"МУК 4.1.3931-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств эмамектина бензоата в бобах кофе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2023)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (С.В. Кузьмин, В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, С.Д. Добрев, А.А. Ивченкова).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой "03" июля 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для определения массовой концентрации эмамектина бензоата в бобах кофе в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг без разбавления, 0,01 - 10 мг/кг с учетом разбавления в 100 раз.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Эмамектин бензоат - смесь, содержащая 90% эмамектина бензоата B_1a и 10% эмамектина бензоата B_1b.

Эмамектин бензоат B_1a - (10E,14E,16E,22Z)-(1R,4S,5'S,6S,6'R,8R,12S,13S,20R,21R,24S)-6'-[(S)-втор-бутил]-21,24-дигидрокси-5',11,13,22-тетраметил-2-оксо-3,7,19-триоксатетрацикло[15.6.1.1^4,8.0^20,24] пентакоза-10,14,16,22-тетраен-6-спиро-2'-(5',6'-дигидро-2'H-пиран)-12-ил 2,6-дидеокси-3-O-метил-4-O-(2,4,6-тридеокси-3-O-метил-4-метиламино--L-ликсо-гексапранозил)--L-арабиногексопиранозид <1>.

Эмамектин бензоат B_1b - (10E,14E,16E,22Z)-(1R,4S,5'S,6S,6'R,8R,12S,13S,20R,21R,24S)-21,24-дигидрокси-6'-изопропил-5',11,13,22-тетраметил-2-оксо-3,7,19-триоксатетрацикло[15.6.1.1^4,8.0^20,24] пентакоза-10,14,16,22-тетраен-6-спиро-2'-(5',6'-дигидро-2'H-пиран)-12-ил 2,6-дидеокси-3-O-метил-4-O-(2,4,6-тридеокси-3-O-метил-4-метиламино--L-ликсо-гексопиранозил)--L-арабино-гексопиранозид <1>.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Брутто-формула - C₅₆H₈₁NO₁₅ (B1a); C₅₅H₇₉NO₁₅ (B1b). Молекулярная масса 1008,3 (B1a), 994,2 (B1b).

2.2. Кристаллический порошок, с органическим запахом, цвет от белого до грязно-белого. Температура плавления плюс 141 - 146 °C (с разложением при нагревании до плюс 300 °C). Давление паров 4·10^-3 мПа (плюс 25 °C). Плотность 1,2 г/см³. Растворимость в органических растворителях (при плюс 25 °C, г/дм³): октанол - 48, ацетон - 140, дихлорметан > 500, этилацетат - 81, метанол - 270, толуол - 26, гексан - 0,077, циклогексан - 0,23. Растворимость в воде при плюс 25 °C - 0,31 г/дм³ (дистиллированная вода, pH 6,5), 0,32 (буферный раствор, pH 5), 0,024 г/дм³ (буферный раствор, pH 7), 0,0001 (буферный раствор, pH 9). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow logP = 3,0 +/- 0,1 (pH 5), 5,0 +/- 0,2 (pH 7), 5,9 +/- 0,3 (pH 9). Гидролитически стабилен при pH 5 - 8 (плюс 25 °C).

2.3. Эмамектин бензоат - несистемный инсектицид кишечно-контактного действия для защиты томатов, виноградной лозы, капусты и других культур от широкого спектра личинок лепидоптеры.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Методика основана на определении эмамектина бензоата с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с масс-селективным детектором (далее - МСД).

4.2. Экстракцию эмамектина бензоата выполняют смесью воды и ацетонитрила, выделяют ацетонитрил из смеси высаливанием. Ацетонитрильный экстракт подвергают очистке сорбентами для дисперсионной твердофазной экстракции (далее - ТФЭ).

4.3. Нижний предел измерения эмамектина бензоата в анализируемом объеме пробы - 12,5 пг. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 5.1 - 5.3.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостные хроматографы.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать правила <2>.

