"МУК 4.1.3555-19. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение токсинов T-2 и HT-2 методом ВЭЖХ-МС с иммуноаффинной очисткой на колонках. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.10.2019)

1. Разработаны ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (В.А. Тутельян, И.Б. Седова, М.Г. Киселева, А.Д. Малинкин, З.А. Чалый, Л.П. Захарова, Т.В. Аристархова).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 09 октября 2019 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной или ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС или УВЭЖХ-МС/МС) с предварительной очисткой на иммуноаффинных колонках для определения массовой доли токсинов T-2 и HT-2 в зерне и зернопродуктах, в том числе в специализированной продукции для питания детей, беременных и кормящих женщин, в диапазоне от 0,0015 до 0,15 мг/кг и от 0,0075 до 0,15 мг/кг соответственно.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Токсин T-2 - трихотеценовый микотоксин, продуцируемый плесневыми рода Fusarium; наиболее распространенными продуцентами являются грибы F. sporotrichiella; высокотоксичен для эукариотических организмов.

Рациональное название: (3aR,12cS)-3a,12c дигидро-8-гидрокси-6-метокси-7H-фуро[3',2':4,5]фуро[2,3-c] ксантен-7-он.

CAS N: 21259-20-1.

T-2: R₁=OH, R₂=R₃=OAc, R₄=H, R₅=OCOCH₂CH(CH₃)₂

HT-2: R₁=R₂=OH, R₃=OAc, R4=H, R₅=OCOCH₂CH(CH₃)₂

Физические свойства: белое кристаллическое вещество, не имеет максимумов поглощения в УФ-спектре при длине волны более 210 нм, не обладает флуоресценцией; T-2 токсин хорошо растворим в бензоле, ацетоне, этилацетате, спиртах, практически не растворим в воде и гексане. Температура плавления T-2 токсина 151 - 152 °C.

Токсичность: токсин T-2 является одним из наиболее опасных микотоксинов и обладает высокой острой токсичностью (LD₅₀ для различных видов животных составляет 3 - 10,5 мг/кг массы тела). Обладает нейротоксическим, геморрагическим, лейкопеническим, иммунодепрессивным, дерматотоксическим, тератогенным действием. Международное агентство по изучению рака (МАИР) относит токсин T-2 к группе 3B: соединение, не канцерогенное для человека.

2.2. HT-2 токсин - производное токсина T-2.

Рациональное название: Трихотец-9-ен(, , , 15-тетрол), 12,13-эпокси-, 15-ацетат 8-изовалерат.

CAS N: 26934-87-2.

Физические свойства: белое кристаллическое вещество, не имеет максимумов поглощения в УФ-спектре при длине волны более 210 нм, не обладает флуоресценцией; токсин HT-2 растворим в дихлорметане (5 мг/мл). Температура плавления токсина HT-2 - 128 - 133 °C.

Токсичность: токсин HT-2 менее токсичен, чем токсин T-2. Обладает нейротоксическим, геморрагическим, лейкопеническим, иммунодепрессивным, дерматотоксическим, тератогенным действием.

3.1. При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций (согласно ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)).

4.1. Методика основана на определении токсинов T-2 и HT-2 с помощью высокоэффективной или ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием в режиме электрораспылительной ионизации. Подготовка пробы включает в себя экстракцию метанольным раствором с последующим выделением аналитов на иммуноаффинных колонках. Идентификацию аналитов проводят по совпадению времен удерживания, присутствию аналитических сигналов заявленных количественных и качественных переходов материнский - дочерний ионы и соответствию их соотношения с таковым в стандартных образцах (возможное отклонение +/- 30%). Количественное определение проводится методом внешней абсолютной калибровки.

Примечание: допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также материалов и реактивов по качеству не ниже указанных в настоящем документе.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

6.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <1>.

--------------------------------

<1> ГН 2.2.5.3532-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 13.02.2018 N 25; ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 19.12.2007 N 89.

7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

8.1. Отбор проб продовольственного сырья и пищевых продуктов на анализ проводят в соответствии с нормативным документом, регламентирующим отбор проб на конкретный вид продукции, в частности, продукты пищевые - по ГОСТ 33303, продукты пищевые консервированные - по ГОСТ 8756.0.

9.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: приготовление стандартных и градуировочных растворов, приготовление растворов для экстракции, приготовление подвижной фазы, подготовка проб для анализа.

10.1.1. Приготовление стандартного раствора токсина T-2.

Для приготовления стандартного раствора токсина T-2 с концентрацией 10 000 нг/см³ сухой стандарт массой 1,0 мг количественно переносят в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки метанолом.

Раствор хранят в холодильнике при температуре минус (18 +/- 2) °C не более 12 мес.

10.1.2. Приготовление стандартного раствора токсина HT-2.

Для приготовления стандартного раствора токсина HT-2 с концентрацией 10 000 нг/см³ сухой стандарт токсина массой 1,0 мг количественно переносят в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки метанолом.

Раствор хранят в холодильнике при температуре минус (18 +/- 2) °C не более 12 мес.

10.1.3. Приготовление стандартного раствора смеси токсинов T-2 и HT-2.

Для приготовления стандартного раствора смеси токсинов с массовой концентрацией токсинов T-2 и HT-2 по 1 000 нг/см³ в виалу объемом 4 см³ переносят 0,4 см³ стандартного раствора токсина T-2, 0,4 см³ стандартного раствора токсина HT-2 и добавляют 3,2 см³ метанола. Перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре минус (18 +/- 2) °C не более 12 мес.

Для определения содержания токсинов T-2 и HT-2 готовят градуировочные растворы их смеси с массовой концентрацией: 100 нг/см³ (раствор 8), 50 нг/см³ (раствор 7), 25 нг/см³ (раствор 6), 12,5 нг/см³ (раствор 5), 6,25 нг/см³ (раствор 4), 3,125 нг/см³ (раствор 3), 1,56 нг/см³ (раствор 2), 0,63 нг/см³ (раствор 1).

Для приготовления раствора 8 в виалу объемом 4 см³ переносят 0,2 см³ стандартного раствора смеси токсинов T-2 и HT-2 с массовой долей 1000 нг/см³ (п. 8.1.3) и 1,8 см³ метанола. Перемешивают.

Для приготовления раствора 7 в виалу объемом 4 см³ переносят 0,15 см³ стандартного раствора смеси токсинов T-2 и HT-2 с массовой долей 1000 нг/см³ (п. 8.1.3) и 2,85 см³ метанола. Перемешивают.

Для приготовления раствора 6 в виалу объемом 4 см³ переносят 0,5 см³ раствора 8 и 1,5 см³ метанола. Перемешивают.

Для приготовления раствора 5 в виалу объемом 4 см³ переносят 0,5 см³ раствора 7 и 1,5 см³ метанола. Перемешивают.

Для приготовления раствора 4 в виалу объемом 4 см³ переносят 0,5 см³ раствора 6 и 1,5 см³ метанола. Перемешивают.

Для приготовления раствора 3 в виалу объемом 4 см³ переносят 0,5 см³ раствора 5 и 1,5 см³ метанола. Перемешивают.

Для приготовления раствора 2 в виалу объемом 4 см³ переносят 0,5 см³ раствора 4 и 1,5 см³ метанола. Перемешивают.

Для приготовления раствора 1 в виалу объемом 4 см³ переносят 0,6 см³ раствора 2 и 0,9 см³ метанола. Перемешивают.

Растворы хранят в холодильнике при температуре минус (18 +/- 2) °C не более 6 мес. Перед проведением измерений растворы доводят до комнатной температуры, перемешивают и переносят по 0,5 - 1 см³ в хроматографические виалы.

Фосфатно-солевой буфер можно приготовить двумя способами.

Способ 1. Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10 - 20 см³ дистиллированной воды. Перемешивают до полного растворения солей. Доводят объем раствора до метки и перемешивают.

Способ 2. Фосфатно-солевой буфер из таблетированной смеси готовят в соответствии с инструкцией производителя. В мерную колбу на 100 см³ помещают 1 таблетку смеси солей, добавляют дистиллированную воду, перемешивают, доводят до метки. Полученный раствор имеет pH = 7,4.

Раствор хранят в колбе с притертой пробкой в холодильнике при температуре (4 +/- 1) °C не более 1 мес.

Вследствие хранения при низкой температуре возможно выпадение осадка солей. Для растворения осадка обычно достаточно довести раствор до комнатной температуры или немного нагреть на водяной бане.

Для подготовки пробы (п. 8.6) используют фосфатно-солевой буфер комнатной температуры.

В колбу вместимостью 500 см³ отмеряют цилиндром объемом 500 см³ 350,0 см³ метанола, а затем 150,0 см³ дистиллированной воды. Раствор тщательно перемешивают.

Раствор хранят в герметично упакованной емкости при комнатной температуре не более 12 мес.

Хроматографическое разделение компонентов пробы проводят в режиме изократического или градиентного элюирования. Компоненты подвижной фазы - метанол и вода. Параметры элюирования оптимизируют для конкретной хроматографической колонки с целью достижения достаточного разделения компонентов пробы за приемлемое время анализа.

В качестве примера приведен состав подвижных фаз для изократического элюирования токсинов на аналитической ВЭЖХ колонке длиной 150 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненной силикагелем с привитыми группами октадецилсилана (размер частиц - 3,5 мкм, пор - , содержание углерода - 10%) (пункт 10.5.1) и градиентного элюирования на УВЭЖХ колонке длиной 100 мм с внутренним диаметром 2,1 мм, заполненной силикагелем с привитыми группами октадецилсилана (размер частиц - 1,9 мкм, пор - , содержание углерода - 13%) (п. 10.5.2).

10.5.1. Для разделения компонентов проб в изократическом режиме элюирования используют подвижную фазу метанол - вода (80:20 об. %). Для приготовления подвижной фазы в колбу вместимостью 500 см³ отмеряют цилиндром на 500 см³ 400,0 см³ метанола, а затем 100,0 см³ воды для лабораторного анализа второй степени чистоты. Раствор тщательно перемешивают и фильтруют с помощью установки для вакуумного фильтрования и дегазирования подвижной фазы.

Подвижную фазу хранят в колбе с притертой пробкой или в герметично упакованной емкости не более 1 мес.

10.5.2. Градиентное элюирование осуществляют с помощью бинарного хроматографического насоса:

- фаза А: вода для лабораторного анализа первой степени чистоты;

- фаза Б: метанол для градиентной жидкостной хроматографии.

Перед проведением измерений подвижные фазы фильтруют с помощью установки для вакуумного фильтрования и дегазирования подвижной фазы. При использовании приведенного выше градиентного элюирования обязательно наличие в хроматографической системе дегазирующего устройства. В противном случае в подвижную фазу А добавляют 20 - 40% метанола и вновь подбирают схему градиента.

Фаза А не хранится, перед каждой серией анализов готовят свежую фазу А. Фаза Б хранится в соответствии с указаниями производителя растворителя.

Отобранные пробы измельчают в течение нескольких минут в лабораторной мельнице до однородного состояния, размер частиц не должен превышать 0,5 мм.

В химическом стакане/колбе Эрленмейера объемом 250 см³ или центрифужной пробирке объемом 225 см³ взвешивают 20,0 г однородного и мелко измельченного образца, добавляют 100 см³ раствора для экстракции и 2,0 г хлорида натрия, закрывают пробку/завинчивают крышку. Экстракцию проводят в течение 30 минут: сначала на аппарате для встряхивания проб (10 минут), затем в ультразвуковой ванне (10 минут) и вновь на аппарате для встряхивания проб (10 минут). Полученный экстракт фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента" или центрифугируют в течение 15 минут при не менее 4000 об./мин.

Выделение аналитов и их очистку от компонентов матрицы проводят на иммуноаффинных колонках. Условия хранения и сроки годности колонок - в соответствии с рекомендациями производителя. Обычно колонки хранят в холодильнике при температуре (2 - 8) °C. Перед использованием необходимое количество колонок должно быть обязательно доведено до комнатной температуры.

