"МУК 4.1.3697-21. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания растворимых и нерастворимых пищевых волокон в пищевой продукции, в том числе БАД к пище. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.06.2021)

1. Разработаны ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (В.А. Тутельян, В.В. Бессонов, М.Н. Богачук, Д.О. Боков, Ю.В. Ведищева, А.Д. Малинкин, М.С. Масленникова, Е.П. Хромченкова).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 15 июня 2021 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы другими испытательными лабораториями (центрами), осуществляющими контроль качества и безопасности биологически активных добавок к пище и продукции пищевой специализированной, аккредитованными в установленном порядке. <1>

--------------------------------

<1> Федеральный закон от 28.12.2013 N 412-ФЗ "Об аккредитации в национальной системе аккредитации".

МУК регулируют порядок определения растворимых и нерастворимых пищевых волокон ферментно-гравиметрическим методом в пищевых продуктах и БАД к пище.

1.2. МУК устанавливают методику определения растворимых и нерастворимых пищевых волокон ферментно-гравиметрическим методом в пищевых продуктах и БАД к пище в диапазоне 0,5 - 100 г/100 г.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Метрологические характеристики метода.

3.1. Пищевые волокна (далее - ПВ) представляют собой полисахариды, не поддающиеся эндогенному ферментолизу в тонком кишечнике, относящиеся к группе структурных биологически активных веществ. Наряду с белками, жирами и углеводами ПВ относятся к макронутриентам.

ПВ по растворимости в воде разделяют на две группы: растворимые и нерастворимые. Основной функцией первых является их пребиотическое действие, тогда как нерастворимая фракция служит в основном для нормализации моторно-эвакуаторной функции желудочно-кишечного тракта.

К растворимым пищевым волокнам относят: пектины; камеди; агар морских водорослей, содержащий этерифицированные остатки D- и L-галактозы; альгиновую кислоту, состоящую из остатков D-маннуроновой кислоты и др. На рис. 1 и 2 приведены фрагменты полисахаридных цепей, характерных для пектина (D-галактуроновая цепь), и гуаровой камеди (галактоманнан).

Основными представителями нерастворимых пищевых волокон являются целлюлоза и хитозан (рис. 3).

Водосвязывающая способность. ПВ обладают высокой водосвязывающей способностью. Растворимые пищевые волокна, такие как пектины и камеди, характеризуются более высокой водосвязывающей способностью, чем нерастворимые (например - целлюлоза и хитозан).

Вязкость. Многие виды пищевых волокон могут образовывать гели с высокой вязкостью (пектины, камеди, полисахариды морских водорослей, каррагинан).

Чувствительность к гидролизу. Пищевые волокна устойчивы к действию пищеварительных ферментов человека. В то же время они ферментируются микрофлорой толстого кишечника. Нерастворимые пищевые волокна наиболее устойчивы к ферментации, тогда как растворимые гидролизуются полностью. Независимо от типа полисахаридов, гидролиз приводит к образованию короткоцепочечных жирных кислот, в том числе ацетата, пропината и бутирата, а также углекислого газа и воды.

Ингибирование пищеварительных ферментов. Некоторые виды пищевых волокон ингибируют активность панкреатических пищеварительных ферментов, гидролизующих белки, жиры и углеводы.

Катионообменные свойства. Многие виды пищевых волокон проявляют катионообменные свойства за счет наличия в них карбоксильных, гидроксильных аминогрупп, уроновых кислот и др. Это обусловливает возможности ПВ связывать минеральные вещества в желудочно-кишечном тракте.

Ферментно-гравиметрический подход к определению пищевых волокон заключается в удалении из исследуемого образца крахмала, белка и жира, определении в высушенном и взвешенном остатке негидролизованной части белка и золы и принятии оставшегося сухого остатка за сумму ПВ, которые у человека в неизмененном виде поступают в толстый кишечник.

С учетом специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией по отбору проб для определения токсичных элементов для каждого конкретного вида продукции.

4.1. Метод основан на определении содержания пищевых волокон после обезжиривания (при содержании жира более 10%) и гидролиза белка и усвояемых углеводов протео- и амилолитическими ферментами. Нерастворимую фракцию ПВ определяют по массе остатка на фильтре после фильтрования гидролизата (за вычетом массы негидролизованного белка и золы). Растворимую фракцию ПВ определяют осаждением ее из фильтрата этиловым спиртом, фильтрованием и взвешиванием массы сухого остатка на фильтре.

Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, материалов и реактивов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. Условия измерений должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемое оборудование и материалы.

7.1.1. Приготовление 0,275 М раствора натрия гидроокиси.

Навеску натрия гидроокиси 11,00 г (с точностью до 0,01 г) помещают в мерную колбу объемом 1000 см³, добавляют 700 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения натрия гидроокиси; после охлаждения раствора до комнатной температуры доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

7.1.2. Приготовление 0,325 М раствора соляной кислоты.