--------------------------------

<2> "Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением" (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 - 30) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на высокоэффективном жидкостном хромато-масс-спектрометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Измерениям предшествуют следующие операции: приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, подвижной фазы, смесей солей для экстракции и очистки, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

8.2. Приготовление 0,1% водного раствора муравьиной кислоты (компонент А подвижной фазы). В мерную колбу вместимостью 500 см³ добавляют 200 см³ деионизованной воды, пипеткой на 1 см³ вносят 0,5 см³ концентрированной муравьиной кислоты и доводят водой до метки, тщательно перемешивают. Хранят не более 14-ти дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки.

Промывают колонку подвижной фазой при соотношении компонентов А и Б (компонент А приготовлен по п. 8.2., компонент Б - ацетонитрил) 95:5 и скорости подачи растворителя 0,4 см³/мин не менее 15 минут.

8.4. Приготовление смеси солей для экстракции. Для обработки одной пробы смешивают (4,00 +/- 0,01) г магния сернокислого, (1,00 +/- 0,01) г натрия хлористого, (1,00 +/- 0,01) г натрия лимоннокислого трехзамещенного и (0,50 +/- 0,01) г натрия лимоннокислого двузамещенного, 1,5-водного. Для каждой пробы готовится отдельное количество смеси. Смеси хранят в индивидуальной герметичной упаковке (не более 6 месяцев).

8.5. Приготовление смеси сорбентов для очистки экстрактов. Для очистки одной аликвоты экстракта в смешивают (150 +/- 5) мг сорбента для твердофазной экстракции на основе первичного-вторичного амина, (900 +/- 5) мг магния сернокислого и (150 +/- 5) мг твердофазного сорбента на основе октадецилсилана, закрывают в герметичную тару, хранят не более 6-ти месяцев.

При применении коммерческих наборов соблюдать инструкции производителя.

8.6. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.6.1. Исходный раствор эмамектина бензоата для градуировки (концентрация 1000 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,0100 +/- 0,0005 г эмамектина бензоата, добавляют 5 - 7 см³ ацетонитрила, перемешивают до полного растворения, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в герметично закрытой темной таре в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более полугода.

Растворы N 1 - 8 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

8.6.2. Раствор N 1 эмамектина бензоата для градуировки (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ исходного раствора эмамектина бензоата с концентрацией 1000 мкг/см³ (п. 8.6.1), доводят ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранят в герметично закрытой темной таре в морозильной камере (не выше минус 18 °C) 1 месяц.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов методом "добавок".

8.6.3. Раствор N 2 эмамектина бензоата для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора эмамектина бензоата с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 8.6.2), доводят ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранят в морозильной камере (не выше минус 18 °C) 1 неделю.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов методом "добавок".

8.6.4. Рабочие растворы N 3 - 8 эмамектина бензоата для градуировки (концентрация 0,0025 - 0,1 мкг/см³). В 6 мерных колб вместимостью 10 см³ помещают по 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 и 1,0 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией 1,0 мкг/см³ (п. 8.6.3), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 3 - 7 с концентрацией эмамектина бензоата 0,0025; 0,005; 0,01; 0,025; 0,05 и 0,1 мкг/см³, соответственно. Растворы используют свежеприготовленными.

8.7. Установление градуировочной характеристики. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации эмамектина бензоата устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки NN 3 - 8.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора, приготовленного по п. 8.6.4 и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Устанавливают площадь пика эмамектина бензоата.

8.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

Проводят измерения не менее двух образцов рабочих растворов для градуировки, содержание эмамектина бензоата в которых соответствует диапазону концентраций от 0,0025 до 0,1 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где A - величина расхождения, %;

X - концентрация эмамектина бензоата в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).

9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <3>, <4>, <5>.

--------------------------------

<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

<4> ГОСТ ISO 8455 "Межгосударственный стандарт. Кофе зеленый в мешках. Руководство по хранению и транспортированию".

<5> ГОСТ ISO 4072 "Межгосударственный стандарт. Кофе зеленый в мешках. Отбор проб".

9.2. Образцы хранят минимальные сроки (до двух недель) в негерметичных контейнерах, не допускающих конденсации влаги, в хорошо вентилируемом помещении, без прямого доступа солнечных лучей. Не допускается хранение при повышенной температуре. Долгосрочное хранение - при температуре не выше минус 18 °C.