Отбирают 7 см³ фильтрата/надосадочной жидкости и добавляют 28 см³ фосфатно-солевого буферного раствора, pH 7,4, перемешивают. 25 см³ фильтрата наносят на иммуноаффинную колонку со скоростью не более 2 см³/мин. Промывают 20 см³ дистиллированной воды со скоростью не более 5 см³/мин, продувают колонку воздухом из шприца с разъемом типа Луер Лок для удаления остаточной жидкости. Токсины элюируют с колонки со скоростью 1 капля в секунду 1,5 см³ метанола в пробирки полимерные центрифужные типа "Эппендорф" вместимостью 2 см³. Прямое элюирование в хроматографические виалы нецелесообразно, так как образование пузыря воздуха в узком горлышке виалы может привести к потере элюата. Для обеспечения полноты извлечения аналитов во время элюирования рекомендуется проводить обратную промывку патрона, поднимая и опуская плунжер шприца для обеспечения потока метанола в противоположных направлениях, повторяют 3 раза. Элюат переносят в хроматографическую виалу вместимостью 2 см³.

Для настройки масс-спектрометрического детектора устанавливают следующие параметры, представленные в табл. 2.

--------------------------------

<2> В качестве ориентировочных ниже приведены значения для тройных квадрупольных масс-детекторов: 6410 TripQuad LC/MS, Agilent Technologies: напряжение на капилляре 4000 В; температура источника - 100 °C; температура газа осушителя (десольватации) (азот) - 350 °C; давление небулайзера - 60 psi (4,14 Бар); TSQ Endura, HESI, Thermo Scientific: напряжение на капилляре 4 900 В, температура подогреваемого капилляра - 350 °C; температура испарителя - 400 °C; скорость потока оболочного газа - 35 ед.; скорость потока вспомогательного газа - 15 ед.; скорость потока сметающего газа - 25 ед.; давление газа для соударений - 1,5 mTorr.

Условия детектирования оптимизируют в ручном или автоматическом режиме. Для этого используют стандартные растворы токсинов T-2 и HT-2 (п. 10.1.1, 10.1.2). Токсины детектируют в виде аддуктов [M+Na]⁺. Выбирают следующие материнские и дочерние ионы: токсин T-2: материнский ион 489 а.е.м., дочерние - 245, 327 и 387 а.е.м; токсин HT-2: материнский ион 447 а.е.м., дочерние - 345, 285 а.е.м. Определяют значения напряжения на фрагменторе и энергии соударения для указанных переходов. Наиболее интенсивные переходы выбирают для количественного анализа, остальные - подтверждающие. Примеры приведены в табл. 3.

--------------------------------

<3> В качестве ориентировочных приведены значения для тройных квадрупольных масс-детекторов. (I) для 6410 TripQuad LC/MS, Agilent Technologies; (II) TSQ Endura, HESI, Thermo Scientific.

Сравнение интенсивностей мониторинга множественных реакций (MRM) переходов, полученных для аналита в пробе и стандарте, проводят с помощью программного обеспечения, возможное отклонение +/- 30%.

--------------------------------

<4> В качестве примера отношений интенсивностей переходов для токсинов T-2 и HT-2 ниже приведены значения для тройного квадрупольного масс-детектора 6410 TripQuad LC/MS, Agilent Technologies.

Хроматографическое разделение компонентов пробы проводят в режиме изократического или градиентного элюирования. Параметры элюирования оптимизируют для конкретной хроматографической колонки с целью достижения достаточного разделения компонентов пробы за приемлемое время анализа.

--------------------------------

<5> В качестве примера приведены условия ВЭЖХ для изократического элюирования токсинов на аналитической колонке длиной 150 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненной силикагелем с привитыми группами октадецилсилана (размер частиц - 3,5 мкм, пор - , содержание углерода - 10%) (Agilent Zorbax SB-C18, 150 x 4,6 мм, 3,5 мкм) и градиентного элюирования на УВЭЖХ колонке длиной 100 мм с внутренним диаметром 2,1 мм, заполненной силикагелем с привитыми группами октадецилсилана (размер частиц - 1,9 мкм, пор - , содержание углерода - 13%) (Titan C18, 100x2,1 мм, 1,9 мкм).

