметное стекло (технические характеристики).

Допускается применение аналогичного оборудования и материалов с техническими и метрологическими характеристиками, а также реактивов по качеству не ниже указанных в пункте 3 методических указаний.

При их применении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.

4.1. Условия выполнения токсикологических испытаний.

При проведении испытаний в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

температура воздуха от +18 до 25 °C;

относительная влажность воздуха не более 80%;

атмосферное давление (84 - 106) кПа [(630 - 800 мм рт. ст.)];

частота переменного тока 50 +/- 1 Гц;

напряжение сети 220 +/- 10 В.

4.2. Отбор проб проводится по ГОСТ 29188.0-2014.

4.3. Приготовление экстрактов из образцов ПК продукции:

4.3.1. Из поступивших на испытания образцов одного наименования (не менее двух единиц) составляют объединенную пробу. Опытные образцы готовят путем разбавления испытуемых образцов в модельной среде (дистиллированная вода). В сосуд помещают объем жидкого образца (или навеску порошкового образца), заливают определенным объемом дистиллированной воды (комнатная температура, pH 7,0 - 7,4) и выдерживают определенное время (продолжительность экстракции).

Соотношение массы (объема) испытуемой продукции и объема модельной среды, а также продолжительность экстракции приведены в таблице 1.

ПК продукция, представляющая собой жиросодержащие средствами, требует периодического перемешивания в течение времени экстракции. В данных случаях после 1 часа экстракции осторожно отбирают водную фазу с помощью делительной воронки.

Средства для ухода за ногтями требуют предварительной подготовки. На предметное стекло (2 см * 2 см) ровным слоем наносят исследуемую навеску (1 г) образца и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания. Высушенную пробу переносят в сосуд с дистиллированной водой (комнатная температура, pH 7,0 - 7,4).

Не допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.

4.4. Подготовка прибора "Биотокс-10" и тест-объекта "Эколюм":

4.4.1. Подготовка прибора "Биотокс-10".

Подготовку прибора "Биотокс-10" проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

4.4.2. Регидратация биосенсора "Эколюм".

4.4.2.1. Вскрыть флакон с лиофилизированным препаратом "Эколюм".

4.4.2.2. Добавить 10 мл дистиллированной воды, pH 7,0 - 7,4 комнатной температуры для получения суспензии бактериального препарата. Рекомендуется использовать стерилизованную дистиллированную воду, а также несколько раз встряхнуть флакон с суспензией препарата.

Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии препарата перед отбором определенных объемов для проведения анализа.

4.4.2.3. Выдержать суспензию в течение 30 мин.

4.4.3. Определение рабочей концентрации биосенсора "Эколюм".

4.4.3.1. Измерить фоновое значение прибора "Биотокс-10" (по инструкции к прибору, при счете 10 сек без кюветы) и записать это значение.

4.5. Проведение измерений:

4.5.1. Добавить 0,1 мл суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (pH 7,0 - 7,4, комнатная температура).

4.5.2. Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции. Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающим фоновое значение прибора в 25 - 250 раз. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.

Если биосенсор стал меньше растворяться холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр.

4.5.3. В стандартном анализе приготовляют контрольный образец путем смешения в кювете от люминометра 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и 0,9 мл дистиллированной воды (pH 7,0 - 7,4). При приготовлении опытных образцов к 0,1 мл рабочей суспензии бактерий добавляют 0,9 мл пробы ПК продукции различного разведения в соответствии с таблицей 1 методических рекомендаций. Температура дистиллированной воды и образцов должна быть одинаковой. Указать значение температуры.

Измерение токсикологических параметров проводят с помощью прибора "Биотокс-10" в стандартном варианте через 30 мин экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 мин.

4.5.4. Контроль погрешности методики токсикологического анализа.

Контроль качества оценки токсичности объектов окружающей среды проводится по определению чувствительности используемых тест-организмов к модельному "эталонному" токсиканту цинку сернокислому 7-водного (ZnSO₄7H₂O). Расчет проводится по содержанию ионов цинка. Диапазон концентраций модельного токсиканта, при действии которого в течение 30 мин интенсивность биолюминесценции ингибируется на 50%, составляет 0,6 - 1,5 мг/л.

Удовлетворительные результаты, полученные при проверке диапазона реагирования люминесцентных бактерий на модельный токсикант, не обеспечивают гарантии адекватного реагирования организмов на другие токсиканты и тем более их смеси, однако регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.

Процедура определения диапазона реагирования тест-системы "Эколюм" на модельный токсикант проводится путем действия раствора, содержащего 4,4 мг/л цинка сернокислого при времени инкубации 30 мин с биосенсором. Должно происходить не менее чем 50% ингибирование интенсивности биолюминесценции по сравнению с контролем. В случае если эта величина меньше, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов.

4.6. Математическая обработка результатов измерений:

4.6.1. Результат токсикологического анализа в документах - индекс токсичности, предусматривающих его использование, представляется в виде:

где - среднее арифметическое определений, s - среднеквадратичное отклонение, P - уровень вероятности.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов трех (или более - до 10) параллельных измерений индекса токсичности. Индекс токсичности T вычисляется по формуле T = 100 x (I_контр - I_опыт)/I_контр, где I_контр и I_опыт соответственно интенсивности биолюминесценции бактерий в контрольной и опытной пробах.

Среднее квадратичное отклонение результатов определений количественного выражения тест-реакции - индекса токсичности вычисляется по формуле:

где x_i - i-й результат определений, n - число параллельных определений.

Среднее арифметическое результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:

Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором "Биотокс-10" автоматически по команде оператора.

Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности "T".

В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения "T" делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.

4.6.3. По величине индекса токсичности анализируемой пробы классифицируются на три группы в соответствии с таблицей 2.

Если при оценке токсичности продукции по величине индекса токсичности получено значение индекса токсичности более 20, то вывод о токсикологической безопасности продукции должен быть сделан после испытаний продукции альтернативными методами или методами in vivo.