10.1. Навеску измельченного кофе массой 5 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³. Добавляют 10 см³ воды. В пробирку заливают 10 см³ ацетонитрила, ставят на вихревой шейкер на 10 минут. Вносят в пробирку смесь солей для экстракции (п. 8.4). Закрывают крышкой и помещают на вихревой шейкер на 2 минуты. Затем пробу центрифугируют 5 мин при скорости вращения не менее 4500 оборотов/мин. Помещают в полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³ смесь сорбентов для очистки экстракта (п. 8.5), добавляют 6 см³ верхнего слоя, встряхивают вручную до полного смачивания порошков и помещают на вихревой шейкер на 2 минуты. Образец повторно центрифугируют 5 мин при скорости вращения не менее 4500 оборотов/мин. Экстракт (верхний слой в пробирке после центрифугирования) фильтруют через мембранный фильтр (размер пор не более 0,45 мкм) в виалу и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2.

10.2. Измерения выполняют на жидкостном хроматографе с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации при следующих режимных параметрах:

- режим ионизации: электроспрей (ESI), электростатическое напряжение плюс 5500 В;

- полярность: положительная;

- режим работы: мониторинг множественных реакций (MRM);

Параметры масс-спектрометрического детектора приведены в таблице 10.1.

- скорость сканирования: 100 мс;

- давление газовой завесы: 25 psi;

- давление газа 1: 50 psi;

- давление газа 2: 70 psi;

- температура осушающего газа: плюс 450 °C;

Условия хроматографирования:

- хроматографическая колонка стальная, длиной 50 мм, внутренним диаметром 2 мм, модифицированная полярная C18 с TMS эндкеппингом, зернением 4 мкм;

- температура колонки: плюс 40 °C;

- скорость потока элюента: 0,4 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 5 мм³;

- подвижная фаза: компонент А: 0,1% муравьиная кислота (приготовлена по п. 8.2); компонент Б: ацетонитрил.

Режим элюирования: градиентный, приведен в таблице 10.2.

Линейный диапазон детектирования 12,5 - 500 пг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,1 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом (не более чем в 100 раз).

11.1. Содержание эмамектина бензоата бобах кофе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где C - концентрация эмамектина бензоата, полученная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстрагента, добавленного в матрицу, см³ (10 см³);

m - масса анализируемого образца, г (5 г),

f - степень извлечения эмамектина бензоата из проб. Определяется конкретной лабораторией в процессе внедрения метода;

К_р - коэффициент разбавления (если экстракт подвергался разбавлению).

11.2. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (3):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (таблица 3.1), при этом .

При невыполнении условия (3) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание эмамектина бензоата в пробах - менее 0,01 мг/кг" <6>.

--------------------------------

<6> 0,01 мг/кг - предел количественного определения эмамектина бензоата в пробах кофе бобов.

Примечание: При необходимости выражать содержание эмамектин бензоата (X_{эм.бенз.}) в эквиваленте эмамектина (X_эм.) использовать коэффициент пересчета 0,879:

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6). Периодичность и формы контроля определяется системой менеджмента качества лаборатории.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением" (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

4. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

5. ГОСТ OIML R 111-1 "Межгосударственный стандарт. Государственная система обеспечения единства измерений".

6. ГОСТ 29227 "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

7. ГОСТ ISO 7886-1 "Межгосударственный стандарт. Шприцы инъекционные однократного применения стерильные".

8. ГОСТ Р 52501 "Межгосударственный стандарт. Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

9. ГОСТ 5848 "Государственный стандарт союза ССР. Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия.

10. ГОСТ 4233 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

11. ГОСТ 4166 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия".

12. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) "Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

13. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

14. ГОСТ 12.1.007 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

15. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

16. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

17. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

18. ГОСТ 22280 "Межгосударственный стандарт. Натрий лимоннокислый трехзамещенный. Технические условия".

19. ГОСТ ISO 8455 "Межгосударственный стандарт. Кофе зеленый в мешках. Руководство по хранению и транспортированию".

20. ISO 4072 "Межгосударственный стандарт. Кофе зеленый в мешках. Отбор проб".