Перед проведением измерений виалы с серией градуировочных растворов смеси токсинов T-2 и HT-2 доводят до комнатной температуры.

Хроматографическую систему кондиционируют подвижной фазой до установления стабильной базовой линии в условиях и порядке, рекомендуемых изготовителем. Для уравновешивания системы в качестве первых двух вколов последовательности рекомендуется использовать градуировочный раствор 8 и раствор для экстракции (п. 10.4), которые не учитываются в расчетах. Объем вкола 10 x 10^-3 см³ (10 мкл).

Для получения 8 точек на градуировочной кривой необходимо получить хроматограммы всех восьми градуировочных растворов, объем вкола 10 x 10^-3 см³ (10 мкл).

Проводят 2 параллельных измерения серии градуировочных образцов (в начале и в конце последовательности) и по 2 параллельных измерения анализируемых проб.

Образцы, дающие большие пики, чем градуировочный раствор 8, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 20 раз).

11.3.1. Построение градуировочных графиков.

В соответствии с данными, полученными при измерении градуировочных растворов, создают калибровочную таблицу, содержащую наименование, время удерживания, концентрацию и площадь хроматографического пика для каждого токсина. Определение площади аналитов выполняют в автоматическом режиме системой обработки данных хроматографа. На основании калибровочной таблицы вручную или в автоматическом режиме строят градуировочный график зависимости аналитических сигналов (площади хроматографического пика, соответствующего количественному переходу материнский - дочерний ион) двух параллельных измерений серии градуировочных образцов от содержания аналита в растворе.

Оценивают линейность и воспроизводимость результатов калибровки. При необходимости удаляют единичные выпадающие результаты. Коэффициент линейной корреляции полученной градуировочной зависимости должен быть не менее 0,97, а полученные результаты измерений не должны отличаться от действительного значения концентрации определяемых веществ в градуировочном растворе более чем на 15%, относительное стандартное отклонение времени удерживания аналитов - не более чем на 5%. При невыполнении этого условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их. В случае невыполнения указанного критерия стабильности градуировочной характеристики проводят новую градуировку.

Проведение градуировки обязательно выполнять при каждом измерении.

11.3.2. Контроль аналитической системы.

Контроль стабильности результатов измерений (повторяемости, промежуточной прецизионности и погрешности) проводят в соответствии с порядком, установленным в лаборатории, по ГОСТ ИСО 5725-6 (п. 6.2).

Контроль аналитической системы осуществляется при условиях, указанных в п. 9, перед началом проведения измерений, а также при смене хроматографической колонки, чистке блоков аналитического прибора и т.д.

11.4.1. Расчет содержания токсина в пробе.

Массовую долю токсина T-2 (HT-2), мг/кг, вычисляют по формуле:

Cx - объемная концентрация аналита, нг/см³;

Vр - объем раствора для экстракции; в данном случае 100 см³;

Vэ - объем элюата; в данном случае 1,5 см³;

Vа - аликвота неразбавленного экстракта, нанесенного на иммуноаффинную колонку; в данном случае 5 см³;

M - масса анализируемой пробы; в данном случае 20 г;

1000 - коэффициент, введенный для пересчета массовой доли токсина, рассчитанной в единицах нг/г (что эквивалентно мкг/кг) в мг/кг. За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных измерений, если удовлетворяются условия повторяемости.

11.4.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (2):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (2) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг,

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

- содержание токсина HT-2 в пробе - менее 0,0075 мг/кг;

Примечание: 0,0075 мг/кг - предел количественного определения токсина HT-2.

- содержание токсина T-2 в пробе - менее 0,0015 мг/кг.

Примечание: 0,0015 мг/кг - предел количественного определения токсина T-2.

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности и показателя правильности.