"МУК 4.1.3605-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение витамина B9 (фолиевой кислоты) в обогащенных пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.07.2020)

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения витамина B₉ (фолиевой кислоты) в обогащенной продукции: плодоовощной, хлебобулочной, молочной, мясной - в диапазоне 15 - 300 мкг/100 г продукта.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. Общепринятое название: фолиевая кислота.

Синонимы: витамин B₉, птероилглютаминовая кислота, фолат.

Эмпирическая формула: C₁₉H₁₉N₇O₆; молекулярная масса = 441,4; CAS N 59-30-3.

Физико-химические свойства: представляет собой мелкокристаллический порошок желтого цвета без запаха и вкуса, практически нерастворим в воде, 95%-м этиловом спирте и органических растворителях. Хорошо растворим в разбавленных растворах щелочей и кислот. На свету разлагается.

1.4. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Методика основана на определении витамина B₉ (фолиевой кислоты) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) на обращенной фазе со спектрофотометрическим детектором.

Нижний предел обнаружения витамина B₉ (фолиевой кислоты) составляет 0,25 мкг/мл анализируемого раствора.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций (по ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6)).

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности - по ГОСТ 12.1.004 и ГОСТ 12.1.018.

Требования электробезопасности при работе с приборами - по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

5.2. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы с данным оборудованием, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля точности измерений.

6.1. Отбор проб пищевой продукций проводят с учетом требований нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 85%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: подготовка измерительной аппаратуры, приготовление растворов, построение градуировочного графика, отбор и подготовка проб к анализу.

8.1.1. Приготовление раствора гидроокиси натрия с молярной концентрацией (NaOH) = 0,01 моль/дм³.

Взвешивают (0,40 +/- 0,01) г гидроокиси натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор годен при комнатной температуре в течение 1 месяца.

8.1.2. Приготовление раствора гидроокиси натрия с молярной концентрацией (NaOH) = 2 моль/дм³.

Взвешивают (80,00 +/- 0,01) г гидроокиси натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор годен при комнатной температуре в течение 2 месяцев.

8.1.3. Приготовление водного раствора соляной кислоты (HCl) = 0,1 моль/дм³.

Аликвоту 8,0 см³ концентрированной соляной кислоты плотностью 1,19 г/см³ помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Раствор годен при комнатной температуре в течение 2 месяцев.

8.1.4. Приготовление 15% водного раствора хлористого натрия (15% NaCl).

Взвешивают (15 +/- 0,01) г хлористого натрия, растворяют в 85 см³ дистиллированной воды. Раствор годен при комнатной температуре в течение 1 месяца.

8.1.5. Приготовление насыщенного раствора уксуснокислого натрия.

Взвешивают (100,0 +/- 0,01) г уксуснокислого натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор годен при комнатной температуре в течение 2 месяцев.

8.1.6. Приготовление раствора трихлоруксусной кислоты с массовой концентрацией 0,5 г/см³.

Взвешивают (50,0 +/- 0,01) г трихлоруксусной кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор годен при комнатной температуре в течение 2 месяцев.

8.2. Приготовление подвижной фазы.

Для приготовления подвижной фазы используют дистиллированную воду, pH которой доводится до значения (2,9 +/- 0,05) ед. соляной кислотой по п. 8.1.3, и ацетонитрил. Используется градиент подвижной фазы согласно табл. 4.

8.3. Приготовление градуировочных растворов.

8.3.1. Приготовление основного стандартного раствора фолиевой кислоты 2000 мкг/см³.

Готовят основной стандартный раствор фолиевой кислоты концентрацией 2000 мкг/см³, взвешивая (200 +/- 0,15) мг фолиевой кислоты и растворяя в мерной колбе на 100 см³ раствором 0,01 М NaOH. Полученный раствор можно хранить в холодильнике в течение 1 месяца.

8.3.2. Приготовление рабочего стандартного раствора фолиевой кислоты 200 мкг/см³.

Из основного стандартного раствора фолиевой кислоты готовят рабочий стандартный раствор фолиевой кислоты концентрацией 200 мкг/см³. Для этого отбирают 10 см³ основного стандартного раствора, переносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят раствором 0,01 М NaOH до метки. Полученный раствор можно хранить в холодильнике в течение 1 недели.

8.3.3. Приготовление градуировочных растворов фолиевой кислоты.

Градуировочные растворы фолиевой кислоты готовят по схеме, представленной в табл. 3. Аликвотные части рабочего стандартного раствора фолиевой кислоты переносят в мерные колбы объемом 100 см³ и доводят до метки 0,01 М NaOH. Градуировочные растворы используют в день приготовления.