Приготовление 1 М раствора соляной кислоты из концентрированной соляной кислоты. 600 см³ дистиллированной воды помещают в мерную колбу объемом 1000 см³, добавляют 80 см³ соляной кислоты концентрированной и перемешивают; после охлаждения раствора до комнатной температуры доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Срок хранения приготовленного раствора составляет 6 месяцев при комнатной температуре.

Приготовление 0,325 М раствора соляной кислоты из 1 М раствора соляной кислоты. 600 см³ дистиллированной воды помещают в мерную колбу объемом 1000 см³, добавляют 325 см³ 1 М раствора соляной кислоты и перемешивают; после охлаждения раствора до комнатной температуры доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Срок хранения приготовленного раствора составляет 6 месяцев при комнатной температуре.

7.1.3. Приготовление фосфатного буфера.

Навеску 1,40 г (с точностью 0,01 г) натрия фосфорнокислого двухзамещенного безводного и 9,70 г (с точностью 0,01 г) натрия фосфорнокислого однозамещенного моногидрата помещают в мерную колбу объемом 1000 см³. Добавляют 700 см³ дистиллированной воды, перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения компонентов, доводят до метки дистиллированной водой. После приготовления доводят до pH 6,0 +/- 0,2 путем добавления разбавленного раствора соляной кислоты либо слабого раствора натрия гидроокиси.

7.1.4. Приготовление рабочего раствора протеазы.

10 мг фермента помещают в мерную колбу подходящего объема (в зависимости от количества исследуемых образцов), растворяют в 1,0 см³ дистиллированной воды, доводят до метки дистиллированной водой (из расчета на 1 образец продукции, исследуемый в двух параллелях). Раствор протеазы готовят непосредственно перед применением.

Образец измельчают в лабораторной мельнице.

При содержании жира в образце более 10% проводят обезжиривание образца исчерпывающей экстракцией гексаном.

7.3.1. Ферментативный гидролиз проводится в три этапа.

7.3.1.1. Этап I.

Навеску испытуемого образца 1,00 г (с точностью до 0,01 г) помещают в колбу вместимостью 500 см³. На один образец проводят два параллельных исследования.

Добавляют 50 см³ раствора фосфатного буфера. Перемешивают на магнитной мешалке до получения суспензии с равномерным распределением частиц по всей толще буфера. Проверяют pH и при необходимости доводят pH до 6,0 +/- 0,2, добавляя раствор натрия гидроокиси или раствор соляной кислоты.

В полученный раствор добавляют 100 мм³ , медленно перемешивая. Закрывают алюминиевой фольгой и инкубируют в кипящей водяной бане в течение 30 минут, осторожно встряхивая каждые 5 минут. Вынимают колбы с растворами образцов из бани и, не снимая алюминиевой фольги, охлаждают до комнатной температуры (20 +/- 2) °C.

7.3.1.2. Этап II.

Снимают алюминиевую фольгу и смывают все остатки образца со стенок колбы в раствор образца 10 см³ дистиллированной воды; в случае образования гелеподобных комплексов на дне колбы их также тщательно размешивают. Споласкивают стенки колбы 10 см³ дистиллированной воды в раствор образца.

Доводят pH раствора образца до 7,5 +/- 0,1, добавляя 10 - 12 см³ 0,275 М раствора натрия гидроокиси. Добавляют 500 мм³ раствора протеазы в каждую колбу. Закрывают алюминиевой фольгой и инкубируют в бане при температуре (60 +/- 1) °C в течение 30 минут, непрерывно перемешивая. Начинают отсчет времени, когда температура бани достигнет 60,0 °C. Вынимают колбы с растворами образцов из бани и, не снимая алюминиевой фольги, охлаждают до комнатной температуры (20 +/- 2) °C.

7.3.1.3. Этап III.

Доводят pH раствора образца до 4.0 - 4.6, добавляя 12 - 15 см³ 0,325 М раствора соляной кислоты. Добавляют 300 мм³ раствора амилоглюкозидазы в каждую колбу. Закрывают алюминиевой фольгой и инкубируют в бане при температуре (60 +/- 1) °C в течение 30 минут, непрерывно перемешивая. Начинают отсчет времени, когда температура бани достигнет 60 °C. Вынимают колбы с растворами образцов из бани и, не снимая алюминиевой фольги, охлаждают до комнатной температуры (20 +/- 2) °C.

7.3.2. Определение содержания нерастворимой фракции пищевых волокон.

Растворы образцов фильтруют под вакуумом (30 мм рт. ст. - 40 кПа), используя водяной аспиратор или вакуумный насос, через 1,0 г целита (целит предварительно высушивают при температуре 130 °C в течение 3 часов и остужают до комнатной температуры в эксикаторе), смоченного несколькими см³ дистиллированной воды и равномерно распределенного по поверхности предварительно взвешенных фильтровальных тиглей. Споласкивают колбу 2 раза 10 см³ дистиллированной воды до полного смывания всех остатков со стенок колбы в тигель.

Смешивают фильтрат с промывочной водой и используют для определения содержания растворимой фракции пищевых волокон.

Промывают остаток на фильтровальных тиглях 2 раза по 10 см³ дистиллированной водой, затем 2 раза по 10 см³ 95%-м этиловым спиртом, после чего промывают 2 раза по 15 см³ ацетоном.

Сушат тигель в течение 3 часов при температуре (130 +/- 5) °C. Охлаждают в эксикаторе в течение 30 минут. Взвешивают тигель с точностью до 0,1 мг.

7.3.3. Определение содержания растворимой фракции пищевых волокон.

Берут смешанный фильтрат образца с промывочной водой (п. 6.3.2), определяют объем и добавляют 4 объема 95%-го этилового спирта, разогретого до 60 °C; смывают со стенок остатки в раствор, используя часть этилового спирта.

Отстаивают при комнатной температуре не менее 2 часов - до образования преципитата.

Фильтруют под вакуумом, используя водяной аспиратор или вакуумный насос (30 мм рт. ст. - 40 кПа), через 1,0 г целита, смоченного несколькими см³ 78%-го этилового спирта и равномерно распределенного по поверхности предварительно взвешенных фильтровальных тиглей. Используют 78%-й этиловый спирт для смывания всех частиц со стенок колбы в тигель.

Промывают остаток 3 раза по 20 см³ 78%-м этиловым спиртом, затем 2 раза по 10 см³ 95%-м этиловым спиртом, после чего промывают 2 раза по 15 см³ ацетоном.

Сушат тигель в течение 3 часов при температуре (130 +/- 5) °C. Охлаждают в эксикаторе в течение 30 минут. Взвешивают тигель с точностью до 0,1 мг.

7.3.4. Холостой опыт.

Холостой опыт используют для корректировки данных по содержанию нерастворимой и растворимой фракций пищевых волокон в связи с возможным осаждением белкового осадка ферментов, а также учета зольности целита. Холостой опыт проводят согласно пп. 6.3.1 - 6.3.3, но без навески исследуемого образца. Холостой опыт проводят при использовании как новых партий ферментов, так и при использовании новой партии целита.

Содержание нерастворимой фракции пищевых волокон в продуктах (%) определяют по следующей формуле:

где M₁ = M_{1 общая} - (M_{1 целита} + M_{1 тигля}).

Содержание растворимой фракции пищевых волокон в продуктах (%) определяют по следующей формуле:

или, пренебрегая содержанием белка и золы в растворимой фракции пищевых волокон:

C₁ - содержание нерастворимой фракции пищевых волокон в продукте, %;

C_{1 белок} - содержание белка в высушенном остатке после первой фильтрации (п. 6.3.2), г;

C_1зола - содержание золы в высушенном остатке после первой фильтрации (п. 6.3.2), г;

M₁ - масса высушенного остатка после первой фильтрации (п. 6.3.2), г;

M_{1 общая} - масса высушенных фильтровальных тиглей с целлитом и остатком после первой фильтрации, г;

M_{1 целита} - масса целита, использованного при первой фильтрации, г;

M_{1 тигля} - масса фильтровального тигля, использованного при первой фильтрации, г;

B₁ - масса высушенного остатка после первой фильтрации (холостой опыт) за вычетом содержащегося целлита, г;

C₂ - содержание растворимой фракции пищевых волокон в продукте, %;

C_{2 белок} - содержание белка в высушенном остатке после второй фильтрации (п. 6.3.3), г;

C_{2 зола} - содержание золы в высушенном остатке после второй фильтрации (п. 6.3.3), г;

M₂ - масса высушенного остатка после второй фильтрации (п. 6.3.3), г;

M_{2 общая} - масса высушенных фильтровальных тиглей с целлитом и остатком после второй фильтрации, г;

M_{2 целита} - масса целита, использованного при второй фильтрации, г;

M_{2 тигля} - масса фильтровального тигля, использованного при второй фильтрации, г;

B₂ - масса высушенного остатка после второй фильтрации (холостой опыт) за вычетом содержащегося целита, г;

M - масса навески образца продукта, г.

8.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

C₁, C₂ - результаты параллельных определений содержания пищевых волокон в образце, %;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

8.3. Если условие (п. 8.2) не выполняется, получают еще два результата в полном соответствии с данной методикой измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов четырех определений, если выполняется условие:

C_max, C_min - максимальное и минимальное значения из полученных четырех результатов параллельных определений пищевых волокон в образце, %;

CR_0,95 - значение критического диапазона для уровня вероятности P = 0,95 и n - результатов определений.

Для n = 4:

- показатель повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (п. 8.3) не выполняется, выясняют причины превышения критического диапазона, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики.

9.1. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми по п. 8.2, 8.3, %;

- значение относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Документ или запись удостоверяет лицо, проводившее измерения, а при необходимости - руководитель организации (предприятия), подпись которого заверяют печатью организации (предприятия).

10.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности и показателя правильности по ГОСТ Р ИСО 5725-6. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории. Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

11.1. К выполнению измерений и обработке результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное образование, прошедшие обучение, освоившие метод анализа и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности анализа.