8.4. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации фолиевой кислоты в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 градуировочным растворам фолиевой кислоты.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора N 1 - 5 и анализируют согласно п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

Устанавливают площади пиков фолиевой кислоты для каждого градуировочного раствора, на основании которых строят градуировочную зависимость.

8.5. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов для градуировки, содержание фолиевой кислоты в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,5 до 6,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемых для контроля градуировочных растворов сохраняется соотношение:

где X - концентрация фолиевой кислоты в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора фолиевой кислоты, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов фолиевой кислоты, предусмотренных п. 8.3.3. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 8.4.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

9.1. Пробоподготовка плодоовощной продукции и хлебобулочных изделий.

Измельченный образец массой 20 - 30 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³, добавляют 100 см³ экстрагирующего раствора (0,01 М раствор NaOH), тщательно перемешивают, затем встряхивают на перемешивающем устройстве при 150 - 200 об/мин в течение 60 мин. Содержимое конической колбы переносят количественно в мерную колбу объемом 250 см³ и доводят экстрагирующим раствором до метки. Полученный экстракт переносят в центрифужные стаканы объемом 50 см³. Стаканы устанавливают в лабораторную центрифугу для центрифугирования. Условия центрифугирования: скорость не менее 5000 об/мин, время - 20 мин. Надосадочную жидкость фильтруют сначала через бумажный фильтр "Синяя лента", а затем через шприцевой микрофильтр с размером пор 0,45 мкм. Полученный экстракт анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4.

9.2. Пробоподготовка молока и молочных продуктов.

Образец массой 40 - 60 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют ацетонитрил в количестве 40 см³, интенсивно перемешивают в течение 1 - 2 мин, затем доводят до метки ацетонитрилом. Пробе дают отстояться 15 - 20 мин, экстракт количественно переносят в центрифужные стаканы вместимостью 50 см³. Стаканы устанавливают в лабораторную центрифугу для центрифугирования. Условия центрифугирования: скорость не менее 5000 об/мин, время - 20 мин. Надосадочную жидкость фильтруют сначала через бумажный фильтр "Синяя лента", а затем через шприцевой микрофильтр с размером пор 0,45 мкм. Полученный экстракт анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4.

9.3. Пробоподготовка мясных изделий.

Измельченный образец массой 10 - 15 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³ и добавляют 150 см³ раствора соляной кислоты по п. 8.1.3. Колбу выдерживают на водяной кипящей бане в течение 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, добавляют 5 см³ насыщенного раствора натрия уксуснокислого и 5 см³ раствора трихлоруксусной кислоты 0,5 г/см³ (для осаждения белков и других посторонних примесей). Содержимое колбы фильтруют через фильтр "Синяя лента", фильтрат количественно переносят в мерную колбу объемом 250 см³ и доводят водой до метки. Отбирают 50 - 100 см³ фильтрата и доводят раствором NaOH (по п. 8.1.2) до pH = 5 - 6 (контроль по лакмусовой бумаге). Раствор пропускают через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм. Полученный экстракт анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- хроматографическая колонка, длиной 120 мм, внутренним диаметром 4,0 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C₁₈, зернение 5 мкм;

- длина волны поглощения 286 нм;

- подвижная фаза: ацетонитрил - вода с pH = 2,9 и градиентным элюированием в соответствии с программой (табл. 4 и 5);

- скорость потока элюента 0,5 мл/мин;

- объем вводимой пробы 20 мм³.

Ориентировочное время удерживания фолиевой кислоты 11 - 12 мин.

Подготовленную пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз.

Примечание. Допускается использование других хроматографических условий, обеспечивающих разделение компонентов в пробе и специфичность.

10.1. Расчет концентрации фолиевой кислоты (мкг/100 г продукта) проводится по формуле:

где C - концентрация фолиевой кислоты, найденная по градуировочному графику, мкг/см³;

V₁ - общий объем экстракта, см³ (250);

m - масса навески, г;

100 - расчет на 100 г продукта.

11.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мкг/100 г;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мкг/100 г;

- граница абсолютной погрешности, мкг/100 г:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

1. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

2. ГОСТ 12.1.005 "Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

3. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

4. ГОСТ 12.1.010 "Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования".

5. ГОСТ 12.1.018 "Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

6. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

7. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

8. ГОСТ 12.4.021 "Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования".

9. ГОСТ OIML R 76-1 "Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

10. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

11. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

12. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

13. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

14. ГОСТ 3118 "Реактивы. Кислота соляная. Технические условия".

15. ГОСТ 4328 "Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия".

16. ГОСТ 199 "Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия".

17. ГОСТ 28498 "Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний".

18. ГОСТ 29169 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой".